Rôle de la sénescence dans l'initiation des sarcomes secondaires survenant en territoire irradié

Radiotherapy is a major technique used in cancer treatment. It aims to cause the death of cancer cells,mainly through the induction of DNA Double-Strand Breaks (DSBs) and Single-Strand Breaks (SSBs).Paradoxically, radiotherapy is associated in rare cases with the occurrence of second cancers. Datafrom the literature show that these second cancers are mostly sarcoma which develop preferentiallyin the margin of the Planning Target Volume (PTV). This margin is composed of non-tumoral cells andis characterized by a low dose irradiation with a photon energy spectrum shifted towards lowerenergies. The first objective of my thesis project was to characterize the DNA damages encounteredby Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDFs) irradiated in the margin of the PTV. For that purpose,the team developed an experimental setting allowing the irradiation of NHDFs positioned in themargin of the PTV. By using this system, we observed that a fractionated irradiation protocolmimicking those commonly applied to patients induces an accumulation of SSBs in the margin,without inducing DSBs. This accumulation of SSBs was associated with a repair defect correlated witha decrease of PARP activity, an essential enzyme for SSB repair.The second objective was to study the effect of this SSB accumulation on NHDF outcome. For thispurpose, we followed the growth of NHDFs irradiated in the margin. Our results show that cellspositioned in the margin of an irradiated PTV underwent growth arrest. We measured their cell deathlevel and showed that NHDF irradiated in the margin of the PTV did not die. Then, we made thehypothesis of a senescence induction. Cell senescence is a cell cycle arrest state associated with along-term survival. By using different markers, we have shown that the NHDFs irradiated in the marginenter in premature senescence.The population of cells irradiated in the margin being heterogenous regarding the occurrence ofsenescence, we sorted fully senescent cells harbouring marked senescent markers and monitoredthem up for long time. We observed that a few of them were able to escape from the cell cycle arrestto give rise to proliferating daughter cells, harbouring mutations and invasive capacities. However, thexenografting of these cells in SCID mice did not induce tumoral development, suggesting that theseemerging cells are only pre-cancerous.By combining a hydrogen peroxide treatment with a PARP inhibitor (Veliparib), we have demonstratedthat an SSB induction is sufficient to induce NHDF senescence and escape from cell cycle arrestassociated to senescence.In vivo, we have confirmed part of these results. We have evidenced that SSBs are generated in thedermal cells of mice positioned in close contact with an irradiated phantom. Moreover, by performingpreliminary experiments with the p16-LUC mice model, we have some data, that have to beconfirmed, that senescence would be induced in mice positioned in close contact with a phantomirradiated with a protocol mimicking those commonly applied to patients.To conclude, these different results show that SSBs are induced in normal fibroblasts positioned atthe margin of a PTV and, consequently, that the cells enter in premature senescence. We have alsoshowed that a few of senescent cells can escape from the cell cycle arrest to give a rise to precancerousdaughter cells. We thus suggest that SSBs and senescence could play a role in thedevelopment of second sarcoma occurring in irradiated field.
La radiothérapie est une technique majeure dans le traitement contre le cancer. Elle a pour but d’induire la mort des cellules tumorales, principalement en générant des cassures double-brin (DSB) et simple-brin de l’ADN (SSB). Paradoxalement, la radiothérapie est associée dans de rares cas à la survenue de cancers secondaires. Les données de la littérature montrent que ces seconds cancers sont majoritairement des sarcomes et surviennent préférentiellement en marge du volume-cible planifié (PTV). Cette marge, composée de cellules non-tumorales, est caractérisée par une faible dose d’irradiation et un décalage du spectre d’énergie des particules ionisantes en faveur des énergies les plus faibles. Le premier objectif de ma thèse a été de caractériser les cassures de l’ADN induites dans des fibroblastes normaux de derme humain (NHDF) irradiés dans cette marge. Pour cela, l’équipe a mis en place un système expérimental permettant d’irradier des cellules positionnées en marge du PTV. En utilisant ce système expérimental, nous avons observé qu’un protocole de radiothérapie fractionnée induit une accumulation de SSB en marge du PTV, sans induire de DSB. Cette accumulation de SSB est associée à un défaut de réparation des SSB, corrélé à une baisse d’activité de la PARP, une enzyme essentielle de la voie de réparation des SSB.Le second objectif a été d’étudier les conséquences de cette accumulation de SSB sur les NHDF. Pour cela, nous avons suivi la croissance des cellules irradiées en marge. Nos résultats montrent que l’irradiation en marge induit un arrêt de croissance. Nous avons évalué la mort cellulaire et montré que les cellules irradiées en marge du PTV ne meurent pas. Nous avons alors testé l’hypothèse d’une induction de sénescence en marge du PTV. La sénescence cellulaire est un état d’arrêt du cycle cellulaire associé à une survie à long terme. Par l’utilisation de différents marqueurs, nous avons montré qu’une partie de la population des NHDF irradiés en marge entrait en sénescence. La population des cellules irradiées étant hétérogène du point de vue de la survenue de sénescence, nous avons trié les cellules présentant des marqueurs de sénescence très marqués et les avons suivis sur le long terme. Nous avons observé que certaines d’entre-elles étaient capables d’échapper de l’arrêt du cycle cellulaire associé à la sénescence pour donner naissance à des cellules filles proliférantes, invasives et mutées. Néanmoins, la xénogreffe de ces cellules dans des souris SCID n’a pas permis de développement tumoral, ce qui suggère que ces cellules sont seulement pré-cancéreuses.En combinant un traitement au peroxyde d’hydrogène combiné à un inhibiteur de PARP (le Véliparib), nous avons démontré que l’induction de SSB est suffisante pour induire la sénescence de NHDF et l’échappement de l’arrêt du cycle cellulaire associé à la sénescence. In vivo, nous avons confirmé une partie de ces résultats en mettant en évidence l’induction de foyers XRCC1 (marqueurs de SSB) dans le derme de souris irradiées en marge du PTV. De même, nos premières expériences, qui restent à reproduire, utilisant des souris p16-LUC mettent en évidence une induction de sénescence in vivo en marge du PTV.Ainsi, ces différents résultats montrent que des fibroblastes normaux placés en marge d’un PTV irradié par un protocole mimant une thérapie standard accumulent des SSB et entrent en sénescence prématurée. Certaines cellules sénescentes sont capables d’échapper de l’arrêt du cycle cellulaire pour donner naissance à des cellules filles pré-transformées.