Evaluación de distintos métodos y condiciones de preservación de microbiota fecal viable

Trabajo presentado en la 11ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas (RedBAL), celebrada en Gijón (Asturias, España) del 28 al 30 de Junio de 2017
[Introducción] Actualmente existe muy poca información acerca del efecto de la congelación sobre la viabilidad de la microbiota fecal, y hasta la fecha, no se ha realizado ninguna investigación para determinar las condiciones y compuestos más adecuados para criopreservar y maximizar la viabilidad microbiana durante la conservación de esta microbiota. La preservación de muestras complejas de microbiota puede ser de utilidad para recuperar microorganismos de interés, así como ahondar en estudios de microbiota intestinal mediante el empleo de modelos in vitro e in vivo sin necesidad de depender de muestras fecales frescas. [Objetivos] En el presente trabajo se analizó el papel de distintos criopreservantes y condiciones de congelación en muestras de microbiota intestinal extraída de heces, evaluándose el mantenimiento de la viabilidad y recuperación de la microbiota en su conjunto, así como de distintas poblaciones representativas a los 3 meses de su preservación. [Materiales y Métodos] A partir de 5 muestras de heces de donantes voluntarios sanos se obtuvo la microbiota fecal mediante un procedimiento de separación en gradiente de densidad por ultracentrifugación previamente descrito (Hevia y cols., 2015). Las muestras, procesadas en una estación de trabajo en anaerobiosis, se alicuotaron y se guardaron congeladas bajo 4 condiciones experimentales: A) en presencia de glicerol al 15% a -20°C; B) con glicerol al 20% a -80°C; C) con sacarosa al 10% a -80°C y D) con polietilenglicol (PEG) al 20% a -196°C. Se evaluó la viabilidad de la microbiota extraída antes y después de ser preservada mediante recuentos en placa en distintos medios, microscopia de fluorescencia (kit ¿Live/Dead BacLight¿) y mediante qPCR usando monoazida de propidio (PMA) para la detección de células no dañadas. [Resultados] Al comparar de forma global las cuatro condiciones de preservación se observó una diferencia significativa entre las distintas condiciones en cuanto a la reducción de los recuentos en placa, con una mayor pérdida cuando la microbiota extraída es preservada en glicerol y menor cuando la congelación se realizó a -196°C. El conteo total de células vivas mediante microscopia después de la conservación reveló reducciones de en torno a una unidad logarítmica con un mayor porcentaje de células vivas tras la congelación en nitrógeno líquido, en concordancia con los resultados de cultivo. El análisis por qPCR, previo tratamiento con PMA, de distintos grupos microbianos mostró variaciones en función de las muestras procedentes de los distintos donantes. Para las bifidobacterias y el grupo de Clostridium XIVa se observaron mayores diferencias entre las condiciones de preservación, con mayores niveles cuantificados en presencia de PEG a -196°C. [Conclusiones] Aunque es preciso ampliar con más muestras y analizar la viabilidad tras periodos de tiempo más largo de conservación, los resultados obtenidos muestran una mejor preservación de la microbiota fecal en su conjunto a temperaturas ultrabajas.
Proyecto I+D+I para jóvenes investigadores MINECO (Ref: BIO2014-55019-JIN).