Increase in the transgene translation rate in CHO cells

Biopharmazeutika werden zur Therapie einer Vielzahl von schwerwiegenden Krankheiten wie Krebs und Autoimmunerkrankungen verwendet. Sie zeichnen sich insbesondere in der Onkologie durch eine im Vergleich zu chemischen Medikamenten deutlich höhere Spezifität und ein reduzierteres Nebenwirkungsspektrum aus. Die Hauptgruppe der Biopharmazeutika sind heutzutage monoklonale Antikörper, die hauptsächlich in CHO-Zellen hergestellt werden. Denn CHO-Zellen besitzen gegenüber anderen Expressionssystemen. einige entscheidende Vorteile für die biopharmazeutische Produktion. Ein stetig wachsender Markt und die steigende Nachfrage zwingen die biopharmazeutische Industrie Zelllinien schneller zu entwickeln und höhere Titer zu erreichen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Herangehensweisen verwendet, um die Entwicklung einer CHO-Produktionszelllinie zu optimieren. Es konnte am Beispiel von Antikörpern gezeigt werden, dass die genetische Konfiguration der CHO-Hostzelle einen Einfluss sowohl auf den Titer, als auch auf den Zeitbedarf für die Zelllinienentwicklung hat. Dazu wurden verschiedene molekulare Werkzeuge verwendet, mit denen die Ausbeuten eines full size IgG und eines Antikörperfragments gesteigert werden konnten. Dabei wurden verschiedene Engpässe umgangen, die während der Proteinbiosynthese innerhalb der Zelle auftreten und so die Produktion gesteigert: a) Durch die Optimierung der Transkription mit Hilfe von Signalpeptiden konnte die Quantität des full size Antikörpers um mehr als das Doppelte gesteigert werden. b) Durch den Einsatz eines UCOEs, einem Chromatin modifizierenden Element, das die Zugänglichkeit des Gens für die Transkription verbessert, konnte die Quantität des Antikörperfragments um das 0,7-fache gegenüber einer Referenz ohne UCOE erhöht werden. c) Durch die Überexpression eines Gens, das die Sekretion verbessert, konnte die Quantität des Antikörperfragments um das Vierfache gesteigert werden. Neben der Produktionssteigerung wurde auch die Methodik der Zelllinienentwicklung optimiert. So konnte gezeigt werden, dass ein Screening auf der Ebene von „Minipools“ deutlich mehr Hochproduzenten hervorbrachte, die eine höhere Quantität des full size Antikörpers vorwiesen, als ein einziger „Largepool“. Der Aufwand für das multiparallele Screening auf Hochproduzenten wurde durch die Etablierung eines MicroFlask Systems, mit dem bis zu 24 Pools parallel in kleinem Volumen in einer Platte kultiviert werden können, signifikant verringert. Ein Vergleich zwischen einem klassischen Fed-Batch mit einem vereinfachten Simple-Fed-Batch, bei dem eine Glukoselösung als einzige Nährstoffzugabe hinzugefügt wurde, zeigte, dass mit weniger Aufwand schneller vergleichbare Ergebnisse erzielt werden können.
Biopharmaceuticals are used for the treatment of a variety of serious diseases such as cancer and autoimmune diseases. In oncology in particular, they are characterized by significantly higher specificity and reduced side effects compared to chemical drugs. The main group of biopharmaceuticals today are monoclonal antibodies, which are mainly produced in CHO cells. These cells possess some key advantages over other expression systems. For biopharmaceutical production a steadily growing market and increasing demand are forcing the biopharmaceutical industry to develop cell lines faster and achieve higher titres. In this work, different approaches were used to optimize the development of a CHO production cell line. It was shown for antibodies that the genetic configuration of the CHO host cell has an impact on both the titre and the time need for cell line development. For this purpose, different molecular tools were used to increase the yields of a full size IgG and an antibody fragment. Several bottlenecks that occur during protein biosynthesis within the cell were bypassed to increase production: a) By optimizing transcription using signal peptides, the quantity of a full size antibody was increased more than twofold. b) Using a UCOE, a chromatin modifying element that improves the accessibility of the gene for transcription, increased the quantity of the antibody fragment by 0.7-fold compared to a reference without a UCOE. c) Overexpression of a gene that enhances secretion increased the quantity of antibody fragment fourfold. In addition to the increase in production, the methodology of cell line development was also optimized. It was shown that screening at the level of "minipools" yielded significantly more high producers, which had a higher quantity of the full size antibody, than a single "largepool". The effort required for multiparallel screening for high producers was significantly reduced by establishing a MicroFlask system that allows up to 24 pools to be cultured in parallel in small volume in one plate. A comparison between a classical fed-batch with a simplified simple fed-batch, where only a glucose solution serves as nutrition add-on, showed that comparable results can be achieved faster with less effort.