Signalling in plant mitochondria. Redox regulation of gene expression & characterisation of a pea nucleoside diphosphate kinase

This work contributes to our understanding of mitochondrial responses to changing environmental conditions in plants. The first part of this thesis is focused in the study of redox regulation of mitochondrial gene expression. By using inhibitors, the redox state of the components of the mitochondrial respiratory chain was selectively affected. Effects of the altered redox state of these components on mitochondrial translation were studied. This approach allowed the identification of the respiratory complex II as a key component of regulation of mitochondrial translation. Furthermore, results indicating that protein phosphorylation might be part of this regulatory system are also presented. The other aspect investigated in this work is the characterisation of a recently isolated mitochondrial protein, the pea mitochondrial nucleoside diphosphate kinase (pea mtNDPK). Cloning, expression studies, organellar targeting and phylogenetic analysis of this protein are described. Functional characterisation of the pea mtNDPK revealed a role in stress response. It was found, that the pea mtNDPK interacts with a novel 86 kDa protein, of which synthesis is up-regulated upon heat stress in vivo. The pea mtNDPK seems to have various oligomeric states, suggesting its interaction with different types of substrates. The data presented here indicate that the pea mtNDPK most likely is part of the plant mitochondrial response to heat stress, possibly acting as a modulator of the heat up-regulated 86 kDa protein. En del av cellens funktioner utförs i de membranomslutna små "rum" i cellen som kallas organeller. En typ av organeller är mitokondrierna vars främsta funktion är att producera energi – ATP syntes. ATP produceras under en process kallad respiration. Respirationen sker i mitokondriens membran där elektroner transporteras mellan proteinkomplex (komplex I-IV) och elektron bärare (ubiquinone och cytokrom c) (figur 3). Under respirationen konsumeras syre, NAD(P)H och succinat. Mitokondrierna härstammar från frilevande bakterier som inneslutits i en annan organism (Gray, 1993). Detta ledde till uppkomsten av en ny, mer komplex livsform. Under evolutionens gång har de flesta av mitokondriens gener förflyttats till värdorganismens kärna. Ett fåtal gener finns dock fortfarande kvar i mitokondrien. De flesta av mitokondriens proteiner produceras därför utanför mitokondrien i den s.k. cytoplasman och endast ett fåtal är syntetiserade i mitokondrien. För att hela uppsättningen av mitokondriella proteiner skall produceras måste således två genetiska system användas och dessutom koordineras. Varför har då inte alla mitokondriella gener flyttas till kärnan? En förklaring till detta kan vara att uttrycket av generna i mitokondriens genom är, och måste vara, kontrollerade av förändringar av förhållanden, t ex syrekoncentrationen, innuti mitokondrien. Det är kännt att hos vissa bakterier uttrycks en del gener endast vid hög syrekoncentration (Iuchi and Lin, 1988). Komponenter i bakteriernas respiratoriska system kan känna av skillnader i syrekoncentrationen och justera genuttrycket i enlighet med de rådande förhållanderna. På liknanade sätt anses förändringar i mitokondriens respiratoriska aktivitet kunna påverka uttrycket av de mitokondriella generna (Allen, 1993a). För att testa denna hypotes förändrade vi aktiviteten hos respirationens komponenter och studerade vilka effekter dessa förändringar hade på proteinsyntesen i mitokondrierna. Endast då aktiviteten av komplex II var förändrad, kunde vi se påverkan av mitokondriell proteinsyntes (Paper I). Hur kan komplex II-aktiviteten påverka mitokondriellt genuttryck och proteinsyntes? Kan komplex II kommunicera med komponenter av det mitokondriella genuttryckssystemet? Vi kan ännu inte besvara dessa frågor, men tror att translation (ett av de nödvändiga stegen i proteinsyntesen) är kontrollerad av aktiviteten hos komplex II. Dessutom verkar denna reglering involvera fosforylering av ett oidentifierat protein (Paper II). Proteinfosforylering innebär att en fosfatgrupp binds till ett protein. Denna fosfatgrupp förändrar proteinets egenskaper, aktiverar eller inaktiverar proteiner, och kan fungera som medel för kommunikation i cellen. Mitokondriellt nukleosid difosfat kinas (mtNDPK) är ett fosfoprotein vars funktioner ännu inte är fullständigt undersökta. Vi har identifierat den fullständiga genetiska information som kodar för mtNDPK i ärta och visat också att proteinet importeras in i mitokondrien (Paper III). Vi konstaterade vidare att mtNDPK är mer förekommande i blommorna än i andra delar av växten (Paper III & IV). Vi fann också att mtNDPK interagerar med ett protein som nybildas under värmestress. Vi förmodar därför att ärt-mtNDPK har en roll i växtens reaktion på värmestress (Paper IV).