Quantitative spectrofluorometric assay detecting nuclear condensation and fragmentation in intact cells

At present, nuclear condensation and fragmentation have been estimated also using Hoechst probes in fluorescence microscopy and flow cytometry. However, none of the methods used the Hoechst probes for quantitative spectrofluorometric assessment. Therefore, the aim of the present study was to develop a spectrofluorometric assay for detection of nuclear condensation and fragmentation in the intact cells. We used human hepatoma HepG2 and renal HK-2 cells cultured in 96-well plates treated with potent apoptotic inducers (i.e. cisplatin, staurosporine, camptothecin) for 6-48 h. Afterwards, the cells were incubated with Hoechst 33258 (2 mu g/mL) and the increase of fluorescence after binding of the dye to DNA was measured. The developed spectrofluorometric assay was capable to detect nuclear changes caused by all tested apoptotic inducers. Then, we compared the outcomes of the spectrofluorometric assay with other methods detecting cell impairment and apoptosis (i.e. WST-1 and glutathione tests, TUNEL, DNA ladder, caspase activity, PARP-1 and JNKs expressions). We found that our developed spectrofluorometric assay provided results of the same sensitivity as the TUNEL assay but with the advantages of being fast processing, low-cost and a high throughput. Because nuclear condensation and fragmentation can be typical markers of cell death, especially in apoptosis, we suppose that the spectrofluorometric assay could become a routinely used method for characterizing cell death processes. V současné době se k detekci jaderné kondenzace a fragmentace využívají fluorescenční sondy Hoechst. Žádná z metod však nepoužívá sondy Hoechst pro kvantitativní spektrofluorometrické hodnocení. Cílem této studie bylo vyvinout spektrofluorometrický test pro detekci jaderné kondenzace a fragmentace v intaktních buňkách. Použili jsme buňky lidského hepatomu HepG2 a renální HK-2 buňky kultivované v 96-jamkových inkubovanými s apoptotickými induktory (tj. cisplatinou, staurosporinem, kamptotecinem) po dobu 6-48 hodin. Poté byly buňky inkubovány s Hoechst 33258 (2 ug/ml) a bylo detekováno zvýšení intenzity fluorescence po navázání barviva na DNA. Vyvinutý spektrofluorometrický test byl schopen detekovat jaderné změny způsobené všemi testovanými apoptotickými induktory. Poté jsme výsledky spektrofluorometrického testu porovnali s dalšími metodami detekujícími poškození buněk a apoptózu (tj. testy WST-1 a glutathionu, TUNEL, DNA ladder, aktivita kaspázy, exprese PARP-1 a JNKs). Zjistili jsme, že náš vyvinutý spektrofluorometrický test poskytuje výsledky se stejnou citlivostí jako test TUNEL, ale s výhodami rychlého zpracování, nízkých nákladů a vysokého výkonu. Protože jaderná kondenzace a fragmentace mohou být typickými markery buněčné smrti, zejména při apoptóze, předpokládáme, že spektrofluorometrický test by se mohl stát rutinně používanou metodou pro charakterizaci procesů buněčné smrti.