Utjecaj mutacija na dodirnoj površini podjedinica na kinetičke i dinamičke karakteristike alkalne fosfataze kod E. coli

Alkalna fosfataza (AP, E.C. 3.1.3.1) je nespecifična fosfomonoesteraza koja katalizira hidrolizu velikog broja fosfomonoestera. AP pokazuje odstupanja od Michaleis-Menten kinetike koja se mogu objasniti modelom dimernog enzima s nejednakim podjedinicama. Predloženi model opisuje mehanizam hidrolize supstrata uslijed konformacijskih promjena na dodirnoj površini podjedinica. Značaj dodirne površine podjedinica i β -nabrane ploče koja se proteže ispod aktivnog mjesta do površine podjedinice, ispitana je metodom usmjerene mutageneze kojom su dobiveni mutantni enzimi s jednom (T81A), odnosno dvije (T81A/Q83L) mutacije. Mutirane aminokiseline Thr-81 i Gln-83 smještene su u β -nabranoj ploči koja se nalazi na dodirnoj površini između susjednih podjedinica. Mutirani enzimi su pročišćeni i uspoređeni sa divljim tipom AP. Analizirani su kinetički parametari te su ispitana dinamička svojstva enzima mjerenjem fosforescencije pri sobnoj temperaturi. Kinetičke karakteristike ispitivane su u 1 M Tris/HCl, pH 8, te u 0, 35 M 2A2M1P, pH 10, 5 puferu. Mutacije na dodirnoj površini podjedinica, utjecale su na strukturnu stabilnost proteina i na njegove kinetičke karakteristike, ukazujući na važnost interakcije dodirnih površina na katalitički mehanizam.