Identification and characterisation of genes involved in cognitive function

Title Page and Table of Contents 1\. Introduction 4 2\. Materials and Methods 18 3\. Results 36 4\. Discussion 70 5\. Summary 89 6\. Zusammenfassung 91 7\. Outlook 93 References 95 Abbreviations 105 List of Figures 108 List of Tables 109 Acknowledgements 110 Publications 113
In this study we have characterised the chromosome breakpoints in five patients with mental disabilities and associated balanced translocations, with the aim of identifying both X-chromosomal and autosomal genes critical for cognitive function. In light of the established link between mental disability and X-chromosomal genes, together with the practical advantages of studies that involve the X chromosome, we first focussed on patients with X;autosome translocations. In two out of three patients, molecular analyses provided no evidence for disease-causing gene disruptions on the X chromosome. In Patient 3, however, with a severe phenotype, the zinc finger gene ZNF41 was disrupted, and full-length transcripts could not be detected in the patient cell line, suggesting an absence of functional ZNF41 protein. Studies on unrelated families with X-linked mental retardation (XLMR) led to the identification of two novel nucleotide exchanges in the ZNF41 gene that likely play a role in the disease, based on their absence in 400 X chromosomes from controls. One of these mutations results in a proline to leucine amino acid exchange (P111L); the second is an intronic mutation (479-42A>C) that affects a consensus splice-site and results in loss of transcription of specific ZNF41 splice variants in the patient cell line. Both of these point mutations are associated with mild MR. The ZNF41 gene is expressed in multiple tissues, including both foetal and adult brain, and it has been implicated in transcriptional repression. Other ubiquitously expressed genes, namely the methyl CpG binding protein encoded by MECP2 and the helicase-encoding ATRX, have also been implicated in both mental retardation and regulation of transcription. Although it is not yet understood how mutations in these three genes exert brain-specific effects, it is conceivable that in neurons, their functions converge on a common critical pathway. In light of our results, ZNF41 is an especially strong novel candidate for XLMR. Rearrangements in two additional patients with severe cognitive disabilities and associated autosome translocations were also investigated as part of this study. Molecular cytogenetic analyses indicated the presence of well-characterised candidate genes in the vicinity of the breakpoints for both cases: in Patient 4, the brain-specific forkhead transcription factor FOXG1B, and in Patient 5, the predominantly CNS-expressed c-Jun terminal kinase gene JNK3. More precise localisation of the relevant breakpoints indicated that FOXG1B was not disrupted; JNK3, however, was interrupted within the coding sequence. For this reason, further studies focussed on JNK3. JNK3 plays an established role in neuronal apoptosis, and it has recently been shown to directly influence neuronal differentiation. The breakpoint results in translation of a truncated JNK3 protein, which could be detected by western blot in the patient cell line. Over-expression of this mutant protein in various cell lines, including HeLa and Neuro2A, led to protein aggregation, whereas over-expressed wild type JNK3 exhibited diffuse localisation, suggesting that the mutant plays an aberrant role in patient cells. We speculate that the severe neurological phenotype observed in Patient 5 results from a partial loss of JNK3 function in neurite outgrowth, together with a dominant effect on normal GTPase- mediated signalling through JNK3, which could result in modified regulation of neuronal apoptosis. This provides a plausible explanation for the severe phenotype observed in the patient. Taken together, our results affirm that making use of disease-associated balanced translocations remains an efficient approach for identifying candidate disease genes. In studying five patients, we have uncovered two promising candidate genes for mental retardation, and through both in silico and molecular studies have obtained further evidence for their respective roles in cognition. Moreover, our data support the recent hypothesis that both precise control of chromatin remodelling and fine regulation of GTPase-mediated signalling are essential for normal development and function of the brain.
