Bases moleculares de la interacción, de proteínas de transporte vesicular

Las vesículas intracelulares se transportan de un orgánulo a otro en respuesta a distintos estímulos. La dirección y eficacia de la entrega de vesículas hasta su membrana de destino están mediadas por la señalización celular, llevada a cabo por numerosas proteínas y segundos mensajeros. Rabfilina3A (Rph3A) es una proteína del tráfico de membranas, sensible a dos segundos mensajeros, calcio (Ca2+) y fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). PKCε es una proteína quinasa implicada en rutas de señalización que actúa fosforilando a otras proteínas, y responde a distintos lípidos como diacilglicerol (DAG) y ácido fosfatídico (PA). Nuestro grupo de investigación en colaboración con el Instituto de Biología Molecular de Barcelona, han resuelto las estructuras 3D de los dominios C2 de Rabfilina3A unidos a Ca2+ y PIP2, y también del dominio C2B unido a SNAP25. Además, se determinó previamente que PKCε responde a PA. Por tanto, uno de los objetivos de esta tesis doctoral fue caracterizar la función de Rabfilina3A y descubrir nuevas proteínas moduladoras de su función. El segundo objetivo fue investigar el papel que podría tener el PA sobre PKCε en la secreción de vesículas de los mastocitos. Para lograr estos objetivos, se utilizaron técnicas de biología molecular para clonar y mutar genes. Se usaron dos líneas celulares como modelos vivos: la línea celular PC12 como modelo adrenal, también diferenciada con factor de crecimiento neuronal (NGF) a un modelo neuronal, y la línea celular RBL-2H3 como modelo de mastocitos. Se empleó el ensayo de ligación por proximidad (PLA) con microscopía confocal para estudiar la localización e interacciones proteína-proteína. Además, se utilizaron técnicas "ómicas" para la identificación masiva de proteínas cercanas a Rabfilina3A, acoplando la técnica de marcaje por proximidad dependiente de biotina (BioID2) con espectrometría de masas. Los resultados obtenidos muestran que el dominio C2B de Rabfilina3A presenta una fuerte región electropositiva, en la zona de interacción con SNAP25 que no está conservada en Sinaptotagmina1. Rabfilina3A parece interaccionar con VAMP2, Sinaptotagmina1 y SNAP25 en las vesículas de transporte, pero sólo con SNAP25 y Sinaptotagmina1 en la membrana plasmática. La zona de interacción de SNAP25 con Rabfilina3A, y la interacción de Rabfilina3A con PIP2 parecen ser claves para la correcta localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Además, la sobreexpresión de Rabfilina3A en un fenotipo neuronal promueve la localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Se caracterizó el interactoma circundante a Rabfilina3A y se descubrió que Rabfilina3A interacciona con STIM1, y Tcp11l1. STIM1 es una proteína del retículo endoplasmático (RE) encargada de detectar y ayudar a restaurar los valores de Ca2+ en el RE. Tcp11l1 es una proteína de función desconocida. El interactoma realizado de Tcp11l1 muestra que es una proteína que interacciona con proteínas del citoesqueleto como tubulina y β-actina. En consecuencia, en relación con el primer objetivo de este tesis, se propone un modelo en el que Rabfilina3A contribuye al transporte de vesículas y de SNAP25 a la membrana plasmática gracias a la interacción con Tcp11l1, posteriormente Rabfilina3A vuelve a su situación de partida gracias a STIM1. Los resultados del segundo objetivo sugieren que el borde del bolsillo de unión a DAG del dominio C1B de PKCε es fuertemente electropositivo permitiendo su unión a PA. La activación de PKCε por PA junto con el Ca2+ desencadena un incremento de la fusión de vesículas en mastocitos. Este hallazgo se correlaciona con el aumento de la fosforilación de SNAP23 en respuesta a la interacción de PKCε con PA. Por tanto, se sugiere un modelo en el que PKCε es activada por PA y fosforila a SNAP23 facilitando la fusión de vesículas. Intracellular vesicles are transported from one organelle to another in response to various different stimuli. The direction and efficiency of vesicle delivery to their target membrane are mediated by cell signalling and carried out by numerous proteins and second messengers. Rabphilin3A (Rph3A) is a membrane trafficking protein that responds to two second messengers, calcium (Ca2+) and phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate (PIP2). PKCε is a protein kinase involved in signalling pathways by phosphorylating other proteins and responding to various lipids such as diacylglycerol (DAG) and phosphatidic acid (PA). The biomembranas research at the University of Murcia, in collaboratrion with the Institute of Molecular Biology in Barcelona have solved the 3D structure of the C2 domains of Rabphilin3A bound to Ca2+ and PIP2, and also the C2B domain bound to SNAP25. Moreover, PKCε has already been found to be sensitive to PA by researchers in my group. One of the objectives of this Ph.D. thesis was to characterize the function of Rabphilin3A and to determine novel proteins that modulate it. The second objective was to investigate the role that PA might have on PKCε during vesicle secretion in mast cells.To achieve these goals, molecular biology techniques were used to clone and mutate different genes of interest. Two cell lines were used as in vitro models: the PC12 cell line as an adrenal model, which was also differentiated with neuronal growth factor (NGF) as a neuronal model, and the RBL-2H3 cell line as a mast cell model. Proximity ligation assay (PLA) with confocal microscopy was used to study protein localization and interactions. In addition, "omics" techniques were used for high-throughput identification of proteins in the vicinity of Rabphilin3A, hence coupling proximity-dependent biotin identification (BioID2) with mass spectrometry. The results obtained show that the C2B domain of Rabphilin3A has a strong electropositive area in the SNAP25-interacting region that is not conserved in Synaptotagmin1 (Syt1). Rabphilin3A appears to interact with VAMP2, Sinaptotagmina1, and SNAP25 on vesicles, but only with SNAP25 at the plasma membrane. The interaction site of SNAP25 with Rabphilin3A and the interaction of Rabphilin3A with PIP2 appear to be key for the correct location of SNAP25 at the plasma membrane. Furthermore, overexpression of Rabphilin3A in a neuronal phenotype promotes the location of SNAP25 at the plasma membrane. The Rabphilin3A interactome shows that Rabphilin3A interacts with STIM1 and Tcp11l1. STIM1 is an endoplasmic reticulum (ER) protein involved in Ca2+ sensing in the ER. Tcp11l1 is a protein of unknown function, but its interactome shows that Tcp11l1 is a protein that interacts with cytoskeletal proteins such as tubulin and β-actin. Consequently, relating back to the first objective of this thesis, a model is proposed in which Rabphilin3A contributes to the transport of vesicles and SNAP25 to the plasma membrane as a result of the interaction with Tcp11l1, Rabphilin3A then returns to its initial state as a result of the interaction with STIM1. Moreover, with the regards to the second goal of this thesis, results suggest that the edges of the DAG-binding pocket of the C1B domain of PKCε are strongly electropositive, allowing its binding to PA. Activation of PKCε by PA together with Ca2+ triggers vesicle fusion in mast cells. This finding correlates with the increase in SNAP23 phosphorylation in response to the interaction of PKCε with PA. Therefore, a model is proposed here in which PKCε is activated by PA and phosphorylates SNAP23, facilitating vesicle fusion