The effect of irradiation on the Eph family of receptor tyrosine kinases in lung adenocarcinoma

Das Lungenkarzinom ist weltweit die am häufigsten zum Tode führende Krebserkrankung in der westlichen Welt und hat nach wie vor eine sehr schlechte Prognose trotz moderner Fortschritte in Diagnostik und Therapie. Die angiogenetischen Prozesse sind für das lokale Wachstum und die systemische Metastasierung von Tumoren von essentieller Bedeutung. Angiogenetische Endothelzellen unterscheiden sich von ruhenden Endothelzellen durch die Expression einiger Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche wie die Eph Familie. Die Interaktion zwischen Eph-Rezeptoren und ephrin-Liganden, die in den Endothelzellen und zugehörigen Geweben exprimiert sind, hat großen Einfluss auf die Neubildung der Blut- und Lymphgefäße in embryonaler Entwicklung. Sowohl die Eph-Rezeptoren als auch die ephrin-Liganden sind häufig in verschiedenen bösartigen Tumoren dysreguliert und spielen eine wichtige Rolle in der Angiogenese und Metastasierung der Tumore. Jedoch bleibt der Einfluss ionisierender Strahlung auf die Eph-Familie von RTKs ungeklärt. Die Response der Tumorgewebe auf ionisierende Strahlung ist hoch abhängig von der Tumorumgebung. Die Mechanismen der Wirkung ionisierender Strahlung auf Tumorendothelzellen und die induzierte Interaktion zwischen Tumorzellen und Tumorumgebung sind bisher wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Wirkung ionisierender Strahlung auf die Eph-Familie in der Lungenkarzinomzelle A549 und Endothelzellen in vitro und in vivo zu analysieren. Außerdem soll die funktionelle Interaktion zwischen Tumorzellen und Endothelzellen, besonders die Rolle der Eph-Familie in der Tumor-Umgebung-Kommunikation auf ionisierende Strahlung untersucht werden. Eine Blockade des angiogenetischen Prozesses oder ein gezieltes Töten von angiogenetischen Zellen ist eine potenziell vielversprechende Krebstherapie. Das Hauptziel der Arbeit ist, die Mechanismen und die Wirkung der Kombination von neuen Eph Inhibitor und ionisierender Strahlung bei Krebstherapie zu erläutern. In der vorliegenden Arbeit wird ein kritischer Überblick über klinische und biologische Aspekte der angiogenetischen Faktoren bzw. die Biologie der Eph/ephrin Familie beim Lungenkarzinom dargestellt. Des weiteren wurden in dieser Arbeit die Mechanismen der Eph Familie in funktioneller Interaktion zwischen Tumor- und Endothelzellen untersucht. Die experimentellen Ergebnisse könnten darauf hinweisen, dass ionisierende Strahlung mit der angewendeten Dosis die Expression unterschiedlicher Mitglieder von Eph/ephrin in Tumorzellen induziert und damit die Tumorangiogenese stimuliert werden konnte. Dabei konnte eine transkriptionelle Aktivierung von EphA2 und seinem Liganden ephrinA1, aber nicht EphB4/ephrinB2 in Lungenadenokarzinomzellen in vitro gezeigt werden, während die analysierten Faktoren bei bestrahlten Endothelzellen nicht induziert werden konnten. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Untersuchungen wurde eine stärkere Membranfärbung der EphA2 in bestrahlten Xenontransplantaten von Lungentumorzelle A549 gefunden. Immunohistochemische Analysen zeigten stärkere Expression der EphA2 und ephrinA1 in bestrahlten A549-Xenotransplantaten im Vergleich mit den nicht bestrahlten Geweben. Weiterhin wurde mit Hilfe des WTT-Assay festgestellt, dass die Inhibition der EphA2 durch lösbare EphA2-Fc Rezeptorchimäre keine Wirkung auf Viabilität der Lungenadenokarzinomzellen in vitro nach ionisierender Strahlung hat. Im Gegenteil konnte erhöhte Migration der Endothelzellen in Kokultivierung mit bestrahlten A549-Zellen in vitro festgestellt werden. Eine Blockade des EphA2-Rezeptors könnte die Tumor-induzierte Migration der Endothelzellen signifikant vermindern. Die vorliegende Arbeit zeigte erstmals die mögliche Beteiligung verschiedener Mitglieder von Eph/ephrin an der induzierten Tumorangiogenese durch ionisierende Strahlung sowohl in vitro als auch in vivo. Die vorliegenden Daten könnten auf einen neuen Mechanismus hinweisen, dass die Tumorzellen wahrscheinlich ihr vaskuläres System vor der zytotoxischen Wirkung ionisierender Strahlung schützen können, um so durch die Verwendung der EphA2-Inhibitoren in Kombination mit Strahlentherapie die Behandlung des Lungenadenokarzinoms zu rationalisieren.
