Desarrollo de métodos inmunoquímicos para el análisis en alimentos de fungicidas inhibidores de la succinato deshidrogenasa

El uso de plaguicidas constituye una forma eficaz y hoy por hoy necesaria para combatir gran parte de las plagas que afectan a los cultivos agrícolas. Sin embargo, su uso puede dar lugar a la aparición de residuos en los alimentos que llegan al consumidor, lo que puede derivar en un problema de seguridad alimentaria. Por ello, es necesario el desarrollo de métodos analíticos altamente sensibles y selectivos para la monitorización de dichos residuos, que permitan la detección de concentraciones lo más bajas posibles. En este contexto, en esta Tesis Doctoral se ha abordado el desarrollo de métodos inmunoquímicos de elevada sensibilidad y selectividad para el análisis en muestras de alimentos de trazas de fluopyram y penthiopyrad, dos novedosos fungicidas del grupo de inhibidores de la succinato deshidrogenasa (SDHI). Estos métodos hacen uso de anticuerpos específicos para detectar los analitos de interés. Dada la versatilidad, fiabilidad, bajo coste y sencillez de este tipo de técnicas, entre otras propiedades, los inmunoensayos desarrollados podrían constituir así métodos alternativos y complementarios a los métodos cromatográficos convencionales para determinadas aplicaciones, como son las situaciones de crisis y alarma alimentaria o la monitorización de una sustancia concreta en un elevado conjunto de muestras. Para lograr este propósito, se siguió un esquema bien establecido, fruto de varias décadas de investigación con moléculas pequeñas similares a los dos fungicidas de estudio. En primer lugar, mediante síntesis orgánica total se prepararon cuatro análogos funcionalizados (haptenos) de fluopyram (FPa, FPb, FPha’ y FPhb), cada uno de los cuales incorporaba en posiciones opuestas un brazo espaciador equivalente terminado en un grupo carboxilato, que más tarde se emplearía para enlazarlos covalentemente a proteínas transportadoras. Del mismo modo, para el fungicida penthiopyrad se obtuvo un total de cinco haptenos (PPa, PPb, PPm, PPd’ y PPo). Todos los haptenos sintetizados fueron después enlazados covalentemente mediante el método del éster activo a diversas proteínas transportadoras (BSA, OVA y HRP) para dar lugar a un conjunto de conjugados proteína–hapteno. Algunos de ellos fueron después inoculados en animales de laboratorio, lo que dio lugar a una colección de anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón específicos para fluopyram y penthiopyrad. Los anticuerpos generados fueron caracterizados mediante ELISA competitivo en dos formatos para determinar su afinidad y especificidad frente a fluopyram y penthiopyrad, así como para encontrar las condiciones más adecuadas para el desarrollo de los inmunoensayos deseados. En el caso de fluopyram, se encontró que los dos inmunógenos inoculados, basados en los haptenos FPa y FPb, presentaron una capacidad similar para generar anticuerpos de elevada afinidad hacia el fungicida, lo que podría deberse a la adquisición de una conformación plegada similar por parte de ambos y por tanto la exposición de elementos equivalentes durante la respuesta inmunitaria. En cuanto a penthiopyrad, el mejor inmunógeno resultó ser el basado en el hapteno PPm, que presentaba una gran similitud con el analito al aprovechar su fragmento alifático ramificado característico como brazo espaciador; de hecho, el reconocimiento molecular mostró gran dependencia con las variaciones estereoelectrónicas inducidas por el brazo espaciador. En general, con los anticuerpos generados se pudieron llevar a cabo inmunoensayos capaces de detectar hasta 24 pg/g de fluopyram y 33 pg/g de penthiopyrad. En paralelo a la caracterización de los anticuerpos policlonales y monoclonales, se llevó a cabo un estudio de la respuesta inmunitaria hacia moléculas pequeñas haciendo uso de inmunógenos basados en nanotubos de carbono, a los que se unió covalentemente el conjugado BSA–PPm o bien el hapteno PPm. Los dos complejos fueron inoculados en conejos de laboratorio siguiendo distintas pautas y acompañados o no de adyuvante de Freund, y se monitorizó mediante ELISA competitivo la evolución del título y de la afinidad de los anticuerpos generados. El resultado permitió concluir que es posible desencadenar el proceso de maduración de la respuesta inmunitaria (respuesta inmunitaria secundaria) hacia el hapteno PPm sin mediación proteica y con dosis tan bajas como 0.1 μg de hapteno, siempre y cuando en la respuesta inmunitaria primaria (primer contacto con el inmunógeno) sí exista participación de proteína transportadora y se incluya adyuvante de Freund en todo el proceso. Además, se comprobó que los inmunógenos basados en nanotubos de carbono presentan carácter autoadyuvante cuando contienen proteína transportadora. Con toda la información recabada, se seleccionaron cuatro inmunoensayos de tipo ELISA competitivo, dos por cada analito, y se evaluó la influencia de las variables fisicoquímicas más importantes del ensayo (pH y fuerza iónica) en sus parámetros, así como la tolerancia a algunos disolventes orgánicos (metanol, etanol y acetonitrilo), observándose una gran robustez por parte de todos ellos. Tras esta caracterización, los ensayos se dieron por desarrollados y se procedió a su aplicación a muestras fortificadas y tratadas en campo de ciruela y uva, así como a muestras de mosto y vino derivadas de las de uva. Las frutas se analizaron en forma de extractos orgánicos obtenidos mediante el procedimiento denominado QuEChERS (método oficial de la EFSA para la extracción de plaguicidas de muestras vegetales), mientras que los mostos y vinos se analizaron de forma directa. Con los métodos inmunoquímicos desarrollados fue posible la cuantificación de hasta 5 ng/mL de ambos fungicidas en extractos de frutas y de 10 ng/mL en mostos y vinos. Estos excelentes límites analíticos resultaron ser muy inferiores a los límites