In der vorliegenden Arbeit wurden die chromosomalen Bruchpunkte bei fünf mental retardierten Patienten und einer balancierten Translokation untersucht, um sowohl X-chromosomale als auch autosomale Gene zu finden, die für kognitive Funktionen bedeutsam sein könnten. Basierend auf dem bereits bekannten Zusammenhang zwischen X-chromosomalen Genen und mentaler Retardierung und den praktischen Vorteilen von Untersuchungen am X-Chromosom wurden zunächst drei Patientinnen mit einer X;Autosom-Translokation untersucht. Die molekulare Charakterisierung ergab für zwei dieser drei Patientinnen keinerlei Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen mentaler Retardierung und dem X-chromosomalen Bruchpunkt. Hingegen konnte in der dritten Patientin, die den ausgeprägtesten Phänotyp aufweist, eine Unterbrechung des Zink-Finger 41 (ZNF41) Gens nachgewiesen werden. Diese Unterbrechung hatte zur Folge, dass ein vollständiges Transkript des ZNF41 Gens in einer Zelllinie der Patientin nicht nachweisbar war, welches nahelegt, dass ein funktionelles ZNF41 Protein ebenfalls fehlt. Die Analyse von ZNF41 in nicht verwandten Familien mit X-chromosomal vererbter mentaler Retardierung (XLMR) führte zur Identifizierung von zwei Basenaustauschen, welche sehr wahrscheinlich krankheitsrelevant sind, da sie in 400 Kontrollchromosomen nicht gefunden werden konnten. Eine der Mutationen verursacht den Austausch eines Prolins durch ein Leucin (P111L) im ZNF41 Protein. Die andere Mutation befindet sich am Exon-Intron-Übergang und beeinträchtigt eine konservierte Spleissstelle (479-42A>C). Hieraus resultiert der Verlust einer spezifischen Spleissvariante von ZNF41 in der Zelllinie des Patienten. Beide Mutationen führten zu einer vergleichsweise milden mentalen Retardierung. Das ZNF41 Gen wird in vielen Geweben exprimiert, inklusive im fötalen und adulten Hirn, und ist an der molekularen Repression der Transkription beteiligt. Ein derartiger Zusammenhang zwischen mentaler Retardierung und Transkriptionsregulation wurde bereits für andere ubiquitär exprimierte Gene gezeigt, wie z.B. für das Methyl-CpG-bindende Protein 2 Gen MECP2, oder für das Helicase-kodierende Gen ATRX. Zusammen mit diesen Daten erscheint das ZNF41 Gen als besonders relevanter, neuer Kandidat für die genetische Grundlage der mentalen Retardierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ebenfalls zwei Patienten mit schwerer mentaler Retardierung und einer autosomalen Translokation untersucht. Die molekular cytogenetischen Untersuchungen zeigten zunächst, dass bei beiden Patienten ein bereits detailliert charakterisiertes Kandidatengen im Bruchpunktbereich vorliegt: bei einer Patientin das hirnspezifisch exprimierte Forkhead-Transkriptionsfaktor FOXG1B Gen, bei dem anderen Patienten das überwiegend im Gehirn exprimierte C-Jun-N-terminale Kinase 3 (JNK3) Gen. Eine genauere, sequenzbasierte Analyse dieser beiden Bruchstellen ergab, dass das FOXG1B-Gen intakt vorlag, während das JNK3-Gen direkt unterbrochen war. Alle weiteren Untersuchungen konzentrierten sich daher auf JNK3. JNK3 spielt eine bekannte Rolle in der Regulation der neuronalen Apoptose, und wurde kürzlich mit einem direkten Einfluss auf die Differenzierung neuronaler Strukturen in Zusammenhang gebracht. Der Bruchpunkt im JNK3 Gen führt zu der Expression eines trunkierten JNK3 Proteins in der lymphoblastoiden Zelllinie des Patienten. Die Überexpression einer derartigen JNK3 Mutante in verschiedenen Zelllinien, einschliesslich HeLa and Neuro2A, zeigte eine Aggregation des trunkierten Proteins, während die Kontroll-Überexpression eines Wildtyp- JNK3-Proteins dieses Verhalten nicht aufzeigte. Zusammengenommen lässt dies annehmen, dass die Expression eines trunkierten JNK3 Proteins im Menschen zu einer aberranten, intrazellulären Aggregation dieses Proteins führt. Dies lässt vermuten, dass der ausgeprägte neurologische Phänotyp des Patienten aus einem partiellen JNK3 Funktionsverlust beim Neuritenwachstum und einem dominanten Effekt des trunkierten JNK3 Proteins auf die normale GTPase- vermittelte Signalübertragung resultiert. Dieser Mechanismus stellt eine plausible Erklärung für den beobachteten, schweren Phänotyp des Patienten dar. Zusammengefasst legen die vorgenannten Daten nahe, dass die Analyse von krankheitsassoziierten balancierten Translokationen einen effizienten Ansatz darstellen, Kandidatengene zu identifizieren. Durch die Untersuchung von fünf Indexpatienten konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei neue Kandidatengene für die mentale Retardierung gefunden werden. Die mögliche Bedeutung dieser Gene wurde durch mutationsanalytische und molekularbiologische Methoden untermauert. Drittens unterstützen die Ergebnisse die kürzlich aufgestellten Hypothesen, dass sowohl die Kontrolle des Chromatinumbaus, als auch die Feinregulation der GTPase-vermittelten Signalübertragung eine essentielle Rolle in der normalen Entwicklung und Funktion des menschlichen Gehirns spielen.