Molecular characterization of the role of chromatin remodeling complexes in tumor progression

The mutational landscape of cancer has been robustly analyzed in the last decades using next-generation sequencing (NGS) allowing the identification of somatic mutations in several SWI/SNF chromatin remodeling complex subunits such as SMARCA4, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2 and PBRM1 in different tumor types. Several studies propose the modulation of specific transcriptional programs and defects in DNA repair mechanisms as potential explanations of the role of SWI/SNF complex alterations in the pathogenesis of cancer. The primary aim of this thesis is to determine which chromatin remodeling genes/complexes play an important role in tumor development, as well as to identify the molecular mechanisms and, finally, to determine if the alterations in these complexes can be used as diagnostic, prognostic or therapeutic tools to improve the management of cancer patients. We have performed target sequencing of 732 samples (479 tumors and 257 matched normal and 45 cell lines) from several human cancer types, using custom probes designed against the coding sequence of 250 genes including chromatin regulators as well as recurrently mutated cancer genes. Validation of the potential mutations found in the screening was assessed using high-coverage PCR-based ultrasequencing. Finally, proliferation, migration and invasion studies in vitro and in vivo were performed to validate the functional impact of some of the alterations in cancer cell lines. This comprehensive genomic analysis identified 4920 somatic mutations among all the samples studied. More than 800 of these mutations are located in the genes of the components of the four main ATP-dependent chromatin remodeling complexes (SWI/SNF, ISWI, CHD, and INO80). Interestingly, genomic alterations in chromatin remodelers (mainly SWI/SNF) appear to be mutually exclusive, indicating a functional redundancy for some of these genes. In addition, we identify new candidate genes who had not previously de-scribed as driver genes in cancer or have not been described in the tumor type in which they have been found in this study. These genes include ARID2, SRCAP, SMARCA5, CTCF, CHD4, SSX1, JHDM1D or SMAD4. We have tested the effect of ARID2 silencing on proliferation, migration and invasion studies in vitro and in vivo and we have identified the transcriptional alterations produced by this silencing. Furthermore, we have checked the effect of ARID2-deficiency on response to DNA damaging treatments like cisplatin or etoposide. We saw that ARID2-deficiency increased cell sensitivity to both cisplatin and etoposide evidenced by a lower IC50. Our results are in agreement with the notion that chromatin structure plays an important role in tumor progression and that some genes coding for components of ATP-dependent chromatin remodeling complexes are bona fide cancer driver genes essential for tumor development. We found evidence that alterations in these genes might be used as prognostic markers as well as biomarkers for patient stratification in the study of response to specific cancer treatments as is the case of ARID2 in lung cancer. ARID2 deficiency seems to exert a tumor suppressor role by two complementary mechanisms, firstly, generating a pro-tumoral transcriptional program in the cell and, subsequently, affecting the DNA repair mechanisms generating genetic instability. This dual role of ARID2 deficiency in cancer probably extends to other SWI/SNF subunits that could be independent of the function of the canonical SWI/SNF complexes. RESUMEN: En las últimas décadas, se ha analizado los patrones mutacionales del cáncer de manera robusta utilizando secuenciación de nueva generación (NGS). Esto ha permitido la identificación de mutaciones somáticas en varias subunidades del complejo SWI/SNF en diferentes tipos tumorales como SMARCA4, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2 y PBRM1. Varios estudios proponen que la modulación de programas transcripcionales específicos así como defectos en los mecanismos de reparación del ADN pueden explicar el papel de las alteraciones del complejo SWI/SNF en la progresión del cáncer. El objetivo principal de esta tesis es determinar qué genes/complejos juegan un papel importante