Ein Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Assay zur Bestimmung der Aktivität von Tryptophan-Halogenasen.

Die Anwendung von Tryptophan ‐ Halogenasen für die enzymatische Halogenierung hat noch gravierende Limitierungen. Diese könnten mittels gerichteter Evolution überwunden werden, jedoch bedarf die Durchmusterung großer Mutantenbibliotheken eines robusten Hochdurchsatz ‐ fähigen Testsystems. Im Hinblick darauf wurde eine Suzuki ‐ Miyaura ‐ Kreuzkupplung als quantitativer Halogenase ‐ Assay auf Basis der Bildung eines fluoreszierenden Aryltryptophans entwickelt. Die Methode wurde für die Anwendung im E. ‐ coli ‐ Lysat ohne intermediäre Aufarbeitung optimiert und ermöglicht es, halogenierte Tryptophanderivate mit hoher Spezifität in der Mikrotiterplatte quantitativ nachzuweisen. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde eine thermostabile Tryptophan ‐ 6 ‐ Halogenase gefunden, indem mittels fehlerbehafteter PCR eine Mutantenbibliothek erzeugt wurde, die mithilfe der fluorogenen Kreuzkupplung auf erhöhte Thermostabilität durchmustert wurde. Diese Methode lieferte eine verbesserte Enzymvariante mit deutlich gesteigerter Stabilität sowie 2.5 ‐ fach verbesserter Aktivität. Nadel im Heuhaufen: Die Synthese eines fluoreszierenden Aryltryptohans mittels Suzuki ‐ Miyaura ‐ Kupplung (siehe Schema) ermöglicht die spezifische Detektion von C5 ‐ , C6 ‐ und C7 ‐ bromiertem Tryptophan im E. ‐ coli ‐ Lysat. Dies bietet eine Basis für einen Hochdurchsatz ‐ Assay zum Aktivitätsnachweis von Tryptophan ‐ Halogenasen im Protein ‐ Engineering. Die Anwendung dieses Screenings in der zufallsbasierten Mutagenese lieferte eine thermostabile Tryptophan ‐ 6 ‐ Halogenase ‐ Variante. [ABSTRACT FROM AUTHOR]