Structural rearrangements upon opening of Channelrhodopsin-2

1 INTRODUCTION 1 1.1 CHANNELRHODOPSIN 2 2 1.1.1 The photocycle intermediates 3 1.1.2 The Channel Activity – Electrophysiological Measurements 5 1.1.3 Structural determinants of pore opening 6 1.2 THE AIMS OF THIS THESIS 8 2 MATERIAL AND METHODS 9 2.1 MATERIAL 9 2.1.1 Chemicals 9 2.1.2 Plasmids 10 2.1.3 Strains 10 2.1.4 Buffers 11 2.1.5 Media 12 2.1.6 Equipment 13 2.2 BIOCHEMICAL METHODS 14 2.2.1 Pichia pastoris/pPIC9K expression system 14 2.2.1.1 Mutation of the recombinant ChR2 DNA constructs 16 2.2.1.2 Transformation of Pichia pastoris with pPIC9k-ChR2 constructs and selection of multicopy clones 19 2.2.1.3 Expression of ChR2 in Pichia pastoris 21 2.2.1.4 ChR2 purification 22 2.2.2 Labeling 24 2.2.2.1 Spin labeling with MTSL 24 2.2.3 Nanodisc reconstitution 24 2.2.3.1 Expression and purification of MSP1D1in E. coli 24 2.2.3.2 Reconstitution of ChR2 in DMPC nanodiscs 25 2.3 BIOPHYSICAL METHODS 26 2.3.1 Spectroscopic methods 26 2.3.1.1 Optical spectroscopy 26 2.3.1.2 Resonance spectroscopy 30 2.3.1.3 Spin labeling efficiency 39 2.3.2 Electrophysiological measurements 40 3 RESULTS 41 3.1 GENETIC ENGINEERING: DESIGNING CYSTEINE-REDUCED VARIANTS 41 3.2 ION CONDUCTANCE OF THE CYSTEINE-REDUCED VARIANTS 47 3.3 CYSTEINE-REDUCED VARIANTS IN DETERGENT ENVIRONMENT 50 3.3.1 Photostability 50 3.3.2 Accumulation of the open channel (P3530) 51 3.3.3 Helical movements 56 3.4 CYSTEINE-REDUCED VARIANTS IN MEMBRANE ENVIRONMENT 58 3.4.1 Nanodisc Reconstitution 58 3.4.1.1 Optimization of the reconstitution procedure 60 3.4.1.2 Optimization of ChR2 reconstitution 62 3.4.1.3 ChR2 nanodiscs characterization 66 3.4.2 Photostability 69 3.4.3 Accumulation of the open channel (P3530) 70 3.4.4 Helical movements upon channel opening 77 3.4.4.1 Helix B movements 77 3.4.4.2 Helix F movements 83 3.4.4.3 Tracing distances beyond helix B and F: Introducing additional cysteines 86 3.5 THE Y196F VARIANT: LOCALIZING A DANGLING WATER 89 3.5.1 Results 90 3.6 THE T159C VARIANT: A FUNCTIONAL VARIANT WITH IMPROVED EXPRESSION 96 3.6.1 Results 97 4 DISCUSSION 100 4.1 NEW CYSTEINE-REDUCED VARIANTS FOR SIDE DIRECTED SPIN LABELING 100 4.1.1.1 Functionality in detergent environment 100 4.1.1.2 Membrane environment 102 4.1.1.3 Cysteine functionality 103 4.2 HELICAL MOVEMENTS 106 5 CONCLUSION 112 6 OUTLOOK 113 REFERENCES 116 ACKNOWLEDGEMENTS 124 APPENDIX 125 ABSTRACT 125 KURZZUSAMMENFASSUNG 126 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 127 CURRICULUM VITAE 128 LIST OF TABLES 130 LIST OF FIGURES 133 LIST OF ABBREVIATIONS 142
Channelrhodopsins (ChRs) are ion channels that regulate phototaxis of green algae. The functional unit comprises a retinal chromophore embedded in seven transmembrane helices (7TM). Up to now, ChRs are the only light gated ion channels found in nature. After the discovery in 2002 the ChRs were soon exploited as a tool to trigger nerve cell action potentials. A new field of research, named optogenetics, was established. Since ChRs undergo a cyclic reaction triggered by light they can be investigated by a large set of different biophysical techniques and hence are ideal candidates to study the structure/function relationship on molecular level. In this work three functional ChR2 cysteine-variants were engineered to enable the site specific labeling of the cytosolic end of helix B and additionally helix F or C. The labeling positions can be investigated in the ground state as well as in the accumulated open state, P3. The variants were spin-labeled and subjected to pulsed electron double resonance (PELDOR) measurements. Thereby, an outward displacement of the cytosolic side of helix B and F in the open state could be observed. The helix B displacement persist also in the desensitized state, P4. These results strengthen the hypothesis of a prolongation of the pore between helices A, B, C and G by the observed outward movement of helix B in the open state. However, as suggested earlier, the major structural changes are to some extent decoupled from the on-gating, since the outward displacement of helix B persists in the desensitized state. Furthermore, we set the stage for the quantitative determination of the helix F movement, which is currently underway. The results of this thesis will help to guide the developments and benchmark future open state models.
Kanalrhodopsine (KR) sind Ionenkanäle, die die Phototaxis von Grünalgen steuern. Die funktionale Einheit umfasst ein Retinal-Chromophor, das in sieben Transmembranhelices eingebettet ist. Kanalrhodopsine sind die einzigen, natürlichen, lichtgesteuerten Ionenkanäle, die bisher entdeckt wurden. Nach ihrer Entdeckung 2002 wurde bald erkannt, dass mit ihnen Aktionspotentiale in Nervenzellen durch Licht ausgelöst werden können. Da KR eine zyklische Reaktion durchlaufen, die nichtinvasiv durch Licht ausgelöst wird und größere strukturelle Veränderungen umfasst, eignen sie sich ideal um an ihnen Struktur-Funktions-Zusammenhänge biophysikalisch zu ergründen. In dieser Arbeit wurden drei aktive KR-Cysteinvarianten hergestellt, die spezifisch an dem zytosolischen Ende der Helix B und zusätzlich an Helix C oder F markiert werden können. Die markierten Positionen können im Grundzustand oder im akkumulierten offenen Zustand, P3, untersucht werden. Die KR-Varianten wurden spinmarkiert und in gepulsten Elektronendoppelresonanzmessungen untersucht. Die Messungen belegen eine Auswärtsbewegung der zytosolischen Seite von Helix B und F im offenen Zustand. Auch im desensitivierten Zustand, P4, bleibt Helix B nach außen versetzt. Die Ergebnisse untermauern die Hypothese einer Tunnelöffnung zwischen den Helices A, B, C und G. Gleichzeitig deuten die Resultate darauf hin, dass die großen Konformationsänderungen, wie bereits vermutet, zu einem gewissen Grad von der Tunnelöffnung entkoppelt sind, da Helix B auch im desensitivierten Zustand nach außen versetzt bleibt. Weiterhin wurde die Grundlage für eine quantitative Bestimmung der Helix F Bewegung bereitet, welche ein weiterhin laufendes Projekt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden helfen Modelle des offenen Kanals zu entwickeln und zu beurteilen.