Desarrollo y aplicación de métodos basados en fluorescencia para la determinación rápida de la actividad de las polimerasas de virus ARN

Tesis-CEINDO, Universidad San Pablo CEU, Facultad de Farmacia, Programa en Ciencia y Tecnología de la Salud, leida el 22 de abril del 2022 Los virus de ARN son patógenos de alta impacto clínico y veterinario, muchos de ellos de reciente aparición como el SARS-CoV-2 o bien los reemergentes como el Zika se han convertido en un foco de interés. Todos los virus de ARN replican sus genomas a través de una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). Esta proteína es única, lo que la convierte en una diana para el desarrollo de antivirales con alta especificidad. Aquí se describe un método basado en fluorescencia para monitorizar la actividad de polimerización a tiempo real de las RdRp. El uso de moldes de ARNmc homopolimérico, permite detectar la síntesis de novo de ARNbc con un tinte intercalante. Gracias a este método, se han podido descubrir y caracterizar dos nuevos INAN de la polimerasa del virus del Zika: TCMDC-143406 y TCMDC-143215. Además, mediante ligeras adaptaciones, se ha podido medir en tiempo real la actividad de las RdRp de FMDV y HCV junto con la polimerasa de SARS-CoV-2. Los resultados demuestran que la plataforma basada en fluorescencia para medir la actividad polimerasa a tiempo real, representa una alternativa rápida, económica, fiable y eficaz para la medida de la actividad de distintas RdRp y el cribado de compuestos con potencial efecto inhibitorio frente a estas proteínas. RNA viruses are pathogens of high clinical and veterinary impact, many of them of recent appearances such as SARS-CoV-2, or reemerging ones such as Zika have become a focus of interest. All RNA viruses replicate their genomes through an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). This protein is unique, making it a target for developing antivirals with high specificity. A fluorescence-based method for monitoring the real-time polymerization activity of RdRp is described here. The use of homopolymeric ssRNA molds allows detecting the de novo synthesis of dsRNA with an intercalant dye. Thanks to this method, two new ZIKA virus polymerase NNIs have been discovered and characterized: TCMDC-143406 and TCMDC-143215. In addition, through slight adaptations, it has been possible to measure in real-time the activity of the RdRp of FMDV and HCV together with the polymerase of SARS-CoV-2. The results show that the fluorescence-based platform to measure polymerase activity in real-time represents a fast, economical, reliable, and effective alternative for the measurement of the activity of different RdRp and the screening of compounds with potential inhibitory effects against these proteins.