Development of biocompatible polyesters based formulations for microstereo-thermal-lithography

Doctoral thesis in Chemical Engineering, supervised by Professor Doctor Jorge Fernando Jordão Coelho and Professor Doctor Paulo Jorge da Silva Bártolo, submitted to the Chemical Engineering Department, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra. The goal of the present PhD work was the development of new biobased unsaturated polyesters (UPs) to be applied in additive manufacturing technologies, such as microstereo-thermal-lithography (STLG), aiming to produce 3D scaffolds for biomedical applications. UPs are widely used in industrial fields, however their excellent thermomechanical properties and tunability make them excellent candidates for tissue engineering applications. UPs were produced by step-growth polycondensation, using several glycols and diacids of sustainable resources, such as succinic acid (SuCA) and sebacic acid (SeBA). Fumaric acid (FA) was used as the source of double bonds to promote posterior crosslinking reactions with vinylic monomers. In a first approach, the synthesis of UPs using renewable monomers was performed. The properties of the polyesters were extensively studied, namely thermal and mechanical properties, and the final products compared with a commercial resin named Crystic 272, which has been successfully tested on STLG. To understand the polyesters properties, the study of the ratio between diacids and glycols as well as the type of monomers used was performed. By carefully selecting the monomers and the ratio between diacids and glycols it is possible to control the final properties of the polymers. The produced oligomers, characterized by low molecular weights and obtained from aliphatic monomers and natural based diacids, showed high thermal stability, with Ton higher than 330 ºC. Thermal stability remains constant even with the replacement of isophthalic acid by aliphatic diacids. To achieve the proper viscosity to be applied in µSTLG experiments, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and styrene (St) were used as the crosslinking agents. The results were very promising, with the production of two layered scaffolds based on bio resins. Preliminary cell viability tests showed that the synthesized polyesters are biocompatible. The choice of the crosslinking agent also plays a determinant role in the properties of the final unsaturated polyester resins (UPRs). Although St is one the most used unsaturated monomer (UM) to promote the formation of 3D networks, a more friendly UM is desired. Therefore, the prepared biobased UPs were crosslinked with different vinylic monomers, such as HEMA and N-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP). Since the final viscosity of the formulations is a crucial parameter, determining the applicability on the µSTLG, the viscosity of the formulations was measured and HEMA was selected as the proper monomer due to its low viscosity and biocompatible character. Photo and thermal polymerization studies were performed to evaluate the properties of the final biobased UPRs. The thermal crosslinked polyesters showed low gel content with variable water contact angles (WCA) with hydrophilic character. Morphology and roughness of the polymers were also studied since these parameters strongly influences the cell adhesion. Posteriorly, a full characterization of the UPRs, cytotoxicity and cell adhesion tests were performed. After 48 h of incubation, for the STLG UPRs, 50-60% of the cells were viable, but both thermal and STLG scaffolds presented high levels of acidity. Alongside with the synthesis and processing of the polyesters, new formulations were tested. Due to the low incorporation of the diacids observed in the previous formulations, new synthesis were performed in two distinct steps, which also resulted in a reduction of the time of the polycondensation reaction. The formulations based on SuCA, diethylene glycol (DG) and other renewable sources (UP7 to UP11s formulations) were prepared in a two-step bulk polycondensation reaction. Glutaric acid (GA) an isosorbide (IS) were some of the chosen renewable sources for the development of the new UPs formulations. Afterwards, the UPs were crosslinked with HEMA. Overall, the developed formulation showed better reaction times, and had the desired properties for the intended final application. GA also proved to be an interesting diacid to be used in the preparation of new UPs for biomedical areas, with high water solubility, high thermal stability and low Tg. Several problems arise concerning the viability of the materials regarding their use in biomedical field. The UPs showed surface acidity and to overcome this issue, several strategies were attempted to eliminate the scaffolds acidity. Reflux treatment with ethanol and oxygen plasma were some of the protocols used to change the polyesters surface. The simplest technique, reflux with ethanol, demonstrate to be adequate in the elimination of surface acidity. Results obtained from plasma treatments suggested that they are not effective to solve the acidity problem and enhance biocompatible character of the polyesters. The µSTLG scaffolds Scf6 and Scf7, based on formulations UP6 and UP7, respectively, were subjected to reflux and showed cell viabilities around 100% after 48 h. The use of renewable sources to obtain fully biobased UPs was accomplished within this PhD work, and the final materials reveal to be strong candidates to be used in the fabrication of 3D scaffolds by µSTLG. The materials exhibit low viscosity, good thermo-mechanical properties, similar to commercial products, high hydrophilicity and cell viability. Ultimately, these polymers can bring new advances and opportunities for the use of these unsaturated polyesters in the preparation of tailored scaffolds for specific uses. RESUMO: O objetivo do presente trabalho de doutoramento consistiu no desenvolvimento de poliésteres insaturados para aplicação em técnicas de prototipagem rápida, nomeadamente em microestereo-termo-litografia (μSTLG). Os materiais desenvolvidos são deste modo processados tendo em vista o