máximos de residuo (LMR) establecidos para dichas frutas en la Unión Europea, con lo que se dio por logrado el objetivo principal de la Tesis Doctoral. Finalmente, y como un estudio adicional para demostrar su aplicabilidad real, los inmunoensayos desarrollados se aplicaron a la evaluación de la transferencia de fluopyram y penthiopyrad de la uva al vino, concluyéndose que el primero se transfiere completamente y que el segundo lo hace aproximadamente en un 50%. Pesticides constitute nowadays an efficient and necessary way to fight against most pests that affect crops. However, as residues may remain in final foodstuffs, there could be a food security issue. Thus, development of highly sensitive and selective analytic methods is required in order to detect residue concentrations as low as possible. In this context, development of highly sensitive and selective immunochemical methods for fluopyram and penthiopyrad analysis in food has been addressed in this Doctoral Thesis. Fluopyram and penthiopyrad are two novel succinate dehydrogenase inhibitor (SDHI) fungicides. Immunochemical methods make use of specific antibodies in order to detect the analyte(s) of interest. As they are highly versatile, reliable, economical and simple, among other properties, the proposed immunoassays could work as complementary and alternative methods to conventional chromatographic analysis in certain applications, such as food crisis or specific monitoring of a particular substance in a large set of samples. To achieve this purpose, a very well defined procedure was followed, which was established after several decades of research with small molecules similar to fluopyram and penthiopyrad. Firstly, four functionalized analogues (haptens) of fluopyram (named FPa, FPb, FPha’ and FPhb) were obtained by means of total organic synthesis. Each of them incorporated an equivalent spacer arm finished in a carboxyl group for covalent protein binding, and they were placed in opposite positions of the structure. A set of five haptens of penthiopyrad (named PPa, PPb, PPm, PPd’ and PPo) were synthesized in the same way. All haptens were then covalently linked to various proteins (BSA, OVA and HRP) using the active esther method, which afforded a set of hapten–protein conjugates. Some of them were inoculated in laboratory animals, which led to a collection of rabbit polyclonal and mouse monoclonal antibodies specific for fluopyram and penthiopyrad. The generated antibodies were then evaluated by competitive ELISA in two formats in order to evaluate their affinity and specificity to both fungicides and then stablish the best conditions for immunoassay development. In the case of fluopyram, it was found that both inoculated immunogens derived from haptens FPa and FPb had similar ability to generate high affinity antibodies for the fungicide, which could be explained assuming that both haptens expose the same immunodeterminant elements after getting into a folded conformation similar to fluopyram’s minimum energy conformation. As for penthiopyrad, the best immunogen was based in hapten PPm, which is very similar to penthiopyrad as its ramified aliphatic fragment is used as the spacer arm in the hapten. In fact, molecular recognition showed to be very dependent on stereoelectronic variations induced by the spacer. In general terms, immunoassays performed with the generated antibodies allowed to detect fluopyram from 24 pg/g and penthiopyrad from 33 pg/g. Together with polyclonal and monoclonal antibodies characterization, a study of the immune response to small molecules using immunogens based in carbon nanotubes was taken. Carbon nanotubes were covalently linked to either BSA–PPm conjugate or hapten PPm. Then, both complexes were inoculated in laboratory rabbits following different procedures and either emulsified with Freund’s adjuvant or simply diluted in aqueous buffer. The immune response was periodically monitored by competitive ELISA in terms of title and affinity to penthiopyrad of the generated antibodies. The first conclusion of the study was that it is possible to induce maturation of the immune response (secondary immune response) to hapten PPm without protein and hapten doses as low as 0.1 μg, provided that protein is inoculated in the first boost (primary immune response) and immunogens are always emulsified with Freund’s adjuvant. The second conclusion was that carbon nanotubes show self-adjuvant properties provided that protein is present. With all the collected information, two competitive ELISA for fluopyram and two for penthiopyrad were selected, and the influence of the most important physicochemical variables (pH and ionic strength) of the assays and their tolerance to various organic solvents (methanol, ethanol and acetonitrile) were studied. Results showed that selected immunoassays were very stable, so their development was concluded. Therefore, final assays were applied to the analysis of fluopyram and penthiopyrad in fortified and field samples of plums and grapes, as well as the corresponding musts and wines. Fruits were analysed as their organic extracts obtained by the QuEChERS procedure (EFSA official method for pesticide extraction from vegetal samples), whilst musts and wines were analysed directly after dilution in water. The developed immunochemical methods allowed to quantify from 5 ng/mL of both fungicides in fruit extracts and from 10 ng/g in musts and wines. These excellent analytical limits proved to be much lower than the maximum residue levels (MRL) established in the European Union for plums and grapes, so the main objective of this Doctoral Thesis was achieved. Finally, an additional study to demonstrate immunoassays’ real applicability was taken to evaluate the transference of fluopyram and penthiopyrad from grapes to wines. The conclusion was that fluopyram is completely transferred to wine, while only 50% of penthiopyrad passes to it.