Estudios in vivo e in vitro sobre algunos aspectos de la respueta inmunitaria innata frente al virus PRRS= In vivo and in vitro studies on some aspects of the innate immune response against PRRSV

Objetivos. Primero: determinación de la susceptibilidad de macrófagos derivados de monocitos activados por citocinas a ser infectados por diferentes cepas del genotipo 1 y 2 de PRRSV. Segundo: evaluación de la modulación de la respuesta inmune por la cepa 2982 de PRRSV-1 en pulmón, tonsila y nódulos linfáticos de credos infectados. Tercero: caracterización de la respuesta inmune inducida por diferentes cepas de PRRSV-1 que varían en virulencia en distintos compartimentos de nódulo linfático mediastínico (Med-LN) de cerdos infectados. Metodología. En el experimento in vitro se seleccionaron monocitos de PBMC de cerdos SPF y se incubaron durante 72 h para permitir la diferenciación en macrófagos. Entonces esas células se estimularon con citocinas durante 24 h: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β o no estimulados. Después mediante citometría de flujo se evaluó el fenotipo de los diferentes macrófagos (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). La infección de macrófagos por PRRSV se cuantificó por medición de la nucleocápside mediante citometría de flujo. En el sobrenadante se midió por ELISA IFN-α, TNF-α, and IL-10. Para el primer estudio in vivo 28 cerdos SPF se infectaron intramuscularmente con la cepa 2982 de PRRSV-1 y se eutanasiaron humanitariamente a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 dpi. Se dejaron 4 animales como grupo control negativo, que se eutanasiaron a los 24 dpi. Los niveles de transcripción de citocinas proinflamatorias (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 y TNF-α) e inmunododuladoras (IL-10 y TGF-β) se midieron mediante RT-qPCR. Para el segundo experimento in vivo 76 lechones SPF fueron aleatoriamente agrupados en 3 grupos de 20 animales para la infección, y los restantes 16 se dejaron como control. Se utilizaron tres cepas de PRRSV-1 con distinta virulencia: LV como prototipo, 215-06 del subtipo 3, y la SU1-bel del subtipo 3. Los animales se eutanasiaron humanitariamente a los 3, 7 y 35 dpi. El folículo y área inter-folicular de Med-LN se tomaron separadamente mediante captura por microdisección láser. Los niveles de transcripción de citocinas (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) y de SOCS1 se evaluaron por RT-qPCR. Las poblaciones celulares de Med-LN se evaluaron por inmunohistoquímica. Resultados. Los macrófagos estimulados por citocinas desarrollan diferente fenotipo comparado con macrófagos no polarizados. Los cultivos celulares de macrófagos polarizados por citocinas pueden muestran diferencias importantes entre cepas de PRRSV. Mientras que los macrófagos no polarizados y M2 son sensibles a todas las cepas de PRRSV, el tratamiento de macrófagos con IFNs induce un claro estado antivírico en dichas células con una menor infección y replicación de PRRSV. Sólo los M1 infectados con LVP23 produjeron cierta cantidad de IFN-α. Este tipo de macrófagos representan un flexible modelo in vitro alternativo al empleo de líneas celulares derivadas de mono o a macrófagos alveolares porcinos. El primer estudio in vivo mostró que la cepa 2982 del PRRSV-1 es capaz de evadir el establecimiento de respuesta inmune innata efectiva, permitiendo una expresión génica de IFN- α 1 y TNF-α disminuida, y una respuesta inmune adquirida débil y retardada, por una expresión ineficiente de IL-12 e IFN-γ. El segundo experimento in vivo demostró que PRRSV permanece alojado en Med-LN al menos hasta 35 dpi, y la cepa SU1-bel es la que posee una mayor capacidad de replicación. Las cepas de PRRSV-1 evitaron el establecimiento correcto de la respuesta inmune en cerdos infectados mediante la depleción de células linfáticas y disminución de la expresión de IFN- α y TNF-α en los compartimentos de Med-LN. Finalmente, los resultados sugieren que la inducción de IL-10 por PRRSV con el propósito de retrasar la respuesta inmune del hospedador no es una estrategia común a todos los aislados de PRRSV
1. Objectives. First: determination of the cytokine primed monocyte-derived macrophages susceptibility to be infected by different PRRSV-1 and 2 strains. Second: evaluation of the swine immune response modulation by PRRSV-1 2982 strain in lung, tonsil, tracheobronchial and retropharyngeal lymph nodes of infected pigs. Third: characterization of the immune response induced by several PRRSV-1 strains varying in virulence in distinct compartments of mediastinal lymph node (Med-LN) (follicle and inter-follicular areas) of infected pigs. Methodology. For the in vitro experiment, monocytes were isolated from PBMC of SPF pigs and incubated during 72 h to lead the macrophage differentiation. Then, these cells were stimulated during 24 h with cytokines: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β or no stimulated. After that the phenotype of the different macrophages were evaluated by flow cytometry (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). Several PRRSV-1 and PRRSV-2 strains were used to infect macrophages. PRRSV infection of macrophages was evaluated by nucleocapsid protein acquisition by flow cytometry. In the supernatant IFN-α, TNF-α, and IL-10 were determined by ELISA. For the first in vivo experiment 28 SPF pigs were infected intramuscularly with PRRSV-1 2982 isolate and were humanely euthanized at 3, 7, 10, 14, 17, 21 and 24 dpi. Four pigs were kept as non-infected control group, being humanely euthanized at 24 dpi. The proinflammatory (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 and TNF-α) and immunomodulatory (IL-10 and TGF-β) cytokines transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. For the second in vivo experiment, 76 SPF piglets were ramdonly allocated in groups of 20 animals for the viral infection and the 16 remaining animals as control group. Three PRRSV-1 isolates varying in virulence were selected in this study: LV as prototype, 215-06 from subtype 1, and SU1-bel from subtype 3. Animals were humanely euthanized at 3, 7 and 35 dpi. Med-LN follicle and inter-follicular areas were separately selected by Laser Microdissection Capture. Cytokines (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) and SOCS1 transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. The lymph node cell populations were evaluated by immunohistochemistry. Results. The in vitro experiment showed that stimulated macrophages developed different phenotype compared with non polarized macrophages. Cytokine-primed macrophages cultures can reveal important PRRSV strain differences. Whereas undifferentiated macrophages and M2 are sensitive to all PRRSV strains, IFN-γ and IFN-β treatment of macrophages induced a clear antiviral state in macrophages with reductions in virus infection and replication. Only IFN-α production was detected in the supernatant of M1 infected with LVP23 PRRSV-1 strain. These macrophages represent a flexible in vitro model alternative against monkey cell lines and porcine alveolar macrophages. The first in vivo experiment showed that PRRSV-1 strain 2982 is able to evade the onset of an effective innate immune response, leading to an impaired expression of IFN-α 1 and TNF-α gene expression, and a weak and delayed acquired immune response through an inefficient IL-12 and IFN-γ expression. This experiment showed that PRRSV remains allocated in follicle of lymph node during at least 35 dpi, and SU1-bel showed the higher ability of replication. PRRSV-1 stains showed to avoid the correct innate immune response in infected pigs through lymphatic cell depletion, IFN-α and TNF-α down-regulation in Med-LN compartments. Finally, the IL-10 induction by PRRSV was not a common strategy among the PRRSV-1 to delay of the host immune response.