Monitoring changes in cell morphology during photodynamic effects using holographic tomography and fluorescent confocal microscopy

В работе проведен анализ изменений клеточной морфологии в ответ на фотодинамическое воздействие in vitro. Эксперименты проводились методами цифровой голографической томографии. Для изучения Ð¼Ð¾Ñ€Ñ„Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¸Ñ‡ÐµÑÐºÐ¸Ñ Ð¸Ð·Ð¼ÐµÐ½ÐµÐ½Ð¸Ð¹ в ÐºÐ»ÐµÑ‚ÐºÐ°Ñ , Ð¿Ñ€Ð¾Ð¸ÑÑ Ð¾Ð´ÑÑ‰Ð¸Ñ Ð² процессе Ð¸Ñ Ð³Ð¸Ð±ÐµÐ»Ð¸, использовался специализированный оптический микроскоп 3D Cell Explorer (Nanolive, Швейцария), в котором реализован принцип голографической томографии. Этот бесконтактный метод основан на Ñ‚ÐµÑ Ð½Ð¸ÐºÐµ голографической микроскопии, которая позволяет восстанавливать изменения формы волнового фронта при его Ð¿Ñ€Ð¾Ñ Ð¾Ð¶Ð´ÐµÐ½Ð¸Ð¸ через исследуемый образец. Ð¢ÐµÑ Ð½Ð¸ÐºÐ° томографии реализуется за счет обработки набора голограмм, Ð·Ð°Ñ€ÐµÐ³Ð¸ÑÑ‚Ñ€Ð¸Ñ€Ð¾Ð²Ð°Ð½Ð½Ñ‹Ñ Ð¿Ñ€Ð¸ вращении зондирующего пучка. В результате численной обработки полученного набора голограмм производится восстановление Ñ‚Ñ€ÐµÑ Ð¼ÐµÑ€Ð½Ð¾Ð³Ð¾ распределения показателя преломления во Ð²Ð½ÑƒÑ‚Ñ€Ð¸ÐºÐ»ÐµÑ‚Ð¾Ñ‡Ð½Ñ‹Ñ ÑÑ‚Ñ€ÑƒÐºÑ‚ÑƒÑ€Ð°Ñ , что впоследствии может быть использовано для оценки Ð¸Ñ ÑÐ¾ÑÑ‚Ð¾ÑÐ½Ð¸Ñ, морфологии и определения Ð¼ÐµÑ Ð°Ð½Ð¸Ð·Ð¼Ð° клеточной гибели. В работе были получены Ñ‚Ñ€ÐµÑ Ð¼ÐµÑ€Ð½Ñ‹Ðµ пространственные распределения показателя преломления в ÐºÐ»ÐµÑ‚ÐºÐ°Ñ Ð¸ определены основные морфологические параметры клеток: объем, средняя высота, площадь мембраны. Была изучена реакция клеток на фотодинамическое воздействие (ФДВ) при Ñ€Ð°Ð·Ð½Ñ‹Ñ Ð´Ð¾Ð·Ð°Ñ , и изменения в морфологии были сопоставлены с основными путями гибели клеток, апоптозом и некрозом. В работе исследовалась реакция клеток карциномы человека HeLa и фибробластов мыши 3T3 на ФДВ методом голографической томографии. ФДВ осуществлялось с использованием фотосенсибилизатора (ФС) Ð Ð°Ð´Ð°Ñ Ð»Ð¾Ñ€Ð¸Ð½. Образцы культивировались в Ñ‡Ð°ÑˆÐºÐ°Ñ ÐŸÐµÑ‚Ñ€Ð¸ в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы и 1% пенициллина/стрептомицина в атмосфере 5% СО2 при 37 °C. Перед проведением экспериментов клетки выдерживались в растворе, содержащем фотосенсибилизатор в концентрации 5 мкг/мл или 10 мкг/мл в течение 4 часов, при этом Ð¿Ñ€Ð¾Ð¸ÑÑ Ð¾Ð´Ð¸Ð»Ð¾ его проникновение внутрь клеток. Затем раствор заменялся на чистую культуральную среду. После этого клетки облучались излучением полупроводникового лазера на длине волны 660 нм, соответствующей максимуму полосы поглощения фотосенсибилизатора, что приводило к образованию Ð°ÐºÑ‚Ð¸Ð²Ð½Ñ‹Ñ Ñ„Ð¾Ñ€Ð¼ кислорода внутри клеток и к Ð¸Ñ Ð¿Ð¾ÑÐ»ÐµÐ´ÑƒÑŽÑ‰ÐµÐ¹ гибели. Клетки