Avaliação da pureza das sub-populações celulares linfocitárias para monitorização do quimerismo nos doentes pós-transplante hematopoiético

Dissertação de Mestrado em Bioquímica Nos doentes submetidos a transplante hematopoiético alogénico, a monitorização do quimerismo é importante na avaliação do sucesso do transplante. A análise de quimerismo nas diferentes sub-populações linfocitárias possibilita a monitorização em linhagens específicas, podendo estar dependente da pureza das células isoladas. A pureza das sub-populações celulares pode ser avaliada por técnicas moleculares ou por citometria de fluxo. Recentemente foram desenvolvidos kits baseados em técnicas de biologia molecular, tal como o Non-T Genomic Detection Kit e o Non-B Genomic Detection Kit da Accumol, que detetam a presença de ácido desoxirribonucleico (ADN) de células contaminantes em amostras de ácido desoxirribonucleico genómico de linfócitos T ou B isolados. Este estudo teve como objetivo avaliar a pureza das sub-populações linfocitárias, T e B, importantes na monitorização do quimerismo. As amostras de linfócitos T e B foram isoladas por meios imunomagnéticos, separação direta e separação sequencial, procedendo-se de seguida à extração de ácido desoxirribonucleico. A amplificação dos Short Tandem Repeats foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase multiplex e os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese capilar. Na avaliação da pureza por citometria de fluxo os anticorpos utilizados na marcação foram CD45+, CD3+ e CD19+, os resultados foram analisados com o software Navios. A avaliação da pureza com o kit Accumol realizou-se nas amostras extraídas anteriormente para o estudo do quimerismo, de seguida amplificaram-se os fragmentos por reação em cadeia da polimerase e respetiva separação por eletroforese capilar, a análise foi efetuada no software GeneMapper. No presente estudo, foram analisadas 31 amostras provenientes de doentes alo-transplantados. No isolamento de linfócitos T por separação direta, 53% das amostras apresentaram contagem absoluta de células ≥400 células/μL e pureza >90%. Após o isolamento direto de linfócitos B, não foram obtidas amostras com contagens absolutas de células ≥400 células/μL e purezas >90%. No isolamento por separação sequencial, verificou-se contagem absoluta de células ≥400 células/μL e pureza >90% em 77% das amostras de linfócitos T e em 8% amostras de linfócitos B. A maioria das amostras de linfócitos T com quimerismo completo e misto, apresentaram pureza >90%. Nos linfócitos B, com quimerismo completo e quimerismo misto, a percentagem da pureza foi variável. Com este estudo, pode-se concluir que com contagens linfocitárias ≥0,5x103/μL no sangue periférico é possível obter uma contagem absoluta de células ≥400 células/μL, assim como valores de pureza >90%, principalmente no isolamento de sub-populações de linfócitos T. O mesmo não se verificou nas amostras de linfócitos B, pois a maioria não atingiu valores de contagem absoluta de células ≥400 células/μL e de pureza >90%. Para o isolamento de linfócitos T e B numa amostra de sangue, a separação sequencial apresentou melhores resultados na obtenção de amostras com contagem absoluta de células ≥400 células/μL e de pureza >90%. In patients submitted to allogeneic stem cell transplantation, the monitoring of chimerism is important for determining the success of the transplant. The chimerism analysis on different lymphocyte subpopulations enables the monitoring of specific lines and may be dependent on the purity of the isolated cells. The purity of the cellular subpopulations can be evaluated by molecular techniques or by flow cytometry. It has been recently been developed kits based on molecular biology techniques, such as Accumol’s Non-T Genomic Detection Kit and Non-B Genomic Detection Kit, which detect the presence of deoxyribonucleic acid from contaminating cells in samples of genomic deoxyribonucleic acid from isolated T and B lymphocytes. The aim of this study was to evaluate the purity of the lymphocyte subpopulations, T and B, used in the monitoring of chimerism. Before evaluation of purity, samples of T and B lymphocytes were isolated by immunomagnetic means, direct separation and sequential separation, then proceeding to the extraction of deoxyribonucleic acid. Amplification of short tandem repeats following multiplex polymerase chain reaction technique, the amplified fragments were separated by capillary electrophoresis. The assessment of purity by flow cytometry, the antibodies used in labeling were CD45+, CD3+ and CD19+, the results were analyzed with software Navios. Assessment of purity with Accumol kit was performed after amplification of the polymerase chain reaction fragments and respective separation by capillary electrophoresis, analysis was performed on the GeneMapper software. In this study we analyzed samples from 31 allotransplant patients. In the isolation of T lymphocytes by direct separation, 53% of the samples had an absolute cell count ≥400 cells/μL and purity >90%. In direct separation of B cells it was not obtained any sample with absolute cell count ≥400 cells/μL and purity >90%. In isolation by sequential separation, there was an absolute cell count ≥400 cells/μL and purity >90% in 77% of T lymphocytes samples, and 8% of B lymphocytes samples. The majority of T-cell samples showing complete or mixed chimerism had purity >90%. The B lymphocytes samples with complete and mixed chimerism, the percentage of purity was variable. With this study it can be concluded that with lymphocyte counts ≥0,5x103/μL in peripheral blood it is possible to obtain an absolute cell count ≥400 cells/μL, as well as purity values >90%, especially in the isolation of sub-population of T lymphocyte. The same was not observed in B lymphocyte samples, the majority did not reach the target values of cells ≥400 cells/μL and purity >90%. Even for isolation in the same sample of T and B lymphocytes, sequential separation showed better results in obtaining samples with absolute cell count ≥400 cells/μL and of >90% purity.