Regulación transcripcional de cyba (p22 phox ), inducida por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) acoplado a su receptor c - Met en hepatocitos de ratón

La señalización mediada por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y su receptor c - Met está implicada en el control de estado redox celular y el estrés oxidante, en particular a través de su capacidad para inducir la expresión de genes hepatoprotector es mediante la activación de las vías de supervivencia en el hepatocito. Recientemente, nuestro grupo de trabajo ha reportado que el HGF regula la expresión de subunidades que forman parte del complejo multiproteico de la enzima NADPH oxidasa en hepatocitos de ratón, especialmente las subunidades catalíticas Nox2 y Nox4 y la reguladora p22 phox. En el presente trabajo nos centramos en investigar el mecanismo mediado por HGF/c - Met en la regulación de la expresión del gen cyba que codifica para la proteína p22 phox en cultivo primario de hepatocitos de ratón. El análisis de la expresión de cyba por q RT - PCR en hepatocitos trata dos con HGF, reveló la repr esión de este mensajero de manera dependiente del tiempo. Para identificar los elementos cismás relevantes del promotor de cyba se clon aron diferentes regiones en un vector para medir la actividad promotora, la región má s relevante fue – 662/ - 1362 (B - C). Y mediante el análisis in silico de este promotor se logró identificar regiones consenso para NF - kB. Posteriormente se evaluó el contenido proteico de p22 phox mediante inmunode te cciones y se pudo observar el mismo efecto que en el mRNA. Con el fin de averig uar sí el proteosoma 26S está involucrado en la degradación de p22 phox inducid o por el HGF, se pre - trataron las células con epoxomicina (200 nM) durante 30 minutos e inmediatamente después se trataron con HGF (50 ng/ml) durante 12 h. El resultado mostró qu e la degradación de p22 phox fue abrogada. Para obtener más pruebas con respecto a este mecanismo, se utilizó wortmani na (2 mM) para inhibir PI3K/Akt/MDM2, y t ambién encontramos que la degradación de p22 phox fue revocada. Por último, hemos encontrado un a in teracción entre p22 phox y c - Met, lo que sugiere un mecanismo post - traduccional adicional de regulación de la NADPH oxidasa y HGF/c - Met. En conclusión, nuestros datos muestran claramente que HGF/c - Met ejerce una amplia gama de mecanismos moleculares que tienden a controlar la expresión y la actividad de las NADPH oxidasas que utiliza a p22 phox como un componente clave. It is well known that signaling mediated by the hepatocyte growth factor (HGF) and its receptor c - Met is involved in the control of cellular redox status and oxidative stress, particularly through its ability to induce hepatoprotective gene expression by activating survival pathways in the hepatocyte. We recently showed that HGF can regulate the expression of many members of the NADPH oxidase family in liver cells, particularly the catalytic subunits and p22 phox. In the present work we were focused to figure out the mechanism mediated by HGF/c - Met in the expres sion and protein content of p22 phox in primary mouse hepatocytes. The analys is of the expression of cyba by qRT - PCR under HGF treatment revealed the repression of this messenger in a time dependent manner. To identify the most relevant cis elements in the cyba promoter, different regions were cloned into a vector to measure the pr omoter activity, the most relevant region was - 662 / - 1362 (B - C). While this effect was related with p22 phox protein content, the timing of the effect suggested an independent process that could be involved in p22 phox levels. In order to figure out the pos sible p22 phox degradation by 26S proteasome induced by HGF, we treated cells with epoxomicin (200 nM) for 30 min before HGF (50 ng/ml) treatment for 12h. Result showed that p22 phox degradation was abrogated. To gain more evidence regarding this mechanism, we used wortmannin (2 mM) to inhibit PI3K/Akt, due to some reports linking PI3K/Akt to the mdm2 ubiquitin ligase. We found that also p22 phox degradation was revoked. Finally, as we previously found we confirmed the interaction of p22 phox and c - Met by immun oprecipitation, suggesting an additional post - translational mechanism of regulation of NADPH oxidase and HGF/c - Met. In conclusion, our data clearly show that HGF/c - Met exerts a wide - range of molecular mechanisms tending to control the expression and activity of those NADPH oxidases that use p22 phox as a key component.