DDX47 and MECP2, two novel human functions controlling R-loop-mediated genome integrity

Tesis doctoral presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Departamento de Genética.--28-10-2021
La integridad del genoma es un requisito indispensable para la correcta transmisión de la información genética de una célula a su descendencia. De hecho, evolutivamente, nuestras células han desarrollado numerosos procesos que actúan de forma coordinada para evitar o resolver amenazas que puedan potencialmente comprometer la estabilidad del genoma. Tanto agentes genotóxicos externos como aquellos derivados del propio metabolismo celular procedentes de procesos básicos como la replicación, transcripción y recombinación pueden ser causantes de inestabilidad genómica. Generalmente, la inestabilidad del genoma se manifiesta en forma de mutaciones y reordenamientos cromosómicos, siendo incluso una característica asociada a predisposición a cáncer y envejecimiento. La transcripción es un proceso esencial para la proliferación y supervivencia celular que a su vez supone un riesgo para la integridad del genoma por diversos motivos. Como consecuencia de la transcripción tienen lugar cambios topológicos en el ADN que dan lugar a ADN de cadena sencilla, el cual es más susceptible a sufrir daños que el ADN de cadena doble. Además, la maquinaria de transcripción puede ser un obstáculo para otros procesos esenciales como la replicación, causando roturas en el ADN, recombinación y, en consecuencia, reordenaciones cromosómicas. Otra de las causas más estudiadas es la formación de bucles R (en inglés R loops), estructuras formadas por un híbrido de ARN-ADN y la cadena sencilla de ADN desplazada. La formación de estas estructuras tiene lugar durante la transcripción cuando el transcrito de ARN naciente invade hibridando con su hebra molde de ADN, desplazando así la hebra no transcrita como ADN de cadena sencilla. A pesar de que los R loops pueden desempeñar funciones en procesos fisiológicos actuando como estructuras intermediarias, se ha demostrado que pueden llegar a ser una amenaza para la expresión génica y la integridad del genoma. En esta tesis nos centramos en la búsqueda de nuevos factores que puedan estar implicados en la inestabilidad genómica dependiente de la formación de R loops.
Para ello, hemos llevado a cabo un escrutinio de alto rendimiento con microscopía de fluorescencia en células humanas con una colección de ARN interferentes dirigidos contra posibles genes diana de fármacos. Hemos empleado una línea celular especial que contiene un cassette para la expresión controlada de la enzima citidina deaminasa (AID) como herramienta para la detección indirecta de híbridos ARN-ADN combinada con la medida de daño en el ADN. Mediante esta aproximación hemos identificado 46 genes candidatos relacionados con procesos como transcripción, biogénesis del ARN, ciclo celular, degradación de proteínas y traducción, entre otros. Hemos llevado a cabo una caracterización en mayor detalle de 7 de los candidatos obtenidos para estudiar el posible efecto de su silenciamiento en la acumulación de R loops y daño en el ADN. Según los resultados obtenidos, decidimos centrarnos en dos factores con funciones diferentes: MeCP2, una proteína de unión a ADN metilado, y DDX47, una helicasa de ARN localizada en el nucléolo. El silenciamiento de MECP2 da lugar a un aumento de híbridos a nivel global en el nucleoplasma y en concreto, en genes con altos niveles de híbridos previamente descritos, así como en genes cuya expresión depende de MeCP2. El fenotipo de acumulación de bucles de ARN observado podría estar asociado al papel de MeCP2 en la regulación de la transcripción y en la condensación de la cromatina. Hemos estudiado en profundidad el papel de DDX47 en la homeostasis de los R loops y el efecto que tiene esta helicasa en la estabilidad del ADN. DDX47 se localiza fundamentalmente en el nucléolo y se recluta a la cromatina tanto en el locus del ADN ribosómico como en genes transcritos por la ARN polimerasa II (RNAPII). Esta unión a la cromatina es consistente con la acumulación de híbridos tanto en el ADN ribosómico como en genes transcritos por RNAPII. El silenciamiento de DDX47 produce una reducción del área total nucleolar, afecta parcialmente al reclutamiento de la ARN polimerasa I en el rDNA, y reduce drásticamente la transcripción en el nucléolo, sugiriendo un posible papel de esta helicasa nucleolar no sólo en el procesamiento del ARN sino también en la transcripción. Así mismo el silenciamiento de DDX47 está asociado a un incremento de las colisiones replicación-transcripción, lo cual podría contribuir a la inestabilidad genética observada. En colaboración con el laboratorio del Dr. Xue Xiaoyu en la Universidad de Yale, hemos descubierto que DDX47 es una helicasa de ARN-ADN capaz de resolver híbridos y estructuras R loops in vitro. En paralelo hemos demostrado que la sobreexpresión de DDX47 suprime fenotipos de acumulación de híbridos en células con niveles reducidos de factores previamente implicados en la prevención/resolución de estas estructuras. Nuestros resultados confirman que DDX47 es una helicasa conservada con capacidad para resolver híbridos ARN-DNA in vivo. Esta tesis nos ha permitido identificar a MECP2 y DDX47 como nuevos factores implicados en la homeostasis de los R loops y necesarios para prevenir la inestabilidad genómica dependiente de híbridos de ARN-DNA.