Back to Search
Start Over
Monitoring changes in cell morphology during photodynamic effects using holographic tomography and fluorescent confocal microscopy
- Publication Year :
- 2019
- Publisher :
- СанкÑ-ÐеÑеÑбÑÑгÑкий полиÑÐµÑ Ð½Ð¸ÑеÑкий ÑнивеÑÑиÑÐµÑ ÐеÑÑа Ðеликого, 2019.
-
Abstract
- Ð ÑабоÑе пÑоведен анализ изменений клеÑоÑной моÑÑологии в оÑÐ²ÐµÑ Ð½Ð° ÑоÑодинамиÑеÑкое воздейÑÑвие in vitro. ЭкÑпеÑименÑÑ Ð¿ÑоводилиÑÑ Ð¼ÐµÑодами ÑиÑÑовой гологÑаÑиÑеÑкой ÑомогÑаÑии. ÐÐ»Ñ Ð¸Ð·ÑÑÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¼Ð¾ÑÑологиÑеÑÐºÐ¸Ñ Ð¸Ð·Ð¼ÐµÐ½ÐµÐ½Ð¸Ð¹ в клеÑÐºÐ°Ñ , пÑоиÑÑ Ð¾Ð´ÑÑÐ¸Ñ Ð² пÑоÑеÑÑе Ð¸Ñ Ð³Ð¸Ð±ÐµÐ»Ð¸, иÑполÑзовалÑÑ ÑпеÑиализиÑованнÑй опÑиÑеÑкий микÑоÑкоп 3D Cell Explorer (Nanolive, ШвейÑаÑиÑ), в коÑоÑом Ñеализован пÑинÑип гологÑаÑиÑеÑкой ÑомогÑаÑии. ЭÑÐ¾Ñ Ð±ÐµÑконÑакÑнÑй меÑод оÑнован на ÑÐµÑ Ð½Ð¸ÐºÐµ гологÑаÑиÑеÑкой микÑоÑкопии, коÑоÑÐ°Ñ Ð¿Ð¾Ð·Ð²Ð¾Ð»ÑÐµÑ Ð²Ð¾ÑÑÑанавливаÑÑ Ð¸Ð·Ð¼ÐµÐ½ÐµÐ½Ð¸Ñ ÑоÑÐ¼Ñ Ð²Ð¾Ð»Ð½Ð¾Ð²Ð¾Ð³Ð¾ ÑÑонÑа пÑи его пÑÐ¾Ñ Ð¾Ð¶Ð´ÐµÐ½Ð¸Ð¸ ÑеÑез иÑÑледÑемÑй обÑазеÑ. Ð¢ÐµÑ Ð½Ð¸ÐºÐ° ÑомогÑаÑии ÑеализÑеÑÑÑ Ð·Ð° ÑÑÐµÑ Ð¾Ð±ÑабоÑки набоÑа гологÑамм, заÑегиÑÑÑиÑованнÑÑ Ð¿Ñи вÑаÑении зондиÑÑÑÑего пÑÑка. Ð ÑезÑлÑÑаÑе ÑиÑленной обÑабоÑки полÑÑенного набоÑа гологÑамм пÑоизводиÑÑÑ Ð²Ð¾ÑÑÑановление ÑÑÐµÑ Ð¼ÐµÑного ÑаÑпÑÐµÐ´ÐµÐ»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¿Ð¾ÐºÐ°Ð·Ð°ÑÐµÐ»Ñ Ð¿ÑÐµÐ»Ð¾Ð¼Ð»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð²Ð¾ внÑÑÑиклеÑоÑнÑÑ ÑÑÑÑкÑÑÑÐ°Ñ , ÑÑо впоÑледÑÑвии Ð¼Ð¾Ð¶ÐµÑ Ð±ÑÑÑ Ð¸ÑполÑзовано Ð´Ð»Ñ Ð¾Ñенки Ð¸Ñ ÑоÑÑоÑниÑ, моÑÑологии и опÑÐµÐ´ÐµÐ»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¼ÐµÑ Ð°Ð½Ð¸Ð·Ð¼Ð° клеÑоÑной гибели. Ð ÑабоÑе бÑли полÑÑÐµÐ½Ñ ÑÑÐµÑ Ð¼ÐµÑнÑе пÑоÑÑÑанÑÑвеннÑе ÑаÑпÑÐµÐ´ÐµÐ»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¿Ð¾ÐºÐ°Ð·Ð°ÑÐµÐ»Ñ Ð¿ÑÐµÐ»Ð¾Ð¼Ð»ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð² клеÑÐºÐ°Ñ Ð¸ опÑÐµÐ´ÐµÐ»ÐµÐ½Ñ Ð¾ÑновнÑе моÑÑологиÑеÑкие паÑамеÑÑÑ ÐºÐ»ÐµÑок: обÑем, ÑÑеднÑÑ Ð²ÑÑоÑа, плоÑÐ°Ð´Ñ Ð¼ÐµÐ¼Ð±ÑанÑ. ÐÑла изÑÑена ÑеакÑÐ¸Ñ ÐºÐ»ÐµÑок на ÑоÑодинамиÑеÑкое воздейÑÑвие (ФÐÐ) пÑи ÑазнÑÑ Ð´Ð¾Ð·Ð°Ñ , и Ð¸Ð·Ð¼ÐµÐ½ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð² моÑÑологии