Lung cancer is the most lethal form of malignancy and prognosis remains poor despite recent advances in diagnostic and therapeutic modalities. The phenomenon of new blood vessel formation in tumors is one of the key events in lung cancer pathogenesis and metastasis. During embryonic development and angiogenesis, there is an impressive interplay between Eph receptors and Ephrin ligands expressed in EC and associated tissues that greatly affect the structure of new blood and lymphatic vessels. The Eph family of receptor tyrosine kinases (RTKs) and their ligands, ephrins, are dysregulated in different malignancies and play an important role in tumor blood vessel formation, remodelling and metastasis. The response of tumor to ionizing radiation (IR) is highly-dependent on tumor microenvironment and involves a series of complex biological interactions between tumor and vascular compartment. However, the influence of IR on the Eph family of RTKs remains unknown. During the last decades, radiobiological research has focused primarily on the cancer cell compartment. Indeed, much less is known about the effect of ionizing radiation on the endothelial cell (EC) compartment and the complex interaction between tumor cells and their microenvironment, consisting of extracellular matrix and ECs. In the present study, the effect of IR on the key members of the Eph family of RTKs in both A549 and Ecs was analysed both in vitro and in vivo. Moreover, the way the two-compartment system, consisting of tumor and ECs, intercommunicates in response to IR and the impact of Eph on this interaction was analysed. The primary aim of this study was to elucidate the mechanisms of the combination of novel antiangiogenic agents, such as Eph-blocking agents, and IR for effective treatment of lung cancer. In this thesis, a critical review of angiogenesis and the biology of Eph and Ephrins was performed. Furthermore, the interrelation between IR and Eph family of RTKs was investigated. The experimental results suggested that IR can transmit a proangiogenic stimulus to tumor associated vascular compartment through inducing different members of Eph/ephrins in tumor cells. IR promoted transcriptional activation of EphA2 and its ligand ephrinA1 but not EphB4/ephrinB2 in lung adenocarcinoma cells in vitro, while none of these members analysed was induced in irradiated ECs. Immunofluorescence detection of EphA2 revealed astronger membranous staining in irradiated lung adenocarcinoma xenografts. Immunohistochemical studies revealed in irradiated A549 xenografts revealed stronger expression for EphA2 and ephrinA1, as compared to unirradiated tissues. Furthermore, no difference was observed in the viability of lung adenocarcinoma cells in vitro after IR and EphA2 blockade using a soluble EphA2-Fc receptor chimera as analysed by an WST assay. IR of lung adenocarcinoma cells and immediate co-culture with ECs increased endothelial cell migration in vitro. EphA2 blockade significantly suppressed irradiated tumor-induced endothelial cell migration in vitro. This is the first demonstration to show the involvement of different members of the Eph/Ephrins in IR induced tumor angiogenesis both in vitro and in vivo. These data propose a new mechanism that tumor cells probably use to protect their vascular compartment from the cytotoxic effect of IR and rationalise the use of EphA2 inhibitors in combination with radiation therapy for the treatment of lung adenocarcinoma.