Methylglyoxal (MGO) elicits a heat-shock response in ARPE- 19 cells

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra O metilglioxal (MGO) é um metabolito dicarbonil altamente reactivo que se forma principalmente a partir da glicólise. Este composto constitui um dos principais precurso-res dos produtos finais avançados de glicação (AGEs – sigla inglesa), uma vez que rea-ge com proteínas, nucleótidos e lípidos, alterando a sua estrutura e função. O papel do MGO, assim como dos AGEs seus derivados, nas alterações deletérias sofridas por células e tecidos, tem sido extensivamente abordado nas últimas décadas. A acumulação de ambos os produtos contribui não só para o envelhecimento, mas também para uma série de doenças que incluem a diabetes mellitus (DM). No entanto, pouco se sabe acer-ca do efeito do MGO nas vias de controlo de qualidade proteica, bem como acerca da forma como as células respondem ao insulto tóxico resultante do MGO. Este estudo focou-se no efeito do MGO na resposta heat-shock. Esta via de respos-ta ao stress é mediada por chaperonas moleculares designadas heat-shock proteins (Hsps), que são capazes de reconhecer proteínas desnaturadas/modificadas e de promo-ver o seu enrolamento. Alternativamente, as Hsps podem enviar as proteínas irreversi-velmente modificadas para degradação no proteasoma, numa forma dependente da liga-se de ubiquitina CHIP. Com este trabalho, mostramos que o tratamento de células ARPE-19 com MGO resulta na activação do factor de transcrição heat-shock factor (Hsf-1), o principal regu-lador da resposta heat-shock. Além disso, demonstramos que o stress induzido por MGO conduz a um decréscimo de algumas Hsps, seguido por um aumento da expressão destas chaperonas, e que este decréscimo inicial é prevenido pela sobrexpressão do Hsf-1. Esta resposta heat-shock induzida pelo MGO coincide com um aumento da viabilida-de celular e com uma diminuição dos níveis totais de proteínas ubiquitinadas.Os dados obtidos sugerem que o MGO compromete o controlo de qualidade protei-ca dependente de chaperonas moleculares, levando a uma acumulação de substratos ubiquitinados e a um decréscimo da viabilidade celular. Contudo, estas modificações produzidas pelo MGO desencadeiam uma resposta mediada pelo Hsf-1, essencial ao restabelecimento da homeostase celular. Methylglyoxal (MGO) is a highly reactive dicarbonyl metabolite that forms mainly during glycolysis. MGO constitutes a major precursor of advanced glycation-end prod-ucts (AGEs) since it reacts with proteins, nucleotides and lipids, disrupting their struc-ture and function. Both MGO and MGO-induced AGEs have important toxic effects in cells and tissues. Indeed, these products are known to accumulate and contribute to age-ing, as well as to a number of diseases, including diabetes mellitus (DM). Nonetheless, very little is known on the effect of MGO on cell protein quality control system and on cell response to MGO. In this study we focus on the effect of MGO on the heat-shock response. This stress-pathway is mediated by stress-inducible molecular chaperones called heat-shock proteins (Hsps), which bind to denatured/modified proteins and assist their proper folding/refolding. Alternatively, Hsps can deliver fatally damaged proteins to the proteasome in a process that requires binding to the carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP). Herein, we show that MGO treatment in ARPE-19 results in the activation of heat-shock factor 1 (Hsf-1), the master regulator of heat-shock response, by increasing oli-gomerization, decreasing interaction with Hsp90 and increasing translocation to the nucleus. We further show that MGO-induced stress leads to a decrease in levels of sev-eral Hsps, which is followed by an increase in the expression of these chaperones. Moreover, we show that the initial decrease in Hsps levels can be counteracted by over-expressing Hsf-1. We further show that the delayed heat-shock response induced by MGO is concomitant with an increase in cell viability and a decrease in the total levels of ubiquitin conjugates. The data presented in this work suggests that MGO impairs the protein quality con-trol by a mechanism that is dependent on molecular chaperones and leads to accumula-tion of ubiquitinated substrates and to a decrease in cell viability. However, these MGO-induced changes appear to elicit a response mediated by Hsf-1, which is crucial to help cells to cope with stress conditions and to re-establish homeostasis.