Estudio del núcleo interpeduncular y del complejo sensorial trigeminal como ejemplos de procesos de migración y segmentación en el rombencéfalo

Esta tesis doctoral se incluye en el campo de la Neurobiología del Desarrollo. El objetivo principal ha sido profundizar en el conocimiento de dos procesos fundamentales para la formación del encéfalo: la migración neuronal y la segmentación cerebral. Para ello, me he centrado en dos estructuras relacionadas respectivamente con estos procesos: el núcleo interpeduncular (IPN), que estudios previos han descrito como modelo de migración neuronal en el rombencéfalo rostral; y la columna sensorial del trigémino, que se extiende a través de sucesivas unidades segmentarias a lo largo del rombencéfalo. Para el estudio de ambas estructuras, este trabajo toma como base el modelo neuromérico, que considera sucesivas unidades segmentarias o metaméricas a lo largo del eje longitudinal del encéfalo. Estos neurómeros se denominan rombómeros (r) en el rombencéfalo. Muestran expresión específica de combinaciones de genes de desarrollo y dan lugar a dominios transversales respectivos del rombencéfalo adulto. En cuanto aI IPN, está formado íntegramente por la migración neuronal de diversas poblaciones neuronales con diferentes orígenes dorsoventral y rostrocaudal. Esta estructura se subdivide en tres componentes rostrocaudales, el prodromal (Pro) ubicado en el istmo (también llamado r0), y el rostral interpeduncular (IPR) y caudal interpeduncular (IPC), localizados en rostral r1 (r1-r) y caudal r1 (r1-c), respectivamente. Algunos autores han propuesto que r1-r y r1-c pueden considerarse como segmentos independientes, de modo que los tres dominios del IPN antes mencionados corresponderían a sus respectivos neurómeros. Estudios previos demostraron que las poblaciones celulares del IPN expresan varios factores de transcripción (TF) (Nkx6.1, Pax7, Otp, Otx2, Irx2) durante el desarrollo de esta estructura, permitiendo así determinar su origen, vías migratorias y destino final. En el estudio 1 (García-Guillén et al., 2020) el objetivo fue estudiar el proceso de migración del IPN en un ratón mutante que carece de DCC (Deleted in Colorrectal Cancer), que es un receptor de Netrin-1. Esta molécula participa en múltiples procesos de migración durante el desarrollo del rombencéfalo. La técnica principal utilizada fue la hibridación in situ con sondas de ARN para los TF mencionados anteriormente en encéfalos de ratón DCC- / - knockout frente a sus homólogos de tipo salvaje. A continuación, en el estudio 2 (García-Guillén et al., 2021) nos centramos en la regionalización molecular dentro de este núcleo, mediante la búsqueda de genes expresados diferencialmente dentro de las subregiones del IPN. Realizamos esta selección y análisis utilizando los datos de Allen Developing Mouse Brain Atlas (ADMBA) (https://developingmouse.brain-map.org/). Los estudios 1 y 2 se realizaron en estadios perinatales (principalmente E18.5 y también P4) debido a que el IPN es un núcleo de formación tardía, por lo que se pensó que el cribado daría lugar a genes que podrían participar tanto en la migración neuronal como en la regionalización de este núcleo. En cuanto a la columna sensorial del trigémino, se extiende a lo largo de la mayor parte del rombencéfalo, abarcando así varios rombómeros. Esta columna está formada por el núcleo sensorial principal (Pr5), ubicado en los rombómeros r2 y r3, y el núcleo espinal del trigémino (Sp5), que cubre desde r4 hasta el límite rombencéfalo/médula espinal, según estudios previos en ratón. El objetivo perseguido en el estudio 3 (García-Guillén et al., 2021b) fue estudiar su organización segmentaria, buscando genes expresados diferencialmente dentro de esta estructura. Para ello, buscamos en las bases de datos ADMBA y Allen Mouse Brain Atlas (AMBA) (https://mouse.brain-map.org/) en juveniles (P4, P14, P28) y adultos (P56), ya que pretendíamos brindar un nuevo soporte molecular para las posibles subdivisiones romboméricas de esta estructura que no solo serían transitorias en el embrión, sino que también se mantendrían en los encéfalos adultos. Los resultados del estudio 1 muestran que la vía de señalización Netrin-1 / DCC es uno de los mecanismos implicados en la migración de la IPN, ya que en el mutante existe un deterioro general pero diferencial de la migración neuronal de todas las poblaciones analizadas. La ausencia de DCC afecta principalmente a aquellas poblaciones de los dominios Pro e IPR de este núcleo. En el estudio 2 obtuvimos 135 genes expresados en el IPN de forma regionalizada. El análisis funcional de estos genes destacó una sobrerrepresentación de familias de genes relacionadas con el desarrollo de neuronas, la morfogénesis celular y la guía de axones. En el estudio 3, caracterizamos el patrón de expresión de 12 genes expresados diferencialmente a lo largo de la columna del trigémino: Baiap3, Camk2a, Calb1, Calb2, Irx2, Kcng4, Fn1, Mafb, Tac1, Tac2, Pde1c y Zbtb16. A través del análisis del patrón de estos genes, proporcionamos un nuevo soporte genético de la segmentación de esta columna en el adulto. En general, estos trabajos aportan nuevos conocimientos sobre los mecanismos de desarrollo de dos estructuras del rombencéfalo, el IPN y la columna sensorial del trigémino, como ejemplos de