Entwicklung eines Oligonukleotid-Mikroarrays für Diversitätsanalysen von Genen der dissimilatorischen Bisulfitreduktase in einem sauren Moorsystem

Sulfatreduzierende Mikroorganismen (SRM) besitzen das dsrAB-Gen, welches für die Dissimilatorische (Bi-) Sulfit-Reduktase kodiert und sind deshalb in der Lage Sulfat zu Sulfid zu reduzieren. Dabei wird Sulfat als Elektronenakzeptor verwendet und so Energie für das Wachstum gewonnen. Obwohl SRM schon früh in der erdgeschichtlichen Entwicklung entstanden und ubiquitär verbreitet sind ist wenig über deren Häufigkeit und Aktivität in komplexen mikrobiellen Lebensgemeinschaften bekannt. Um SRM genauer zu erforschen wurde während dieser Arbeit ein habitatspezifischer Oligonukleotid-Array für die kultivierungsunabhängige Detektion und Funktionsanalyse ausgewählter SRM entwickelt und validiert. Der zugrunde liegende Sondensatz (146 Sonden) zur Detektion und Identifizierung der verschiedenen dsrAB-Gene (unterteilt in 42 OTU’s) basiert auf vergleichenden Sequenzanalysen der dsrAB-Gene aus einem sauren Niedermoor (Schlöppnerbrunnen, Bayern, Deutschland). Die Entwicklung des Mikroarrays beinhaltete verschiedene Optimierungsschritte während der Mikroarrayproduktion, Herstellung der fluoreszenzmarkierten Nukleinsäureproben, Evaluierung der Hybridisierungsbedingungen und der Validierung des Sondensatzes durch Hybridisierung mit geeigneter Referenz-RNS. Bei der anschließenden Evaluierung der dsrAB-Oligonukleotid-Sonden, durch Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten dsrAB-Genamplifikaten geeigneter Referenzklone, zeigten 99.8% ein erwartetes Hybridisierungsverhalten. Bei der Hybridisierung von nur 1 ng Ziel-RNS war es möglich die RNS mit den korrespondierenden Sonden positiv nachzuweisen, ohne das Auftreten von Falschpositiven- oder Falschnegativen-Hybridisierungsergebnissen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass bei der Hybridisierung von einer 0.54% Ziel-RNS/Nicht-Ziel-RNS Mischung die Ziel-RNS noch mit allen spezifischen Sonden detektiert werden konnte. So ist es mit Hilfe dieses Mikroarrays möglich SRM im Habitat Schlöppnerbrunnen hoch auflösend binnen 48 h inklusive aller experimentellen Arbeiten zu detektieren.