Cytotoxic and antitumoral effect of Ceratonia siliqua l.(Harnup) extract

Harnup (Cerotonia siliqua L.) halk arasında sağlık alanında çeşitli kullanımları olan bir bitkidir. Bu çalışma kapsamında, harnup meyve ekstraktı, harnup pekmezi ve harnup özü formunun adenokarsinomik insan alveolar bazal epitel hücresi (A549) ve fare adipoz doku kökenli fibroblast (L929/R) hücrelerinde, toksisite ve nekroz/apoptoz etkileri değerlendirildi. Bu amaçla MTT ve DOUBLE STAİNİNG protokolüne göre uygun besiyerleri oluşturularak hazırlanan A549 VE L929 hücreleri tripan mavisi ile boyandıktan sonra sayılan hücreler; kuyucuk başına 10.000 hücre düşecek şekilde 48 well-plate'de kültüre edildi. Üzerlerine L929 ve A549 için %10 fötal bovine serum, % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) eklendi. Hücreler 37 °C de % 5 CO2'li inkübatörde 24 saat inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyonun ardından keçiboynuzu pekmezi ve özü 1/10,1/20,1/40 oranlarındaki farklı seyreltmelerle 3 farklı konsantrasyon ve 5 farklı doz olarak uygulandı. Yine aynı şekilde 24 saat önceden ekstrakte edilen harnup meyvesi 5 farklı doz olarak uygulandı. 24 saat inkübasyondan sonra plakaların içindeki vasat atıldı ve her bir kuyucuk başına 100 μl fenol kırmızısı besiyeri ve 50 μl MTT solüsyonundan eklendi. Solüsyon eklendikten sonra 2 saat etüvde bekletildi. 2 saatin sonunda MTT solüsyonu çekilip üzerine 100 µl izopropanol eklenip ELİSA okuyucuda 570 nm'de okutularak toksisite sonuçlarına bakıldı. Elde edilen sonuçlara göre; harnup ekstraktının uygulanan dozlarda hem L929 hücrelere hem de A549 hücrelerine karşı toksik etki göstermediği tespit edildi. L929 ve A549 hücrelerine harnup pekmezi ve özü direk uygulandığında yüksek oranda toksisiteye sebep olduğu görülmüştür. Bu nedenle 1/10, 1/20 ve 1/40 oranında seyreltilerek elde edilen solüsyonlar 200 μg/ml konsantrasyona kadar hücrelere uygulanmıştır. Sonuçlara göre seyrelme oranı arttıkça, toksisitenin her üç formda da düştüğü gözlendi. İkili boyama protokolünde ise apoptoz/nekroz sonuçlarına bakılmıştır. Sonuçlara göre gerek L929 hücrelerde gerekse A549 hücrelerinde nekrotik ölüm apoptotik ölüme göre daha yüksek oranda olduğu tespit edilmiştir. Özellikle harnup ekstraktında apoptoz yok denecek kadar düşük olduğu görülmüştür. Pekmez ve özünde apoptoz oranları birbirine yakın elde edilmiştir. Ayrıca nekroz oranı yine seyrelme oranına ve uygulanan doza bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. Yüksek oranlarda, nekroz yüksek olarak bulunurken, oran düştükçe nekrozun azaldığı görülmüştür. L929 fibroblast hücrelerinde apoptoz oranının A549 kanser hücrelerine göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Harnup, ülkemiz şartlarında kolay yetiştirilebilen ve işlenebilen bir bitkidir. Çalışma kapsamında akciğer kanser hücrelerine yönelik etkileri de dikkate alınarak söz konusu bitkinin; tedavi ile uygulamalarda alternatif bir yaklaşım olarak ifade edilebileceği sonucuna ulaşılmıştır. Carob (Cerotonia siliqua L.) is a plant with various uses in the field of health among the public. The aim of this study was to evaluate the potential toxic, necrotic/apoptotic effects of carob (Cerotonia siliqua L.) fruit extract, syrup and essence on adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (A549) and mouse adipose tissue derived fibroblast (L929) cells. For this purpose, in our MTT and DOUBLE STAİNİNG protocol experiments; A549 and L929 cells were prepared by forming suitable media, stained with trypan blue and seeded in 48 well-plate at 10,000 cellsper well. DMEM (containing 10% foetalbovine serum and 1% penicillin / streptomycin) were used for both cell cultures. The cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO2 incubator for 24 hours. After 24 hours of incubation the carob syrup and essence; It was applied in 3 different concentrations and 5 different doses with 1/10, 1/20 and 1/40 different dilutions. In the same way, the extract of the carob extract, which was extracted 24 hours in advance, was applied at 5 different doses. After 24 hours of incubation, the residue in the plates was discarded and 100μl of phenol red and 50μl of MTT solution were added per well. After the solution was added, it was kept in the oven for 2 hours. After 2 hours, MTT solution was withdrawn, 100μl isopropanol was added and the ELISA reader was studied at 570 nm and toxicity results were examined. According to the results carob extract were not found to be toxic against both L929 cells and A549 cells at administered doses. High degree of toxicity was detected in L929 and A549 cells which carob syrup and essence were directly applied. Therefore, solutions obtained by diluting 1/10, 1/20 and 1/40 were applied to the cells up to a concentration of 200μg/ml. According to the results, as the dilution rate increased, the toxicity was observed to decrease in all three forms. Apoptosis / necrosis results were evaluated in the double staining protocol. According to the results, necrotic death in both L929 cells and A549 cells was higher than apoptotic death. Apoptosis in the carob extract were found to be especially low. In syrup and in essence, apoptosis ratios were found to be close to each other. In addition, the rate of necrosis was observed to vary depending on the dilution rate and the dose administered. In high doses, necrosis was found to be high, and necrosis was found to be decreased as it fell. The ratio of apoptosis in L929 cells was higher than that of A549 cells. Carob is a plant that can be easily cultivated and processed under the conditions of our country. Within the scope of the study, taking into consideration the effects on lung cancer cells; It can be expressed as an alternative approach in treatment with applications. 68