бÑли ÑопоÑÑÐ°Ð²Ð»ÐµÐ½Ñ Ñ Ð¾ÑновнÑми пÑÑÑми гибели клеÑок, апопÑозом и некÑозом. Ð ÑабоÑе иÑÑледовалаÑÑ ÑеакÑÐ¸Ñ ÐºÐ»ÐµÑок каÑÑÐ¸Ð½Ð¾Ð¼Ñ Ñеловека HeLa и ÑибÑоблаÑÑов мÑÑи 3T3 на ФÐРмеÑодом гологÑаÑиÑеÑкой ÑомогÑаÑии. ФÐРоÑÑÑеÑÑвлÑлоÑÑ Ñ Ð¸ÑполÑзованием ÑоÑоÑенÑибилизаÑоÑа (ФС) Ð Ð°Ð´Ð°Ñ Ð»Ð¾Ñин. ÐбÑазÑÑ ÐºÑлÑÑивиÑовалиÑÑ Ð² ÑаÑÐºÐ°Ñ ÐеÑÑи в ÑÑеде DMEM, ÑодеÑжаÑей 10% ÑÑвоÑоÑки кÑови плодов коÑÐ¾Ð²Ñ Ð¸ 1% пениÑиллина/ÑÑÑепÑомиÑина в аÑмоÑÑеÑе 5% СÐ2 пÑи 37 °C. ÐеÑед пÑоведением ÑкÑпеÑименÑов клеÑки вÑдеÑживалиÑÑ Ð² ÑаÑÑвоÑе, ÑодеÑжаÑем ÑоÑоÑенÑибилизаÑÐ¾Ñ Ð² конÑенÑÑаÑии 5 мкг/мл или 10 мкг/мл в ÑеÑение 4 ÑаÑов, пÑи ÑÑом пÑоиÑÑ Ð¾Ð´Ð¸Ð»Ð¾ его пÑоникновение внÑÑÑÑ ÐºÐ»ÐµÑок. ÐаÑем ÑаÑÑÐ²Ð¾Ñ Ð·Ð°Ð¼ÐµÐ½ÑлÑÑ Ð½Ð° ÑиÑÑÑÑ ÐºÑлÑÑÑÑалÑнÑÑ ÑÑедÑ. ÐоÑле ÑÑого клеÑки облÑÑалиÑÑ Ð¸Ð·Ð»ÑÑением полÑпÑоводникового лазеÑа на длине Ð²Ð¾Ð»Ð½Ñ 660 нм, ÑооÑвеÑÑÑвÑÑÑей макÑимÑÐ¼Ñ Ð¿Ð¾Ð»Ð¾ÑÑ Ð¿Ð¾Ð³Ð»Ð¾ÑÐµÐ½Ð¸Ñ ÑоÑоÑенÑибилизаÑоÑа, ÑÑо пÑиводило к обÑÐ°Ð·Ð¾Ð²Ð°Ð½Ð¸Ñ Ð°ÐºÑивнÑÑ ÑоÑм киÑлоÑода внÑÑÑи клеÑок и к Ð¸Ñ Ð¿Ð¾ÑледÑÑÑей гибели. ÐлеÑки подвеÑгалиÑÑ Ð¤ÐРна ÑÑÐµÑ ÑазлиÑнÑÑ Ð´Ð¾Ð·Ð°Ñ Ð¾Ð±Ð»ÑÑениÑ: 5 Ðж, 10 Ðж, 20 Ðж. ÐÑло пÑоанализиÑовано 6 гÑÑпп клеÑок, заÑикÑиÑованнÑÑ ÑеÑез 24 ÑаÑа поÑле ФÐРна ÑазнÑÑ Ð´Ð¾Ð·Ð°Ñ Ð¾Ð±Ð»ÑÑÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¸ пÑи ÑазнÑÑ ÐºÐ¾Ð½ÑенÑÑаÑиÑÑ ÑоÑоÑенÑибилизаÑоÑа. Ð ÑезÑлÑÑаÑе ÑÑаÑиÑÑиÑеÑкого анализа бÑли вÑÐ´ÐµÐ»ÐµÐ½Ñ ÑÑÑеÑÑвеннÑе ÑазлиÑÐ¸Ñ Ð² изменении колиÑеÑÑвеннÑÑ Ð¼Ð¾ÑÑологиÑеÑÐºÐ¸Ñ Ð¿Ð°ÑамеÑÑов клеÑок линии HeLа, коÑоÑÑе ÑооÑвеÑÑÑвÑÑÑ Ð´Ð²Ñм оÑновнÑм пÑÑÑм клеÑоÑной гибели: апопÑозÑ, коÑоÑÑй ÑопÑовождаеÑÑÑ Ð¾ÐºÑÑглением клеÑки, ÑвелиÑением плоÑноÑÑи ÑиÑÐ¾Ð¿Ð»Ð°Ð·Ð¼Ñ Ð¸ оÑганелл Ñ Ð¿Ð¾ÑледÑÑÑим обÑазованием Ð¼ÐµÐ»ÐºÐ¸Ñ Ð¿ÑзÑÑей (блеббинг), и некÑозÑ, Ñ Ð°ÑакÑеÑизÑÑÑемÑÑÑ Ð½Ð°Ð±ÑÑ Ð°Ð½Ð¸ÐµÐ¼ ÑиÑоплазмÑ, ÑазÑÑÑением оÑганелл, ÑазÑÑвом клеÑоÑной мембÑÐ°Ð½Ñ Ð¸ вÑÑеканием внÑÑÑиклеÑоÑного ÑодеÑжимого наÑÑжÑ. ÐÑÑи некÑоза и апопÑоза изÑÑалиÑÑ Ð² динамике на клеÑÐºÐ°Ñ HeLa и 3T3 на пÑоÑÑжении 2,5 ÑаÑов поÑле пÑÐ¾Ð²ÐµÐ´ÐµÐ½Ð¸Ñ Ð¤ÐÐ. ÐаннÑе, полÑÑеннÑе Ñ Ð¿Ð¾Ð¼Ð¾ÑÑÑ Ð³Ð¾Ð»Ð¾Ð³ÑаÑиÑеÑкой ÑомогÑаÑии, бÑли подÑвеÑÐ¶Ð´ÐµÐ½Ñ ÑÑандаÑÑнÑм ÑеÑÑом на