migración y segmentación celular. Este conocimiento puede servir de base para futuros estudios sobre la función o farmacología de ambas estructuras, o puede aplicarse también al estudio de otras poblaciones neuronales en cuya formación están implicadas la migración y / o la segmentación. This doctoral thesis is included in the field of Developmental Neurobiology. The main objective has been to deepen the knowledge on two fundamental processes for brain formation: neuronal migration and brain segmentation. To this end, I have focused on two structures respectively related to these processes: the interpeduncular nucleus (IPN), that previous studies have described as a model of neuronal migration in the rostral hindbrain; and the trigeminal sensory column, which spans through successive segmental units along the hindbrain. For the study of both structures, this work takes as basis the neuromeric model, that considers successive segmental or metameric units along the longitudinal axis of the brain. These neuromeres are called rhombomeres (r) in the hindbrain. They display specific expression of combinations of developmental genes and give rise to respective transverse domains of the adult hindbrain. Regarding the IPN, it is formed entirely by neuronal migration of various neuronal populations with different dorsoventral and rostrocaudal origins. This structure is subdivided into three rostrocaudal components, the prodromal (Pro) located in the isthmus (also called r0), and the interpeduncular rostral (IPR) and interpeduncular caudal (IPC), placed in rostral r1 (r1-r) and caudal r1 (r1-c), respectively. Some authors have proposed that r1-r and r1-c can be considered as independent segments, so that the three aforementioned IPN domains would correspond to respective neuromeres. Previous studies demonstrated that the cell populations of the IPN express several transcription factors (TF) (Nkx6.1, Pax7, Otp, Otx2, Irx2) during the development of this structure, thus allowing to determine their origin, migratory pathways, and final fate. In study 1 (García-Guillén et al., 2020) the objective was to study the IPN migration process in a mouse mutant lacking DCC (Deleted in Colorectal Cancer), which is a receptor for Netrin-1. This molecule participates in multiple migration processes during hindbrain development. The principal technique used was in situ hybridization with RNA probes for the forementioned TF in knockout DCC-/-versus wildtype brains. Next, in study 2 (García-Guillén et al., 2021) we focused on the regionalization within this nucleus, by searching for genes differentially expressed within the subregions of the IPN. We performed this screening in the Allen Developing Mouse Brain Atlas (ADMBA) (https://developingmouse.brain-map.org/). Studies 1 and 2 were performed at perinatal stages (mainly E18.5 and also P4) because the IPN is a late-formation nucleus, so that the screening of genes was thought to give rise genes that could participate both in the neuronal migration and in the regionalization of this nucleus. Concerning the trigeminal sensory column, it extends along most of the hindbrain, spanning thus several rhombomeres. This column is formed by the principal sensory nucleus (Pr5), located in rhombomeres r2 and r3, and the spinal trigeminal nucleus (Sp5), which covers from r4 down to the hindbrain/spinal cord boundary, according to previous studies in the mouse. The objective pursued in study 3 (García-Guillén et al., 2021b) was to study its segmental or neuromeric organization, by looking for genes differentially expressed within this structure. For this, we searched the databases ADMBA and the Allen Mouse Brain Atlas (AMBA) (https://mouse.brain-map.org/) at juvenile (P4, P14, P28) and adult (P56) stages, since we aimed to provide new molecular support for the possible rhombomeric subdivisions of this structure that would be not only transient in the embryo but also maintained in the adult brains. Results from study 1 show that the Netrin-1/DCC signaling pathway is one of the mechanisms involved in the migration of the IPN, since in the mutant there is a general but differential impairment of neuronal migration of all the populations analyzed. The absence of DCC mainly affects those of the Pro and IPR domains of this nucleus. In study 2 we retrieved 135 genes expressed in the IPN in a regionalized way. The functional analysis of these genes highlighted an overrepresentation of gene families related to neuron development, cell morphogenesis and axon guidance. In study 3, we characterized the expression pattern of 12 genes differentially expressed along the trigeminal column: Baiap3, Camk2a, Calb1, Calb2, Irx2, Kcng4, Fn1, Mafb, Tac1, Tac2, Pde1c and Zbtb16. Through the analysis of the pattern of these genes, we provided new genetic support of the segmentation of this column in the adult. On the whole, these works provide new knowledge on the developmental mechanisms of two hindbrain structures, the IPN and the trigeminal sensory column, as examples of cell migration and segmentation. This contribution can serve as basis for further studies on the function or pharmacology of both structures, or can be applied as well to the study of other neuronal populations in whose formation the migration and/or the segmentation are involved.