Leitfaden für die Lebensmittelüberwachung zur Identifizierung der Fischart durch DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten

Die Uberfischung vieler traditionell genutzter Fischbestande, der Anstieg der Aquakultur zu einem nahezu 50 %igem Beitrag an Fischen, Krebsund Weichtieren fur diemenschliche Ernahrung (FAO2011) und der weltweit wachsende Handel mit FischereiErzeugnissen fuhren in vielen Landern zu einem starkenWandel im Spektrum der angebotenen Fischund Meeresfruchte-Arten. So werden beispielsweise in Deutschland mehrere Hundert Arten von Fischen, KrebsundWeichtieren gehandelt, Tendenz steigend. Dieser Entwicklung mussen die Laboratorien der Lebensmitteluberwachung, die sich mit der Identifizierung von Fischarten zur Uberprufung der Kennzeichnung befassen, durch Anwendung geeigneter Analysenmethoden Rechnung tragen. In den letzten beiden Jahrzehnten hat sich die PCRbasierte DNA-Analyse zur Methode der Wahl fur die Bestimmung der Fischart in allen Erzeugnisformen von der Rohware bis zur Konserve durchgesetzt (Rasmussen und Morrissey 2008). Die zunachst dominierende Methode bestand in einem Restriktionsverdau der Amplicons durch geeignete Endonucleasen (Wolf et al. 2000) und Visualisierung der Fragmentmuster durch Elektrophorese in Agaroseoder Polyacrylamidgelen. Dieses Verfahren, das als RFLP-Analyse (restriction fragment lengths polymorphism analysis) bezeichnet wird, hat seinen Niederschlag in der Entwicklung des Untersuchungsverfahrens nach § 64 LFGB ,,Identifizierung der Fischart in rohen und erhitzten Erzeugnissen‘‘ (L11.00/7) gefunden (http:// www.methodensammlung-bvl.de). Mit dem Auftreten immer neuer Fischarten auf dem deutschen Markt wurden die Grenzen der RFLPAnalyse deutlich. Fur eine sichere Aussage uber die zu identifizierende Fischart in Handelsproben mussten immer mehr Restriktionsendonucleasen eingesetzt werden, beispielsweise 7 Enzyme zur Differenzierung von 36 Fischarten aus den Gattungen Merluccius, Anguilla, Oncorhynchus u. a. (Hold et al. 2001). Auserdem war es haufig schwierig, Referenzmaterial zur Validierung der RFLP-Methoden zu beschaffen. Vor diesem Hintergrund und bei sinkenden Kosten fur die DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten setzte sich die Sequenzierung als Identifikationsmethode immer mehr durch. Inzwischen sind in Gendatenbanken, wie GenBank oder Barcode of Life Database (BOLD), Sequenzen verschiedener mitochondrialer Gene (Cytochrom b, Cytochrom c Oxidase Untereinheit I, 16S rRNA) fur mehrere Tausend Fischarten hinterlegt (Becker et al. 2011). Daher wurde auf Basis der DNA-Sequenzierung fur die ,,Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB – Untersuchung von Lebensmitteln‘‘ eineneueMethode ,,Fischartbestimmung H. Rehbein (&) Max Rubner-Institut, Institut fur Sicherheit und Qualitat bei Milch und Fisch, Palmaille 9, 22767 Hamburg, Deutschland e-mail: hartmut.rehbein@mri.bund.de