ÑелоÑÑноÑÑÑ ÐºÐ»ÐµÑоÑнÑÑ Ð¼ÐµÐ¼Ð±Ñан, пÑоведеннÑм Ñ Ð¸ÑполÑзованием конÑокалÑного ÑлÑоÑеÑÑенÑного микÑоÑкопа. ÐоÑÑологиÑеÑкие паÑамеÑÑÑ ÑÐµÑ Ð¶Ðµ ÑикÑиÑованнÑÑ ÐºÐ»ÐµÑок опÑеделÑлиÑÑ Ð½Ð° оÑновании обÑабоÑки набоÑов ÑлÑоÑеÑÑенÑнÑÑ Ð¸Ð·Ð¾Ð±Ñажений, полÑÑеннÑÑ Ñ Ð¿Ð¾Ð¼Ð¾ÑÑÑ ÐºÐ¾Ð½ÑокалÑной микÑоÑкопии Ñ Ð¾ÐºÑаÑиванием клеÑок ÑÑандаÑÑнÑм набоÑом кÑаÑиÑелей. Ðоказано Ñ Ð¾ÑоÑее ÑооÑвеÑÑÑвие даннÑÑ Ð¿Ð¾Ð»ÑÑеннÑÑ Ð´Ð²ÑÐ¼Ñ ÑазлиÑнÑми меÑодами.<br />The experimental analysis was performed on changes of cellular morphology in response to photodynamic treatment in vitro. Experiments were performed by means of digital holographic tomography. 3D spatial distributions of refractive index in cells were obtained and main morphological parameters of cells were determined: volume, average height, membrane area. The cellular response to treatment at different doses was studied and changes in morphology were correlated with major cell death pathways, apoptosis and necrosis. The necrosis and apoptosis pathways were studied in dynamics. The results obtained by holographic tomography were validated using a standard test for cellular membrane integrity, conducted using a confocal fluorescent microscope. The morphological parameters of the same fixed cells were determined by processing of sets of fluorescent images obtained using confocal microscopy with cell staining. The good agreement of the data obtained by two different methods was demonstrated.
- Subjects :
- morphological parameters
клеÑоÑÐ½Ð°Ñ Ð»Ð¸Ð½Ð¸Ñ HeLa
Radachlorin
apoptosis
апопÑоз
ÑÑаÑиÑÑиÑеÑкий анализ
HeLa cell line
3T3 cell line
ÑлÑоÑеÑÑенÑÐ½Ð°Ñ ÐºÐ¾Ð½ÑокалÑÐ½Ð°Ñ Ð¼Ð¸ÐºÑоÑкопиÑ
клеÑоÑÐ½Ð°Ñ Ð»Ð¸Ð½Ð¸Ñ 3T3
ÑоÑодинамиÑеÑкое воздейÑÑвие
singlet oxygen
holographic tomography
necrosis
моÑÑологиÑеÑкие паÑамеÑÑÑ
гологÑаÑиÑеÑÐºÐ°Ñ ÑомогÑаÑиÑ
statistical analysis
некÑоз
ÑинглеÑнÑй киÑлоÑод
photodynamic treatment
fluorescent confocal microscopy
Ð Ð°Ð´Ð°Ñ Ð»Ð¾Ñин
Subjects
Details
- Language :
- Russian
- Database :
- OpenAIRE
- Accession number :
- edsair.doi...........f65ca7e258bea2c6f6d6b5167357e58a
- Full Text :
- https://doi.org/10.18720/spbpu/3/2019/vr/vr19-2713