Combined Effect of Tumor Necrosis Factor-alpha and Ionizing Radiation on the Induction of Apoptosis in 5637 Bladder Carcinoma Cells

Apoptosis can be induced by distinct but overlapping pathways. Ionizing radiation induces apoptosis by an “intrinsic”, mitochondria-dependent pathway. Ligation of tumor necrosis factor-(TNF-)α, FAS (CD95) or TRAIL receptors are typical representatives of an extrinsic, death-receptor-mediated pathway. In this study the effect of irradiation, treatment with the cytokine TNF-α, or a combination of both on the induction of apoptosis and clonogenic survival of bladder carcinoma cells was investigated. 5637 bladder carcinoma cells were treated with different concentrations of recombinant TNF-α (0–10 ng/ml), irradiated with single doses ranging from 0.5 to 10 Gy, or a combination of both modalities. Apoptotic cells were quantified by the TUNEL assay up to 96 h following treatment, clonogenic cell survival by a clonogenic assay. Synergistic effects of both modalities were evaluated using isobolographic analysis. Irradiation of 5637 carcinoma cells resulted in a discontinuous dose dependence of the apoptotic fraction with a pronounced increase in the range of 0–2 Gy and a slighter increase at 2–10 Gy. The percentage of apoptotic carcinoma cells also increased continuously after treatment with lower concentrations of TNF-α reaching a plateau at concentrations of 5.0–10.0 ng/ml. Isobolographic analysis revealed a supraadditive interrelationship between irradiation and TNF-α in the range between 0.005 and 0.5 ng/ml, and an additive effect for TNF-α concentrations > 0.5 ng/ml. The additive effects were confirmed in clonogenic survival assays with reduced survival fractions following combined TNF-α administration and irradiation. The combination of two apoptosis-inducing modalities resulted in a synergistic effect on the induction of apoptosis in 5637 bladder carcinoma cells. Although a radiosensitizing effect still has to be proven in animal models, combined-modality treatment may increase the therapeutic effectiveness of irradiation in bladder cancer. Apoptose kann durch unterschiedliche, teilweise überlappende Reaktionswege induziert werden. Während ionisierende Strahlung Apoptose über eine intrinsische, mitochondrienabhängige Reaktionskaskade vermittelt, stellen die Aktivierung von Tumor-Nekrose-Faktor-(TNF-)α, FAS-(CD95-) oder TRAIL-Rezeptoren typische Beispiele der extrinsischen, „Todesrezeptor“-vermittelten Induktionskaskade dar. In dieser Studie wurde der Effekt einer Bestrahlung, der Gabe des Zytokins TNF-α oder einer kombinierten Therapie auf die Apoptoserate bzw. das klonogene Überleben einer Blasenkarzinomzelllinie untersucht. 5637-Blasenkarzinomzellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem TNF-α (0–10 ng/ml), Bestrahlung mit Dosen von 0,5–10 Gy oder der Kombination aus beiden Modalitäten behandelt. Die Apoptoserate wurde mit dem TUNEL-Assay bis 96 h nach Behandlung bestimmt, das klonogene Überleben in einem Koloniebildungstest. Synergistische Effekte beider Behandlungsmodalitäten wurden in einer isobolographischen Analyse ermittelt. Die alleinige Bestrahlung der 5637-Karzinomzellen wies eine diskontinuierliche Dosisabhängigkeit der Apoptoseinduktion mit einem steileren Anstieg im Dosisbereich von 0–2 Gy und einer geringeren Steigerung im Bereich von 2–10 Gy auf. Der Anteil apoptotischer Karzinomzellen stieg nach Behandlung mit geringeren Dosen von TNF-α kontinuierlich an und erreichte ein Plateau bei Konzentrationen von 5,0–10,0 ng/ml. Die isobolographische Analyse zeigte für die Kombination von Bestrahlung und TNF-α im Konzentrationsbereich von 0,005–0,5 ng/ml einen supraadditiven Effekt und einen additiven für TNF-α-Konzentrationen > 0,5 ng/ml. Diese additiven Effekte wurden im Koloniebildungstest durch verminderte Überlebensfraktionen nach TNF-α- Gabe und Bestrahlung bestätigt. Die Kombination zweier apoptoseinduzierender Modalitäten zeigte einen synergistischen Effekt auf die Induktion der Apoptose und Minderung des Zellüberlebens in 5637-Karzinomzellen. Obwohl eine strahlensensibilisierende Wirkung noch in Tiermodellen überprüft werden muss, könnte die Kombinationstherapie die therapeutische Effektivität einer Bestrahlung des Blasenkarzinoms steigern.