en el desarrollo tumoral, así como identificar los mecanismos moleculares por los cuales los defectos en estos genes juegan un papel importante en el desarrollo tumoral y si, finalmente, estas alteraciones se pueden utilizar con valor diagnóstico, pronóstico o terapéutico para mejorar el manejo de los pacientes de cáncer. Hemos llevado a cabo la secuenciación dirigida de 732 muestras (479 tumores y 257 normales y 45 líneas celulares) de varios tipos de cáncer humano, utilizando sondas diseñadas específicamente contra la secuencia codificante de 250 genes que incluyen regula-dores de cromatina además de genes recurrentemente mutados en cáncer. La validación de algunas de las mutaciones encontradas se evaluó mediante PCR acoplada a secuenciación a alta cobertura. Finalmente, se realizaron estudios de proliferación, migración e invasión in vitro e in vivo para validar el impacto funcional de algunas de las alteraciones en líneas celulares tumorales. Este análisis genómico integral identificó 4920 mutaciones somáticas entre todas las muestras estudiadas. Más de 800 de estas mutaciones se encuentran en los genes de los componentes de los cuatro principales complejos de remodelación de cromatina dependientes de ATP (SWI/SNF, ISWI, CHD e INO80). Curiosamente, las alteraciones genómicas en los remodeladores de cromatina (principalmente SWI/SNF) parecen ser mutua-mente excluyentes, lo que indica una redundancia funcional en algunos de estos genes. Además, identificamos nuevos genes candidatos que no se habían postulado anterior-mente como implicados en cáncer o no han sido descritos como importantes en los subtipos en los que han sido encontrados en nuestro estudio. Estos genes incluyen ARID2, SRCAP, SMARCA5, CTCF, CHD4, SSX1, JHDM1D o SMAD4. Hemos comprobado el efecto del silenciamiento de ARID2 en proliferación, migración e invasión in vitro e in vivo. También hemos identificado las alteraciones transcripcionales resultado de la deficiencia en ARID2. Por último, hemos verificado el efecto de la deficiencia de ARID2 en la res-puesta a los tratamientos que dañan el ADN como el cisplatino o el etopósido observando que esta deficiencia aumenta la sensibilidad celular a ambos compuestos evidenciado por una IC50 más baja. Nuestros resultados concuerdan con la idea de que la estructura de la cromatina desempeña un papel importante en la progresión tumoral y que algunos genes que codifican componentes de los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP son genes esenciales para el desarrollo de tumores. Encontramos evidencia de que alteraciones en estos genes podrían usarse como marcadores de pronóstico y biomarcadores para la estratificación de pacientes en el estudio de la respuesta a tratamientos específicos contra el cáncer, como es el caso de ARID2 en el cáncer de pulmón. La deficiencia de ARID2 parece ejercer un papel de supresor tumoral mediante dos mecanismos complementarios, en primer lugar provocando un programa transcripcional pro-tumoral en la célula y en segundo lugar afectando a la reparación del ADN provocando inestabilidad genética. Este doble papel que parece jugar ARID2 en cáncer de pulmón probablemente sea extensivo a otras subunidades del complejo SWI/SNF y a su vez podría ser independientes de la función canónica de los complejos SWI/SNF. Esta tesis ha sido realizada en el Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (Santander) y una parte en el Francis Crick Institute (London). La financiación necesaria para la realización de esta Tesis doctoral ha sido aportada por: MInisterio de Economía y Competitividad a traves de los Proyectos del Plan Nacional: SAF2012-31627 y SAF2016-76758-R. La Fundacion Ramon Areces a traves del Proyecto: Proyecto de investigación de ciencias de la vida 2015: Caracterización molecular del papel de la disfunción mitocondrial en el desarrollo tumoral. European Research Council a través del proyecto ERC-2014-STG-637904 INTRAHETEROSEQ. El autor de esta tesis ha disfrutado de una Ayuda para contratos predoctorales para la formación de doctores 2013, referencia BES-2013-062983, concedida por el MInisterio de Economía y Competitividad, al igual que una Ayuda a la movilidad predoctoral para la realización de estancias breves en centro de I+D españoles y extranjeros de la convocatoria 2015, referencia EEBB-I-16-11749.