desenvolvimento de scaffolds para aplicações biomédicas. Os poliésteres insaturados, regra geral, são extensivamente utilizados em aplicações industriais, contudo as suas propriedades revelam-se de extrema utilidade em áreas como a engenharia de tecidos. A possibilidade de manipular as propriedades destes materiais consoante a aplicação final pretendida torna-os bastante atrativos para o desenvolvimento de scaffolds. Os poliésteres insaturados foram obtidos por policondensação de massa, tendo sido utilizados vários glicóis e diácidos de base natural, tais como o ácido succínico (SuCA) e sebácico (SeBA). O ácido fumárico (FA) foi usado em todas as reações desenvolvidas como a fonte de ligações duplas, de modo a promover a posterior reticulação com monómeros vinílicos. Numa primeira abordagem, a síntese de poliésteres insaturados tendo como materiais de partida monómeros de base natural foi executada. O estudo das propriedades destes poliésteres foi realizado, nomeadamente no que diz respeito às suas propriedades térmicas e mecânicas, e os produtos comparados com uma resina comercial, Crystic 272, previamente testada, com sucesso, no equipamento de STLG. O estudo das propriedades dos poliésteres, a razão entre diácidos e glicóis bem como o tipo de monómeros usados foi fundamental para a compreensão das características dos poliésteres. Uma seleção cuidada dos monómeros e da razão entre diácidos e dióis permite controlar a estrutura final dos polímeros. Os oligómeros obtidos, de baixos pesos moleculares, com base em monómeros alifáticos e diácidos de base natural, mostraram elevada estabilidade térmica, com Ton superiores a 330 C. A substituição do ácido isoftálico, presente na resina comercial, por ácidos alifáticos, não resultou na perda de estabilidade térmica. Os materiais obtidos foram processados por μSTLG, usando 2-hidroxietil metacrilato (HEMA) e estireno (St) como agentes reticulantes, conferindo assim uma viscosidade adequada ao processamento dos scaffolds. Os resultados foram bastante promissores, tendo-se fabricado scaffolds constituídos por duas camadas de resina de caráter bio. Resultados preliminares de viabilidade celular revelaram que os poliésteres sintetizados não apresentaram citotoxicidade. A escolha dos agentes de reticulação determina em grande parte as propriedades finais dos poliéstres insaturados reticulados (UPRs). Embora o St seja dos monómeros insaturados (UMs) mais utilizados para a formação de redes reticuladas 3D, a sua substituição por um composto de caráter bio é desejável. Por conseguinte, os poliésteres insaturados foram posteriormente reticulados com diferentes monómeros vinílicos, tais como o HEMA e N-Vinil-2-pirrolidona (NVP). Uma vez que a viscosidade final das formulações é um parâmetro crucial para a sua aplicação na μSTLG, as viscosidades das formulações desenvolvidas foram determinadas, tendo-se selecionado o HEMA devido à baixa viscosidade conferida ao poliéster, bem como ao seu caráter biocompatível. Estudos de foto reticulação e reticulação térmica foram desenvolvidos de modo a avaliar as propriedades finais das resinas de caráter bio. Os poliésteres reticulados termicamente revelaram baixo teor gel, com ângulos de contacto variáveis, apresentando na sua maioria um caráter hidrofílico. A morfologia das resinas, bem como a determinação da rugosidade, foram analisadas, uma vez que estes parâmetros influenciam a adesão das células na superfície polimérica. Após uma completa caracterização das resinas de poliéster insaturado, testes de citotoxicidade e de adesão celular foram realizados. As amostras preparadas por μSTLG demonstraram viabilidades na ordem dos 50-60% após 48 horas, tendo-se, no entanto, comprovado a acidez dos materiais, tanto dos scaffolds processados por μSTLG como dos UPs preparados por reticulação térmica. Em paralelo à síntese e processamento dos poliésteres, a otimização do processo de policondensação de massa foi efetuada. Tendo-se registado anteriormente a baixa incorporação dos ácidos, as sínteses foram realizadas em dois passos distintos, verificandose a diminuição do tempo de reação de policondensação. As formulações desenvolvidas à base de SuCA, dietilenoglicol (DEG) e outras fontes de origem renovável (formulações UP7 a UP11s) foram preparadas por policondensação em massa. O ácido glutárico (GA) e o isosorbide (IS) foram algumas das matérias-primas de fontes renováveis selecionadas para a síntese das novas formulações que, posteriormente, foram reticulados com HEMA. De um modo geral, verificou-se que as novas formulações possuíam as propriedades desejadas tendo em vista a aplicação final pretendida. O GA mostrou ser um diácido interessante para ser usado na preparação de novos UPs para aplicação biomédica, apresentando elevada solubilidade, estabilidade térmica e baixo Tg. Vários problemas surgiram no que diz respeito à viabilidade dos materiais para aplicação biomédica. A maioria dos UPs sintetizados apresentava uma acidez elevada, que em última instância daria origem à morte celular. De modo a contornar esta limitação, uma série de tratamentos foram efetuados, com o intuito de remover a acidez da superfície dos scaffolds. Tratamento por refluxo com etanol e tratamento por plasma com oxigénio, foram algumas das estratégias usadas para modificação da superfície dos poliésteres. O tratamento mais simples, por refluxo, revelou-se extremamente eficaz na eliminação da acidez dos UPs. Ao passo que o tratamento por plasma não foi eficiente para resolver o problema da acidez. Os materiais processados por μSTLG, Scf6 e Scf7, tratados com refluxo de etanol por 3 h, demonstraram viabilidades superiores a 100 % após 48 h. O desenvolvimento de UPs e UPRs à base de matérias-primas renováveis foi realizado com sucesso, tendo sido demonstrado que são excelentes candidatos para a fabricação de scaffolds tridimensionais por μSTLG. Propriedades tais como baixa viscosidade, performance térmica e mecânica semelhantes às exibidas pelos produtos comerciais, elevada hidrofilicidade, viabilidade e adesão celular caracterizam os polímeros obtidos, reforçando a sua potencialidade em áreas como a engenharia de tecidos.