Bir grup antioksidan bileşiğin tayini için HPLC yöntemi geliştirilmesi ve çoklu dedektör analitik yöntem validasyonu çalışmaları

Bir grup antioksidan karotenoid bileşiğin (alfatokoferol, beta karoten, astaksantin, retionik asit ve likopen) eş zamanlı tayini için seri bağlı DAD ve ECD dedektör kullanımına dayalı izokratik bir YBSK yöntemi geliştirilerek yöntem geçerliliği çalışmaları yapılmıştır. Yöntem geçerliliği çalışmalarında International Conference of Harmonization (ICH) tüzel kişiliği tarafından 1999 tarihinde yayınlamış ve 2005 yılında ICH Q2(R1) adıyla güncellenen analitik yöntem geçerliliği kılavuzu baz alınmıştır. Alıkonma zamanları ilgili bileşikler için sırasıyla 15,6 dakika, 38,9 dakika, 6,1 dakika ve 5,79 dakika olarak saptanmıştır. Likopen için ilgili temel enstrümental analiz verisi elde edilmekle birlikte YBSK verileri eldeki standardın bozunması nedeniyle elde edilememiştir. Belirleme sınırı (LOD) ve tayin sınırı (LOQ) her bileşik için DAD baz alındığında sırasıyla 0,79, 0,04, 0,01, 0,01 ve 0,49, 0,12, 0,01, 0,05 olarak saptanmıştır. ECD baz alındığında ise ICH Q2(R1) uygunluk kriteri (S/G oranı LOD için en az 2/1 veya 3/1, LOQ için ise en az 10/1) sağlanmadığından hesaplanmamıştır. ICH Q2(R1) kılavuzunda yer alan özgüllük (specificity), doğrusallık (linearity), doğruluk (accuracy), kesinlik (precision), belirleme sınırı (limit of detection ? LOD), tayin sınırı (limit of quantification ? LOQ) parametreleri ve sistem uygunluk testlerine (system suitability tests) ait veriler elde edilmiş ve sunulmuştur. İlgili herbir parametre için elde edilen verilerin kabul kriterlerine uygunluğu gösterilmiştir. Dolayısıyla tanımlanan yöntemin alfatokoferol, beta karoten, astaksantin, retionik asit ve likopenin ECD ve DAD kullanılarak eş zamanlı tayini için geçerli olduğu bulunmuştur.Gerçek örnek olarak müstahsarlarla yapılan YBSK tayinlerinde sadece alfa tokoferol ve beta karoten içeren örnek sağlanabildiği için alfa tokoferol için 20 ppm ve beta karoten için 15 ppm optimum derişim değerleri olarak belirlenmiştir. Buna göre alfa tokoferol ve beta karoten içeren örneklerde final konsantrasyon değeri sırasıyla 20 ve 15 ppm olacak şekilde yeterli düzeyde standart ilavesi, ekstraksiyon öncesi, yapılmıştır. Takiben yapılan ekstraksiyon sonucu elde edilen verimler baz alındığında en yüksek verimin (büyükten küçüğe) A-OD, Alaska, A-OC ve Multivitamin Plus müstahsarlarıyla elde edildiği görülmüştür. İlgili müstahsar örneklerinin %geri kazanımları sırasıyla %99, %89, %85 ve %79 şeklindedir. Alaska müstahsarında beta karoten ve A-OO müstahsarın da ise alfa tokoferol tespit edilememiştir. An isocratic HPLC method for the simultaneous determination of a group of carotenoid compounds (alphatocopherol, betacarotene, astaxanthine, retionic acid and lycopene), based on DAD, FLD and ECD Detectors connected in series, is developed and analytically validated. Analytical method validation studies were based on the guideline ICH Q2(R1) prepared by International Conference of Harmonization (ICH) in 1999 and updated in 2005. The retention times of the mentioned compounds were determined as; 15.6 min, 38.9 min, 6.1 min and 5.79 min, respectively. Eventhough basic instrumental analysis data were obtained for lycopene, it was impossible to obtain HPLC data since the standard itself had decomposed unexpectedly. Limit of dedection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for each compound were found to be 0.79, 0.04, 0.01, 0.01 and 0.49, 0.12, 0.01, 0.05, respectively for DAD. For ECD as the required ICH Q2(R1) suitability criteria was not achieved (S/N ratio for LOD to be minimum 2/1 or 3/1, for LOQ to be minimum 10/1) calculation was not performed. Data were obtained and presented for the parameters; specificity, linearity, accuracy, precision, limit of detection ? LOD, limit of quantification ? LOQ and system suitability tests present in the ICH Q2(R1) guideline. The suitability of the data obtained for the each parameter to the acceptance criteria was also presented. Thus the described method is found to be valid for the ECD and DAD employed simultaneous determination of alphatocopherol, betacarotene, astaxanthine, retionic acid and lycopene.As real sample applications could only be performed on the drug products containing alphatocopherol and betacarotene only, optimum operational concentration of these compounds were found to be 20 and 15 ppm, respectively. Therefore prior to extraction adequate amount of the standard solutions of these compounds to reach mentioned ppm levels were spiked to the real samples containing them. When recovery values obtained with the following extraction procedure are considered, the best recovery was obtained with the samples in the order A-OD, Alaska, A-OC and Multivitamin Plus. The correspondinf recoveries were calculated as; 99%, 89%, 85% and 79%, respectively. Betacarotene in the sample ?Alaska? and alphatocopherol in the sample ?A-OO? were not dedectable. 294