Microbial ecology in Azores deep-seafloor hydrothermal environments

Tese de Doutoramento, Ciências do Mar, especialidade de Biologia Marinha, 20 de abril de 2018, Universidade dos Açores. Os oceanos são o maior habitat da Terra e cobrem aproximadamente dois terços da superfície do planeta. Desde as águas superficiais até às fossas abissais, os ambientes marinhos podem atingir 11 km de profundidade e pressões superiores a 1000 bar, variar entre temperaturas de 0 ºC nas regiões polares e mais de 300 ºC nas fontes hidrotermais. Em todos estes ecossistemas marinhos proliferam microorganismos que, independentemente das condições, conseguem colonizar até mesmo as regiões mais inóspitas do mar profundo e do subsolo oceânico. As fontes hidrotermais de profundidade são ambientes marinhos reconhecidos como pontos de ligação entre a litosfera e os oceanos, sendo mesmo consideradas “janelas” para a biosfera do subsolo. Nestes locais, por entre fissuras da crosta oceânica, há emissões de fluidos hidrotermais, uma combinação de gases e metais vinda do interior da Terra que é projectada para o oceano a elevadas temperaturas. Estes fluidos transportam espécies químicas reduzidas, geradas pelo contacto entre gases e minerais existentes na crosta oceânica, que servem de alimento a microorganismos quimioautotróficos dos domínios Bacteria e Archaea. Estes microorganismos desenvolveram estratégias fisiológicas únicas para conseguirem prosperar em tais condições, como a produção de enzimas e compostos activos alternativos, despertando o interesse dos cientistas para o potencial biotecnológico dos seus recursos genéticos. Bactérias e arqueas quimioautotróficas são os únicos organismos capazes de produzir matéria orgânica a partir de energia química. Estes microorganismos asseguram a produção primária nestes ambientes e a transferência de energia para a cadeia trófica, sustentando assim a vida no mar profundo. Dado o património genético, metabolismos próprios e capacidade de estabelecer relações de simbiose com outros organismos, estas bactérias e arqueas são potencialmente representativas dos organismos primordiais da Terra, e o seu estudo pertinente na explicação da origem e evolução da vida. Por desempenharem também um papel importante no ciclo biogeoquímico entre a crosta e o oceano, existe um interesse acrescido da comunidade científica na actividade, diversidade e distribuição destes microorganismos no subsolo e fundos oceânicos. Até à data desta dissertação, inúmeros estudos foram realizados no sentido de caracterizar a fauna hidrotermal e sua distribuição, incidindo sobretudo nas comunidades de invertebrados marinhos, mas apesar disso ainda muito se desconhece sobre a ecologia microbiana local, nomeadamente a associada a sedimentos hidrotermais de profundidade. Em particular, a informação sobre a diversidade microbiana associada a sedimentos do Menez Gwen, Lucky Strike e Rainbow, três campos hidrotermais de profundidade dos mares dos Açores, é ainda escassa. Apenas três estudos foram efectuados em sedimentos do Rainbow com recurso a métodos tradicionais de construção de bibliotecas genómicas de RNA ribossomal. O principal objectivo deste trabalho foi, por isso, caracterizar o microbiota associado a sedimentos dos três campos hidrotermais de profundidade mais conhecidos dos Açores, e elucidar o potencial metabólico dos microorganismos. Desta forma, obtemos informação relevante sobre formas de vida pouco ou nada conhecidas, sustentadas por mecanismos moleculares únicos e enzimas promissoras para potenciais aplicações biotecnológicas. Visto que a maioria dos microorganismos associados ao mar profundo não são cultiváveis em laboratório, os estudos de diversidade desenvolveram-se com recurso a ferramentas de sequenciação de DNA. Assim, os perfis taxonómicos de bactérias, arqueas e micro-eucariotas foram obtidos por pirosequenciação de um segmento do gene de RNA ribossomal. As comunidades microbianas associadas a sedimentos hidrotermais distintos foram comparadas e as suas funções metabólicas identificadas, por sequenciação metagenómica do DNA obtido directamente das amostras ambientais. Pela primeira vez, os microbiotas associados a sedimentos do Menez Gwen foram caracterizados. Verificou-se que as comunidades encontradas em sedimentos influenciados pelo hidrotermalismo diferiam significativamente daquelas encontradas em sedimentos não influenciados pelo hidrotermalismo. Em sedimentos amostrados perto de uma chaminé hidrotermal foram detectados microorganismos mesofílicos, termofílicos e hipertermofílicos pertencentes aos domínios Archaea (e.g., Archaeoglobus, ANME-1) e Bacteria (e.g., Caldithrix, Thermodesulfobacteria). Por outro lado, associados a sedimentos amostrados numa planície batial, abundavam representantes de filogrupos ubíquos no mar profundo (e.g., Thaumarchaeota MGI, Gamma- e Alphaproteobacteria). Da mesma forma, foram comparados os microbiomas associados a sedimentos recolhidos em três campos hidrotermais de profundidade dos Açores, Menez Gwen, Lucky Strike e Rainbow. Dadas as diferenças geológicas e geoquímicas registadas nos três campos, os seus sedimentos albergam comunidades microbianas distintas. Associados ao campo hidrotermal Menez Gwen foram identificados maioritariamente membros da classe Epsilonproteobacteria assim como alguns microorganismos metanogénicos anaeróbios pertencentes ao domínio Archaea. Em contrapartida, as comunidades do Lucky Strike e Rainbow revelaram ser dominadas por representantes da classe Gammaproteobacteria (e.g. Nitrosococcus, Acidiferrobacter e Marine Benthic Group JTB255). Para além disso, entre todos os sedimentos estudados, as comunidades associadas à fonte hidrotermal Rainbow foram as que apresentaram maior diversidade de representantes do domínio Archaea. A composição química dos sedimentos e a influência hidrotermal foram vistos como possíveis factores que explicam as diferenças encontradas nos microbiomas associados aos sedimentos de cada campo: Menez Gwen, Lucky Strike e Rainbow. Os resultados deste trabalho permitiram caracterizar a diversidade e distribuição dos microorganismos hidrotermais e permitiram seleccionar as amostras mais interessantes a serem investigadas num estudo metagenómico posterior. Neste contexto, as comunidades microbianas dos sedimentos hidrotermais dos campos Menez Gwen e Rainbow foram investigadas quanto à presença de genes intervenientes na fixação de carbon e metabolismos do enxofre, azoto e metano. A análise metagenómica destes dois microbiotas revelou quais os genes-chave envolvidos nos fluxos de carbono e energia em ambos ecossistemas hidrotermais. Para além de confirmar a variabilidade microbiana e geoquímica observada na composição dos diferentes sedimentos hidrotermais, os resultados revelaram o carácter amplamente autotrófico das comunidades microbianas aí residentes. A análise metagenómica aponta para a oxidação do enxofre como via metabólica dominante dos processos quimioautotróficos, que ocorre principalmente pela via metabólica das SOX nos sedimentos do Menez Gwen ou pela via reversa da redução do sulfato nos sedimentos do Rainbow. Foram igualmente detectados outros processos de obtenção de energia – como a oxidação do metano, do nitrito e do amoníaco – no entanto, parecem contribuir em menor escala para a quimioautotrofia nestes locais. Este trabalho de investigação contribui para o conhecimento global da ecologia microbiana de sedimentos hidrotermais de profundidade, e constitui um importante repositório de sequências de novos genes com potencial interesse biotecnológico. The world’s oceans cover two-thirds of the planet’s surface being by far the largest habitat on Earth. The marine habitats range from sunlight surface waters to ocean trenches 11,000 m deep with pressures exceeding 1000 bar. Water temperatures range from sea ice, in the polar regions, to over 300 ºC, at deep-sea hydrothermal vents. Microorganisms are able to survive and grow throughout these environments, including the subsurface and the deep-sea. Deep- sea hydrothermal systems represent an important interface between the lithosphere and the oceans, and are considered to be “windows” into the subsurface biosphere. At these locations, thermally charged hydrothermal fluids, enriched with metal compounds and dissolved gases, are ejected into the ocean, providing conditions for supporting chemosynthesis and microbial growth. Extremophile organisms have adapted to the high pressures and temperature shifts, developed novel physiological strategies to thrive in such conditions resorting to unique enzymes and proteins with interesting activities and potential biotechnological applications. Chemoautotrophic Bacteria and Archaea are the primary source of nutrition for the overall organisms dwelling around the vents. They are primary producers of organic carbon, able to establish intricate chemosynthetic symbioses with micro- and macroorganisms, and to transfer the energy up to the food web, sustaining life in the deep-sea. Because of their unique features, they are considered plausible analogues to the early microorganisms of Earth. Therefore, the study of such putative early microbes may help us understanding the origin and evolution of life, and the adaptation mechanisms to these extreme environmental conditions. Moreover, these microorganisms are potentially playing important roles in global geochemical cycling between crusts and oceans, what makes their distribution and activities in deep-sea floors interesting subjects for contemporary microbial ecologists. So far, the diversity and distribution patterns of invertebrate vent communities have