Biotecnología aplicada a la obtención de castaños resistentes a las enfermedades de la tinta y del chancro

[ES] Por vez primera se ha abordado el estudio de la sobre-expresión de los genes CsTL1 y CsCh3, aislados de castaño y que codifican una proteína tipo taumatina y una quitinasa, respectivamente, con el fin de regenerar plantas de castaño que muestren tolerancia o resistencia a las enfermedades de la tinta y del chancro, causadas por los hongos Phytophthora cinnamomi Rands, y Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr utilizando para ello la transformación genética de líneas embriogénicas de castaño europeo. Los genes se clonaron en el vector pK7WG2D que contiene el gen marcador de selección neomicina fosfotransferasa (nptII) y el gen reportero de la proteína verde fluorescente (gfp). La eficiencia de la transformación con el gen CsTL1 fue dependiente del genotipo y varió del 32,5% en la línea CI-9 al 7,1% en la línea CI-3. Se obtuvieron un total de 126 líneas independientes transformadas. También la eficacia de la transformación con el gen CsCh3 varío con el genotipo, alcanzando el 25,0% en la línea CI-9 y el 4,2% en la línea C12- H1, obteniéndose un total de 175 líneas transgénicas independientes. La presencia e integración de ambos genes en el ADN genómico se confirmó mediante PCR y Southern blot. Mediante qPCR se demostró que la expresión de CsTL1 fue 13.5 veces mayor en una línea transgénica comparada con su correspondiente línea no transformada. Se regeneraron plantas transgénicas de castaño después de las etapas de maduración y germinación de los embriones somáticos transformados. Las plantas completan su desarrollo en un invernadero específicamente diseñado para el crecimiento de plantas transgénicas y se han iniciado los ensayos de resistencia a las enfermedades de las plantas regeneradas
[EN] The availability of a system for direct transfer of anti fungal candidate genes into European chestnut (Castanea sativa) would offer an alternative approach to conventional breeding for production of chestnut trees tolerant to ink disease caused by Phytophthora spp. and blight disease caused by Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr. For the first time, a chestnut thaumatin-like protein gene (CsTL1) and a chitinase (CsCh3), both isolated from European chestnut cotyledons, have been overexpressed in three European chestnut somatic embryogenic lines. Transformation experiments have been performed using an Agrobacterium tumefaciens vector harbouring the nptII selectable and the green fluorescent protein (gfp) reporter genes. The transformation efficiency for CsTL1 was clearly genotype-dependent and ranged from 32.5% in the CI-9 line to the 7.1% in the CI-3 line. A total 126 independent transformed lines were obtained. A similar pattern has been recorded for CsCh3: 25.0% in the line CI-9 and 4.2% in the line C12-H1 and a total number of 175 transgenic lines were recorded. The presence and integration of chestnut genes in genomic DNA was confirmed by PCR and Southern blot analyses. qPCR revealed that CsTL1 expression was up to 13.5 fold higher in a transgenic line compared with its corresponding untransformed line. Transgenic plants were regenerated after maturation and germination of transformed somatic embryos which were acclimatized and grown in greenhouse. Analyses of tolerance/resistance to the fungal diseases on these plants are under way.