Identifikacija mikroorganizama iz urina genomskom i proteomskom analizom

Infekcije mokraćnoga sustava (IMS) jedne su od najčešćih bakterijskih infekcija, posebice u žena. U identifikaciji mikroorganizama koji su njihovi uzročnici najčešće se koriste klasične medicinsko-mikrobiološke metode. One obuhvaćaju postupke uzgoja mikroorganizama, njihovu identifikaciju i testiranje osjetljivosti na antimikrobne lijekove. Glavni nedostatak tih metoda jest vrijeme potrebno za sve navedene postupke, stoga se u kliničkoj praksi najčešće započinje s antibiotskom terapijom širokoga spektra, a tek se naknadno terapija mijenja u specifičnu antimikrobnu terapiju, ako je prema mikrobiološkoj analizi indicirana. Upravo iz tih razloga kontinuirano se istražuju mogućnosti bržih i učinkovitijih postupaka za određivanje broja i vrste mikroorganizama te njihove osjetljivosti na antibiotike, u slučaju bakterijskih infekcija. U ovom doktorskom radu istraživane su mogućnosti uporabe masene spektrometrije (MS) i sekvenciranja gena za 16S rRNA u svrhu identifikacije bakterija iz mokraće. Za identifikaciju mikroorganizama izoliranih iz mokraće pacijenata sa simptomima cistitisa, kao kontrola koristila se klasična mikrobiološka dijagnostika uzgoja na hranjivim podlogama nakon koje se na istim uzorcima provodila analiza mikrobioma i metaproteoma. Analiza mikrobioma obuhvaćala je identifikaciju gena za 16S rRNA specifične za vrstu i genus, dok se analizom metaproteoma provedenoga na MALDITOF MS/MS (engl. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight tandem Mass Spectrometry) pokušala postići rezolucija na nivou soja. MALDI-TOF MS/MS je tandemna masena spektroemetrija kod koje se ionizacija makromolekula postiže laserskom desorpcijom i ionizacijom pomognutom matricom (MALDI), a za identifikaciju makromolekula koristi se analizator vremena leta (TOF). Uz pomoć spektrometrije masa generirani su karakteristični spektri te potom i karakteristični profili peptida („otisak prsta“) za mikroorganizme, koji se nalaze u mokraći. Pretpostavlja se da iako srodni mikroorganizmi mogu dijeliti pojedinačno iste proteine, svaki mikrorganizam ima više od jedne kombinacije peptida koja ga jednoznačno određuje, što vrijedi i u slučaju vrlo srodnih sojeva. U svrhu ovog istraživanja prikupljen je reprezentativan uzorak čija je razdioba uzročnika IMS-a uzoraka s >105 CFU/ml slijedila prethodno objavljene literaturne podatke. Postotak sterilnih urinokultura (UK) bio je značajno niži od literaturnih podataka, što pripisujemo profilu pacijenata tercijarne zdravstvene zaštite. Proces identifikacije mikroorganizama iz uzorka nativne mokraće, MALDI- TOF metodom, značajno je ovisio o predanalitičkim i analitičkim procesima poput uvjeta skladištenja uzoraka, te optimizaciji postupaka liziranja bakterija, izolacije bakterijske biomase, kao i pročišćavanja, frakcioniranja i digestiji izoliranih proteina. Metaproteomska identifikacija uropatogena značajno se razlikovala od identifikacije na klinički dostupnim uređajima poput Biotyper-a i Vitek-a, koji koriste isključivo „otisak prsta“ pojedinoga uzročnika pohranjenih u spektralnim bazama podataka. Za razliku od takvoga pristupa u ovom istraživanju korišteni su podaci o peptidima iz MS/MS obrade spektara, koji su prikupljeni pretraživanjem Mascot preoteinske baze podataka, na temelju kategorizacije uropatogenih rodova koja je nastala tijekom izrade ovoga doktorskog rada. Ovakva, izravna proteomska identifikacija koja stvara poveznicu s identificiranim monobakterijskim uzročnikom metodom standardne urinokulture (SUK-a), pružila je pouzdanu identifikaciju za rod Klebsiella (3 uzorka), Proteus (4 uzorka), Enterococcus (2 uzorka), Enterobacter (1 uzorak) i Citrobacter (1 uzorak). Sveukupno, 87 % uzoraka kod kojih je pomoću SUK-a identificirana monobakterijska infekcija, analizirano je ovim jednostavnim proteomskim pristupom i svi su pokazali dobru korelaciju s objavljenim rezultatima. Usprkos obećavajućim rezultatima, identifikacija uropatogena pomoću MALDI-TOF/TOF platforme tijekom istraživanja pokazala je i neke slabosti. MALDI-TOF MS identifikacija polimikrobnih kultura, izravno iz uzoraka mokraće nije dala pouzdane/podudarne rezultate u komparaciji sa SUK-om. Kako bi se procijenio pravi razmjer poklapanja SUK-a i metaproteomske metode bazirane na MS-u, u rad je uvedena i treća metoda bazirana na genomici. Sekvenciranjem gena za 16S rRNA postiže se taksonomska kategorizacija uropatogena do razine roda (44 %) i porodice (56 %), dok identifikacija na razini vrsta uglavnom nije postignuta. Usporedba rezultata SUK-a i ove metode bila je podudarna u 89 % uzoraka. Uočeno je da genomska analiza 16S rRNA nije bila informativna na razini roda i/ili vrste za porodicu Enterobacteriaceae, što joj je i glavna slabost. Nadalje, praćenjem urinarne mikrobiote pacijenata sa simptomima cistitisa te longitudinalnim praćenjem dinamike mokraćne mikrobiote za vrijeme primjene antibiotske terapije propisane prema analizi osjetljivosti, ispitan je utjecaj uobičajeno propisane terapije na dinamiku mokraćne mikrobiote. Zaključeno je da su simptomi cistitisa uvelike povezani s disbiozom mikrobiote urinarnoga trakta. Uz značajno i očekivano povećanje uropatogena koji uzrokuju uroinfekciju, zapaženo je i značajno smanjenje potencijalno korisnih bakterijskih rodova. Odjeljak bakterija Actinobacteria potencijalno uključuje nekoliko vrlo korisnih predstavnika zdrave urinarne mikrobiote. Praćenjem mikrobioma pacijentice pod antimikrobnom terapijom opažene su brze i dinamične promjene sastava urinarne mikrobiote koje naglašavaju potrebu revidiranja trenutnih smjernica u pogledu vremenskoga trajanja primjene antibiotske terapije.