подвергались ФДВ на Ñ‚Ñ€ÐµÑ Ñ€Ð°Ð·Ð»Ð¸Ñ‡Ð½Ñ‹Ñ Ð´Ð¾Ð·Ð°Ñ Ð¾Ð±Ð»ÑƒÑ‡ÐµÐ½Ð¸Ñ: 5 Дж, 10 Дж, 20 Дж. Было проанализировано 6 групп клеток, Ð·Ð°Ñ„Ð¸ÐºÑÐ¸Ñ€Ð¾Ð²Ð°Ð½Ð½Ñ‹Ñ Ñ‡ÐµÑ€ÐµÐ· 24 часа после ФДВ на Ñ€Ð°Ð·Ð½Ñ‹Ñ Ð´Ð¾Ð·Ð°Ñ Ð¾Ð±Ð»ÑƒÑ‡ÐµÐ½Ð¸Ñ и при Ñ€Ð°Ð·Ð½Ñ‹Ñ ÐºÐ¾Ð½Ñ†ÐµÐ½Ñ‚Ñ€Ð°Ñ†Ð¸ÑÑ Ñ„Ð¾Ñ‚Ð¾ÑÐµÐ½ÑÐ¸Ð±Ð¸Ð»Ð¸Ð·Ð°Ñ‚Ð¾Ñ€Ð°. В результате статистического анализа были выделены существенные различия в изменении ÐºÐ¾Ð»Ð¸Ñ‡ÐµÑÑ‚Ð²ÐµÐ½Ð½Ñ‹Ñ Ð¼Ð¾Ñ€Ñ„Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¸Ñ‡ÐµÑÐºÐ¸Ñ Ð¿Ð°Ñ€Ð°Ð¼ÐµÑ‚Ñ€Ð¾Ð² клеток линии HeLа, которые соответствуют двум основным путям клеточной гибели: апоптозу, который сопровождается округлением клетки, увеличением плотности цитоплазмы и органелл с последующим образованием Ð¼ÐµÐ»ÐºÐ¸Ñ Ð¿ÑƒÐ·Ñ‹Ñ€ÐµÐ¹ (блеббинг), и некрозу, Ñ Ð°Ñ€Ð°ÐºÑ‚ÐµÑ€Ð¸Ð·ÑƒÑŽÑ‰ÐµÐ¼ÑƒÑÑ Ð½Ð°Ð±ÑƒÑ Ð°Ð½Ð¸ÐµÐ¼ цитоплазмы, разрушением органелл, разрывом клеточной мембраны и вытеканием внутриклеточного содержимого наружу. Пути некроза и апоптоза изучались в динамике на ÐºÐ»ÐµÑ‚ÐºÐ°Ñ HeLa и 3T3 на протяжении 2,5 часов после проведения ФДВ. Данные, полученные с помощью голографической томографии, были подтверждены стандартным тестом на целостность ÐºÐ»ÐµÑ‚Ð¾Ñ‡Ð½Ñ‹Ñ Ð¼ÐµÐ¼Ð±Ñ€Ð°Ð½, проведенным с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа. Морфологические параметры Ñ‚ÐµÑ Ð¶Ðµ Ñ„Ð¸ÐºÑÐ¸Ñ€Ð¾Ð²Ð°Ð½Ð½Ñ‹Ñ ÐºÐ»ÐµÑ‚Ð¾Ðº определялись на основании обработки наборов Ñ„Ð»ÑƒÐ¾Ñ€ÐµÑÑ†ÐµÐ½Ñ‚Ð½Ñ‹Ñ Ð¸Ð·Ð¾Ð±Ñ€Ð°Ð¶ÐµÐ½Ð¸Ð¹, Ð¿Ð¾Ð»ÑƒÑ‡ÐµÐ½Ð½Ñ‹Ñ Ñ помощью конфокальной микроскопии с окрашиванием клеток стандартным набором красителей. Показано Ñ Ð¾Ñ€Ð¾ÑˆÐµÐµ соответствие Ð´Ð°Ð½Ð½Ñ‹Ñ Ð¿Ð¾Ð»ÑƒÑ‡ÐµÐ½Ð½Ñ‹Ñ Ð´Ð²ÑƒÐ¼Ñ различными методами.
The experimental analysis was performed on changes of cellular morphology in response to photodynamic treatment in vitro. Experiments were performed by means of digital holographic tomography. 3D spatial distributions of refractive index in cells were obtained and main morphological parameters of cells were determined: volume, average height, membrane area. The cellular response to treatment at different doses was studied and changes in morphology were correlated with major cell death pathways, apoptosis and necrosis. The necrosis and apoptosis pathways were studied in dynamics. The results obtained by holographic tomography were validated using a standard test for cellular membrane integrity, conducted using a confocal fluorescent microscope. The morphological parameters of the same fixed cells were determined by processing of sets of fluorescent images obtained using confocal microscopy with cell staining. The good agreement of the data obtained by two different methods was demonstrated.