Identificación de nuevas especies bacterianas aisladas de cuevas Españolas

La taxonomía es la ciencia que clasifica a los organismos y consta de tres áreas: la identificación, la nomenclatura y la clasificación. La identificación es la asignación de una bacteria como miembro de un taxón establecido o como una especie no descrita previamente, empleando para ello un esquema de clasificación determinado. La nomenclatura es la designación de nombres a los grupos taxonómicos según las reglas publicadas en el International Code of Nomenclature of Bacteria (ICNB) y descritas por el International Committee on Systematics of Prokaryotes (ICSP) (Lapage, 1992) quienes establecen las normas y recomendaciones para nombrar correctamente a los taxones. La clasificación es la disposición de los organismos en grupos o taxones en base a sus características genéticas y fenotípicas. La categoría taxonómica básica es la especie y su definición más aceptada es la de Rosselló-Mora y Aman (2001): ¿grupo de cepas de origen monofilético que se encuentran relacionadas desde el punto de vista fenotípico y genómico, y por tanto, se pueden diferenciar de otros grupos de organismos similares¿. La clasificación de los procariotas es reciente y dinámica, ya que debido a su pequeño tamaño no se conocieron hasta el siglo XVII gracias al desarrollo de la microscopía. Las primeras clasificaciones se basaban en las observaciones morfológicas, pero durante los siglos XIX y XX se desarrollaron otras técnicas, como las quimiotaxonómicas, bioquímicas y moleculares que contribuyeron a la mejora de la clasificación de los procariotas. Actualmente, también se utilizan técnicas como la genómica o la proteómica. Los microbiólogos han logrado un buen sistema de clasificación para la circunscripción de especie procariota, empleando para ello una gran variedad de metodologías basadas en pruebas genéticas y fenotípicas. Las cuevas y otros hábitats subterráneos son ecosistemas relativamente poco estudiados, donde es posible el aislamiento y descripción de nuevas especies. Las cuevas, en general, se caracterizan por ser ambientes oligotróficos, con escaso contenido en carbono orgánico, y temperatura y humedad constantes a lo largo del año. Además, frecuentemente las cuevas del hemisferio norte, presentan una baja temperatura y una humedad próxima a la saturación. Las condiciones oligotróficas, junto a la ausencia de luz en el interior de la cueva, originan un déficit de productores primarios. Por ello, los microorganismos que viven en ellas son principalmente quimiolitotróficos. Estos obtienen la energía mediante la ruptura de compuestos aromáticos complejos de la superficie, así como de la fijación de compuestos volátiles, dióxido de carbono y nitrógeno de la atmósfera, o también a partir de la oxidación de iones de metales reducidos de las rocas. Para realizar todas estas complejas reacciones los microorganismos establecen asociaciones mutualistas y cooperativas para poder sobrevivir en estos ambientes. Un ejemplo de ello, son las comunidades microbianas que forman las biopelículas (o colonizaciones) sobre las rocas y espeleotemas (Barton y Jurado, 2007). Además, los microorganismos están altamente especializados y son capaces de promover una gran variedad de procesos enzimáticos y de biomineralización como consecuencia de las condiciones nutricionales limitadas en las que viven (Cheeptham y Saiz-Jimenez, 2014). En la última década los estudios realizados en ambientes subterráneos han mostrado la existencia de taxones microbianos nuevos para la ciencia. Algunos autores han observado que las cuevas presentan un gran potencial como productores de nuevos compuestos bioactivos procedentes de su metabolismo secundario, tales como antibióticos, además, de sustancias con actividad antiviral, antitumoral, inmunológica y herbicida. Además, estos ambientes subterráneos constituyen un reservorio de bacterias potencialmente patógenas para el hombre, capaces de producir infecciones cutáneas, respiratorias y cerebrales. Sin embargo, la información disponible sobre casos clínicos producidos por microorganismos frecuentes en cuevas es escasa (Jurado y col., 2010). Uno de los casos mejor documentado es el de la bacteria descrita en la Cueva de Altamira Aureimonas altamirensis (Rathsack y col., 2011) responsable de diferentes enfermedades en Europa y América (Mendes y col., 2009; Téllez-Castillo y col., 2010; Schröttner y col., 2014). Todos estos estudios demuestran claramente el interés de aislar y describir nuevas especies de bacterias en cuevas y otros ambientes subterráneos. Para aislar nuevas especies bacterianas se estudiaron una serie de cuevas y la Mina Pepito, localizada en Nerva (Huelva). Las seleccionadas fueron tres cuevas kársticas de la Península Ibérica: Gruta de las Maravillas (Aracena, Huelva), Cueva del Tesoro (Rincón de la Victoria, Málaga) y Cueva de Altamira (Santillana del Mar, Cantabria) y dos cuevas de origen volcánico localizadas en las Islas Canarias: Cueva del Viento (Icod de los Vinos, Tenerife) y Cueva de la Falda de la Horqueta (La Palma). En esta Tesis Doctoral se obtuvieron 274 bacterias de las cuales 200 pertenecieron a las cuevas kársticas, 61 a las cuevas volcánicas y 13 a las escombreras de la Mina Pepito. Estas bacterias se distribuyeron principalmente en el filo Actinobacteria (51,10%), seguido de los filos Firmicutes (33,58%), Proteobacteria (14,60%) y Bacteroidetes (0,72%). El filo Actinobacteria, fue el más abundante en la mayoría de las cuevas estudiadas. Concretamente, en la Gruta de las Maravillas y en la Cueva de Altamira más de la mitad de las bacterias aisladas pertenecieron a este filo 52,38% y 61,82%, respectivamente. Por otro lado, el filo Firmicutes superó el 40% en tres de las cuevas estudiadas: Cueva del Tesoro, Cueva del Viento y Cueva de la Falda de la Horqueta. Como singularidad, en la Cueva del Viento, además de los tres filos anteriormente mencionados, se aislaron bacterias pertenecientes al filo Bacteroidetes. En las escombreras de la Mina Pepito, el filo Proteobacteria fue el grupo más numerosos constituyendo el 76,92% del total de las cepas aisladas. De todas las bacterias aisladas se han caracterizado y descrito cuatro nuevas especies, tres de ellas de la Gruta de las Maravillas con los nombres tentativos de Acidovorax cavernicola, Paracoccus onubensis y Paenibacillus aracenensis; y una en la Cueva del Tesoro con el nombre tentativo de Acinetobacter thesauricus. Además, se incluye la descripción enmendada de Sphingomonas aerophila, especie aislada de la Mina Pepito. Finalmente, se exponen estudios parciales de algunas cepas que podrían ser interesantes para futuros estudios taxonómicos y su descripción como nuevas especies. Los estudios realizados en las cinco cuevas y la escombrera de la Mina Pepito muestran que los ambientes subterráneos permiten el aislamiento y la descripción de nuevas bacterias, confirmando que son ecosistemas poco estudiados desde el punto de vista taxonómico y con un gran potencial para describir especies desconocidas para la ciencia. CONCLUSIONES 1.- Se han seleccionado cinco cuevas ubicadas en el norte y sur de España y en el Archipiélago Canario: Gruta de las Maravillas (Aracena, Huelva); Cueva del Tesoro (Rincón de la Victoria, Málaga); Cueva de Altamira (Santillana del Mar, Cantabria); Cueva de la Falda de la Horqueta (La Palma, Canarias); Cueva del Viento (Tenerife, Canarias) y la escombrera de la Mina Pepito de Nerva (Huelva) con el fin de aislar e identificar nuevas bacterias. Se obtuvieron un total de 274 bacterias, 200 de cuevas kársticas, 61 de cuevas volcánica y 13 de la escombrera de la mina de manganeso. La mayoría de las bacterias se encontraban incluidas en el filo Actinobacteria (51,10%), seguido del filo Firmicutes (33,21%), Proteobacteria (14,96%) y Bacteroidetes (0,73%). 2.- De los estudios quimiotaxonómicos y moleculares se dedujo la existencia de un apreciable número de bacterias que representan especies nuevas para la ciencia. En esta Tesis Doctoral se describen las siguientes especies: Paenibacillus aracenesis, Paracoccus onubensis y Acidovorax cavernicola, las tres aisladas de la Gruta de las Maravillas y Acinetobacter thesauricus, aislada de la Cueva del Tesoro. 3.- También se aisló una cepa de Sphingomonas, aislada de la mima de manganeso Pepito, que inicialmente representaba una nueva especie. Sin embargo, en la fase de redacción de esta Tesis, otros autores describieron la especie Sphingomonas aerophila, coincidente con nuestra cepa, lo que impide la descripción de esta cepa como nueva especie. 4.- Se han aislado nueve cepas más, que se encuentran actualmente en estudio. Su descripción se realizará en un futuro, aunque se incluyen datos parciales que sugieren que pudieran constituir nuevas especies y se describen a continuación. 5.- Una cepa, aislada de la Cueva de Altamira, pudiera representar un género nuevo, ya que presentó un porcentaje de similitud del 93,62% con la especie Flindersiella endophytica y de 92,37% con Thermasporomyces composti, y en el árbol filogenético se distanciaba de ellas. 6.- De la gruta de las Maravillas se aisló una cepa con un 98,17% de similitud con Ornithibacillus contaminans y 97,54% con Oceanobacillus profundus, con las que presenta grandes diferencias tanto en las condiciones de crecimiento como en la asimilación de compuestos y sobre todo en los patrones de amplificación aleatoria de fragmentos polimórficos y perfiles de ácidos grasos. Todo ello sugiere que podría tratarse de un género nuevo. De la misma cueva se aisló una cepa con un porcentaje de similitud del 97,34% respecto a Bhargavaea ullalensis. El árbol filogenético la sitúa cerca de Bhargavaea ginsengi, con quien tiene una similitud del 96,33%. 7.- En la Cueva del Tesoro se aisló una cepa cuyo estudio de la secuencia del gen del ARNr 16S la situó en el género Citricoccus, con un porcentaje de similitud del 98,25% con Citricoccus zhacaiensis, aunque distante en el árbol filogenético. 8.- En la Cueva de la Falda de la Horqueta se aislaron dos cepas de Paenibacillus, con un porcentaje de similitud del 97,56% y 97,54%, respectivamente, con Paenibacillus pectinilyticus, y una cepa con un 97,11% de similitud con Domibacillus robiginosus. 9.- En la Cueva del Viento se aisló una cepa relacionada con el género Flavihumibacter y la especie Flavihumibacter cheonanensis (98,57% de similitud), y otra con el género Chryseobacterium y la especie Chryseobacterium tructae (98,05% de similitud). 10.- Los estudios efectuados en la cuevas y la escombrera de la mina muestran que los ambientes subterráneos permiten el aislamiento y descripción de bacterias, confirmando que son ecosistemas poco estudiados desde el punto de vista taxonómico y con un gran potencial para describir especies nuevas para la ciencia.