Die Rolle des neuentwickelten pYD-Vectors bei der Entwicklung eines Selektionssystems zum Screening von cDNA Bibliotheken auf sezernierte Proteine und Membranproteine

Gesamtdissertation
Einleitung: Ziel dieser Arbeit ist die Rolle des pYD-Vektors bei der Entwicklung eines Selektionssystems zum Screening von cDNA Bibliotheken auf sezernierte Proteine und Membranproteine darzustellen. Die Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Systems sollte mit einer humanen Endothelzellbibliothek durchgeführt werden. Gleichzeitig sollten neue Moleküle, die Kontrollfunktion in der Angiogenese ausüben, identifiziert und charakterisiert werden. Der Sekretionsweg durch die Zellmembran wird für die meisten bekannten Proteine über eine aminoterminale Sequenz, bekannt als Signalpeptid, vermittelt. Methode: Hierzu wurde der Selektionsplasmid pYD entwickelt. Als Ausgangspunkt für die Vektorkonstruktion wurde der E.coli/-Hefe Shuttlevektor pYEUra3 benutzt. In diesem Plasmid wurde das Hefegen suc2 (Invertase-Gen) kloniert. Im Invertase-Gen wurden zuvor Startcodon und Signalpeptid deletiert und eine neue, einmalige Restriktionsstelle NotI an Stelle des Startcodons geschaffen. Um die Funktionsfähigkeit des Plasmids nachzuweisen, wurde eine cDNA-Bibliothek aus Endothelzellen in die NotI Schnittstelle des pYD Plasmids kloniert und mittels in vivo Exzision des Bakteriophagen eine Plasmidbibliothek hergestellt. Nach der Hefetransformation und Isolierung des Plasmids aus den gewachsenen Klonen, wurde das inserierte cDNA Fragment isoliert und sequenziert. Ergebnisse: Dabei wurden bekannte und unbekannte Klone identifiziert. Mit diesem Verfahren wurden jeweils drei Mäuse Embryonen Bibliotheken konstruiert, analysiert und mit der hmEC Bibliothek verglichen. Das Hefe-Selektionsverfahren hat sich grundsätzlich als effizient erwiesen, systematisch nach sezernierten Proteinen zu suchen, die eine Signalpeptidsequenz aufweisen können. Der Vorteil dieses Selektionsverfahrens liegt in der Handhabung und in der einfachen, effektiven Selektion ohne Anwendung hochkomplizierter, zeitintensiver Anwendung von immunologischen Verfahren. Diskussion: In vitro kultivierte humane Endothelzellen spiegeln jedoch nicht die Komplexität der Expression wieder, die man für diesen Screen erwarten würde. Im Vergleich zu den etablierten Methoden bietet das Hefe Invertase System keine überragenden Vorteile. Es wurden keine Moleküle entdeckt, die eine Rolle in der Angiogenese spielen könnten. Daher muss eine Schlussfolgerung gezogen werden, dass dieser Screen ungeeignet ist, um nach neuen angiogenetischen Molekülen zu suchen.
Introduction: The purpose of this work is to be represented the role of the pYD vector in the yeast invertase screening system for isolating secreted proteins and membrane proteins. The examination of the sensitivity and specificity of the system should be accomplished with a human microvascular endothelial cell library. At the same time new molecules, which play a function in the angiogenesis, should be found. Receptors, membrane proteins, and secreted proteins, are of considerable interest for understanding cell signalling. A system identification of genes encoding these proteins has not been possible. Signal peptides are a unique feature of secreted proteins and membrane proteins. Methods: Secreted invertase, coded for by the suc gene, is essential for wild type yeast to metabolize sucrose. A yeast/E.coli phagemid vector(pYD) containing a secretion deficient suc gene was constructed. Suc(-)yeast strains will not grow on sucrose agar. Invertase is inactive without signal peptide. Mammalian signal peptides are functional in yeast. Thus, a cDNA coding for a signal peptide, intoduced 5´ of the suc gene can complement for invertase activity. Random primed cDNA libraries are directionally ligated into restriction sites located 5´ of the suc gene. The library is then introduced into an invertase deficient yeast strain and plated on dissacharide agar. Results: Mouese embyonic and human microvascular endothelial cells (hmEC) were used to generate cDNA library. Selective growth occurs for clones containing functional signal peptides, expressed as invertase fusion proteins. False positives are evoked by rRNA and antisense clones.Changes in transcriptional activity of genes, as observed under culture conditions, lead to misrepresentation. Sequence information obtained allows for classification. New genes or est homologues with an interesting expression pattern will be selected for further analysis, including full length cloning and targeted mutation in mice. Discussion: The advantage of this selection system is in the handling and effective selection without application of high- complicated, time-intensive use of immunological procedures.The yeast invertase screening system is en efficient and powerful system to isolate genes for proteins containing signal sequencees from mammalian cDNA libraries. Anaylysis of hmEC has not yieled an endothelial cell specific gene yet. In vitro cultured hmEC did not expose complexity of expression which is desirable for screening. Therefore a conclusion must be drawn that this screen is unsuitable, in order to look for new angiogenic molecules.