Estudio de la regulación transcripcional activada por el morfógeno Dpp durante la formación del ectodermo dorsal en Drosophila melanogaster

Durante la embriogénesis de Drosophila melanogaster el ectodermo dorsal se subdivide en dos tipos celulares, la amnioserosa y la epidermis dorsal. La diferenciación hacia estos dos tipos celulares es producto de la acción combinada de dos morfógenos de la familia de Factores de crecimiento TGF-β, Decapentaplegic y Screw (Dpp/Scw). El gen dpp se expresa en la región dorsal del embrión en los estados del blastodermo celular y gástrula, mientras que scw se expresa de forma ubicua, por un corto periodo de tiempo, durante la celularización del embrión. La acción de Dpp se manifiesta en forma de un gradiente extracelular, que alcanza niveles máximos de señalización en la región más dorsal del embrión, determinando directamente el destino de las células dorsales del embrión mediante la activación transcripcional de diferentes grupos de genes. Los TGF-β emiten su señal primaria a través de la familia de factores de transcripción Smads los cuales forman complejos con cofactores específicos activando o reprimiendo la expresión de genes blancos. Durante la subdivisión del ectodermo dorsal, la unión de Dpp y Scw a receptores serina/treonina kinasa Tipos I y II conduce a la fosforilación de Mad (Mothers-against-dpp) un factor de transcripción de la familia Smad. La forma fosforilada de Mad (pMad), forma un complejo con el co-activador conocido como Medea (Med), siendo ambos translocados al núcleo para activar la transcripción de un número indeterminado de genes blanco. Las evidencias acerca de la localización espacial de pMad revelan la formación de un gradiente de concentración del factor de transcripción con niveles máximos en las células localizadas en la región más dorsal del embrión disminuyendo de manera simétrica hacia las regiones laterales. El complejo pMad/Medea se une a módulos de regulación en cis (MRC) que contiene sitios bipartitos de una secuencia caracterizada por el patrón rico en GC y un patrón de unión del dominio NH1 GNCN. Este patrón es similar a la secuencia de unión para la familia Smad (SBE, smad binding elements) en vertebrados. Los genes regulados por la vía Dpp/pMad se expresan en dominios celulares centrados en la línea media dorsal del embrión y claramente correlacionados con el gradiente nuclear de pMad a lo largo del ectodermo dorsal, sugiriendo que la actividad pMad determina al menos tres umbrales de expresión. Cada uno de estos umbrales está definido por la expresión de uno o más genes que han sido clasificados como genes de umbral tipo I, II o III. Niveles máximos de pMad activan los genes de umbral tipo I zerknüllt (zen), Ance y pebbled (peb), que se expresan en 4-5 células en la región más dorsal del embrión. Los genes de umbral tipo II, u-shaped (ush) y tailup (tup), son activados en un dominio más amplio de 12 hasta 14 células en la región dorsal. Por otro lado, pannier (pnr) es el único representante de genes de umbral tipo III y se expresa en un dominio de 36-40 células. ¿Cúal es el mecanismo utilizado por estos genes para responder al gradiente de pMad?. El análisis de los MRCs de algunos de ellos ha permitido postular tres mecanismos alternativos. Primero, una composición de sitios de unión de Mad/Medea con afinidades relativas. Segundo, un balance entre señales de activación y represión transcripcional. Tercero, una interacción sinérgica de pMad/Medea, por ejemplo con el factor de transcripción Zen. zen es un gen de la familia homeobox, cuya expresión es activada por Mad/Medea. Durante los estados tempranos de la embriogénesis la expresión del gen zen está restringida a las 3-5 células más dorsales donde el gradiente de pMad muestra los niveles más altos de actividad y la actividad de su producto es esencial para la diferenciación de la amnioserosa. Las descripciones de los mecanismos empleados para interpretar la señal del gradiente de Dpp durante la diferenciación del ectodermo dorsal han sido realizadas en un número limitado de genes diana, por ello no es posible obtener conclusiones más específicas de cómo estos operan. Más aún, las estructuras de las regiones reguladoras en cis de distintos genes, necesitan ser comparadas y analizadas en el contexto de una red de regulación génica controlada por el morfógeno Dpp. En este proyecto, se diseñaron experimentos utilizando microarreglos que contienen el transcriptoma completo de D. melanogaster para identificar nuevos genes diana de la vía Dpp/pMad. Hemos medido los cambios de expresión entre muestras de ARNs extraídas de embriones silvestres y embriones con carencia y exceso de la función de Dpp. Paralelamente, se generó un mapa con las zonas que contienen grupos de motivos de unión de Mad como probables MRCs involucrados en los estadios tempranos del desarrollo de D. melanogaster. Estos resultados se integraron con datos de conservación de secuencias, siguiendo la huella filogenética y bases de datos de expresión in situ y logramos identificar los MRCs de tres genes (CG13653, CG12420 y CG8147) cuya expresión varía bajo las perturbaciones de la señal de Dpp. Finalmente, examinamos la funcionalidad in vivo de los MRCs en ensayos en líneas transgénicas con genes reporteros (lacZ). Finalmente, el análisis de nuestros resultados nos ha permitido generar un modelo que asimila e integra el conocimiento de los mecanismos por los cuales las células interpretan el gradiente de Dpp/Mad para ser traducidos en patrones estables del destino celular. Doctor en Biotecnología TERMINADA PFCHA-Becas 91p. PFCHA-Becas