been reasonably investigated, however few studies reported on the microbial ecology of free-living Archaea and Bacteria in deep-sea hydrothermal sediments, even though their remarkable activity at these ecosystems. Prior to this work, sediment-associated microbial diversity in the Menez Gwen, Lucky Strike and Rainbow hydrothermal vent fields, southwest of the Azores, was still largely unexplored. Only three microbiological surveys based on 16S clone libraries were conducted in sediments from Rainbow field. The overall goal of this thesis was therefore to characterize the microbiota associated with hydrothermal sediments from the three most visited deep-sea vent fields of the Azores region, and the elucidation of the microorganisms’ metabolic potential. The outcome of this work gives useful insights into yet undiscovered organisms with unique living conditions, molecular mechanisms, and promising enzymes for biotechnological applications. As most of the vent-associated microorganisms remain uncultured, diversity studies are usually based in culture-independent sequencing technologies. Here, the bacterial, archaeal and micro-eukaryotic taxonomic profiles were addressed by barcoded pyrosequencing of a segment of the ribosomal RNA gene. The taxonomic profiles obtained were used to compare communities associated with different hydrothermal sediments retrieved from different sites. Metagenomic approaches were then used to characterize the metabolic potential of the communities. The microbial community associated with sediments from the Menez Gwen vent system was surveyed for the first time. The microbiota of hydrothermally influenced sediments was compared with the one in non-hydrothermally influenced sediments. Microbial communities were shown to be significantly different in the two geographical areas. Specific mesophilic, thermophilic and hyperthermophilic archaeal (e.g., Archaeoglobus, ANME-1) and bacterial (e.g., Caldithrix, Thermodesulfobacteria) taxa were detected in sediments near an active vent chimney, and contrasted with members affiliating with ubiquitous deep-ocean phylogroups (e.g., Thaumarchaeota MGI, Gamma- and Alphaproteobacteria) found in the sediments from a permanently cold bathyal plain. Similarly, the sediment-associated microbiota from three neighbouring vent fields, the Menez Gwen, Lucky Strike and Rainbow systems, was also compared. The distinct geological and ecological features allow these fields to support a diversity of vent microbial communities, which were shown to be distinct between the three separated sites. Taxonomic analyses identified anaerobic methanogens and microaerobic Epsilonproteobacteria, dominating the Menez Gwen community, which contrasted with the Gammaproteobacteria Nitrosococcus, Acidiferrobacter and marine benthic group JTB255 members found to dominate both Lucky Strike and Rainbow microbial communities. Besides, the Rainbow field presented the highest archaeal diversity among all the studied sediments. Trace metal contents and distance from an active vent were suggested to influence the sediment-associated microbiota from the three vent sites. Results from this study provided a better understanding of the distribution of microorganisms in deep-sea hydrothermal sediments and allowed for specifically choosing the most interesting samples to be explored in a a posteriori metagenomic approach. Accordingly, the microbial communities from the Menez Gwen and Rainbow hydrothermal sediments were investigated for the presence and diversity of genes responsible for carbon fixation and sulfur, nitrogen and methane metabolisms. A metagenomic study of the microbiotas elucidated the gene sequences responsible for carbon and energy flux in both hydrothermal ecosystems. The metagenomic analyses confirmed the microbial and geochemical variability and revealed the largely autotrophic communities thriving in both sites. Chemolithotrophy appeared to be primarily driven by sulfur oxidation, whether through the SOX-dependent pathway at Menez Gwen site or through reverse sulfate reduction at Rainbow site. Other energy-yielding processes, such as methane, nitrite or ammonia oxidation, were also detected but presumably contributing less to chemolithoautotrophy. This work furthers our knowledge of the microbial ecology of deep-sea hydrothermal sediments, and represents a n important repository of novel genes with potential biotechnological interest. This research was funded by the Fundo Regional para a Ciência e Tecnologia (Teresa doctoral grant M3.1.2/F/052/2011) and conducted with the support of the projects SEAZYME (M2.1.2/F/024/2011 ), FCT/PEst project (PEst-OE/EEI/LA0009/2011-2014), and MARE (UID/MAR/04292/2013). All the work was conducted at DOP-University of the Azores: NorStruct- University of Tromsø and CNC - Biocant.