SUMO a la retina: expressió gènica i rellevància en la modificació posttaducciontal del factor de transcripció NRE3

La sumoïlació és una modificació posttraduccional (PTM) que consisteix en la conjugació covalent i reversible d’una proteïna SUMO (Small ubiquitin-like modifier) al residu lisina d’una proteïna diana. Igual que la ubiquitina, el cicle metabòlic de SUMO consta d’una conjugació, on hi participen tres tipus diferents d’enzims (E1 activadors, E2 conjugadors i E3 lligases), i d’una deconjugació, que es dóna a través de l’acció de proteases. A nivell funcional, la sumoïlació regula processos cel·lulars tan diversos com la replicació, la reparació del DNA, la localització, activitat i degradació de proteïnes, o la transcripció, entre d’altres. Els estudis existents sobre la sumoïlació se centraven en la modificació de proteïnes diana concretes, pel que mancaven estudis de la interdependència dels elements de la maquinària de SUMO en la regulació i el manteniments de teixits especialitzats. Un d’aquests teixits és la retina, que recobreix l’ull per la seva cara interna i s’encarrega de la captació i el processat de l’estímul lumínic. Forma part del sistema nerviós central, pel que es tracta de teixit neuronal, format per tres capes nuclears de neurones i les seves connexions. Les cèl·lules encarregades d’iniciar la cadena de la fototransducció són els fotoreceptors: cons i bastons; que comparteixen una mateixa estructura, i que difereixen en els fotopigments que hi contenen, fet que els dóna diferents funcionalitats lumíniques. Per aquest motiu, un dels objectius d’aquesta tesi va ser l’estudi de l’expressió dels gens de la via de SUMO a la retina de ratolí adult, per mitjà de la seva quantificació per RT-qPCR i de la seva localització en talls de retina per hibridació in situ. Es van detectar l’expressió de tots els gens de la maquinària de SUMO, amb nivells variables en concordança amb la seva importància dins del cicle. . A més, atès que la llum és un dels marcadors externs que controlen els ritmes circadiaris de l’organisme, es va estudiar l’expressió dels gens de la via de SUMO en diferents condicions del cicle de llum/foscor, detectant alguns patrons diferencials d’entre el conjunt de gens estudiats. Pel que fa a la localització de l’expressió, els gens de la via de SUMO van donar diferents patrons de localització a les diverses capes de la retina, coincidint tots a la capa de fotoreceptors. A continuació, es va estudiar la sumoïlació del factor de transcripció (TF) de fotoreceptors NR2E3, que juga un paper central en el desenvolupament i manteniment dels bastons, activant els gens específics de bastons i silenciant els de cons. Aquesta repressió està regulada, en part, per la seva sumoïlació a través de la E3 lligasa PIAS3, tot i que aquesta no és la única que modificava el TF. En aquest context, es va plantejar l’estudi de noves interaccions del TF amb altres E3 lligases de SUMO. Per mitjà de la tècnica de BRET es va poder trobar una nova interacció amb HDAC4, posteriorment confirmada per CoIP. A més, l’estudi comparatiu de la forma humana d’NR2E3 WT amb el seu mutant no sumoïlable (123) va permetre detectar diferències d’interacció amb PIAS3, més baixa amb el TF mutant. D’altra banda, la tècnica del BioID va permetre el descobriment d’una segona interacció amb una E3 lligasa de SUMO: CBX4. Per últim, amb la comparació de les formes WT i no sumoïlable d’NR2E3 es va detectar una nova conjugació de SUMO amb el TF, que no es veia alterada per cap de les E3 lligases descrites com a interactores. En conjunt, aquest treball demostra la importància de la sumoïlació en la regulació i el manteniment de teixits i tipus cel·lulars, com ho són la retina i els fotoreceptors.
Sumoylation is a reversible post-translational modification that regulates different cellular processes by conjugation/deconjugation of SUMO moieties to target proteins. Most work on the functional relevance of SUMO has focused on cell cycle, DNA repair and cancer in cultured cells, but data on the inter-dependence of separate components of the SUMO pathway in highly specialized tissues, such as the retina, is still scanty. Nonetheless, several retinal transcription factors (TFs) relevant for cone and rod fate, as well as some circadian rhythm regulators, are regulated by sumoylation. Here we present a comprehensive survey of SUMO pathway gene expression in the murine retina by quantitative RT-qPCR and in situ hybridization (ISH). The mRNA expression levels were quantified in retinas obtained under four different light/dark conditions, revealing distinct levels of gene expression. In addition, a SUMO pathway retinal gene atlas based on the mRNA expression pattern was drawn. Although most genes are ubiquitously expressed, some patterns could be defined in a first step to determine its biological significance and interdependence. On the other hand, the orphan nuclear receptor NR2E3 is a retinal transcription factor (TF) that plays an essential role in the development and maintenance of rod photoreceptors by both activating rod-specific and repressing cone-specific genes. This repression is partially regulated by the E3 SUMO ligase PIAS3, which sumoylates NR2E3 in three specific –and evolutionarily conserved– lysine residues, turning it into a transcriptional repressor. However, PIAS3 is not the unique E3 SUMO ligase acting upon this TF. In this context, we aimed to find new interactions with other E3 SUMO ligases in order to elucidate the relevance of this post-translational modification in regulating the function of NR2E3. Two new interactions with the E3 SUMO ligase HDAC4 and CBX4 were discovered. In addition, the nonsumoylable mutant NR2E3 123 showed a diminished interaction with PIAS3 in comparison to the wild-type (and sumoylable) NR2E3 (WT). Moreover, we detected a new SUMO-conjugated NR2E3 form not detectable in NR2E3 123, although neither PIAS3, CBX4 nor HDAC4 seem to participate in this SUMO conjugation. Although the physiological role of these newly found interactions is still unknown, they provide new insights in the regulation of the transcriptional activity of this retinal TF by SUMO modification.