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Vaccination has been used to prevent the losses associated with Bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1) infection but passively acquired antibodies may compromise vaccine efficacy. Intranasal immunization (IN) of calves with modified live viral BoHV-1 vaccines has proven to overcome the acquired passive antibodies and confer adequate protection. Herein, we evaluated the safety and immunogenicity of a glycoprotein E-deleted Brazilian BoHV-1 strain (BoHV-1gEΔ) for IN immunization of calves. Ten 1-to-2 months-old calves with virus-neutralizing titers (VN) ranging from 2-64 were immunized IN with viable BoHV-1gEΔ (107.1 TCID50) and four remained as unvaccinated controls (VN titers 8-32). After IN immunization, calves presented a transient (2-6 days) mild nasal secretion and shed the vaccine virus in nasal secretions in low titers (

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Ascaris lumbricoides e Ascaris suum são parasitos causadores da ascaridíase, doença que leva a quadros de desnutrição e tem grande impacto especialmente no desenvolvimento de crianças infectadas. Ambos os parasitos são capazes de infectar humanos e são por vezes considerados uma única espécie. Estima-se que 800 milhões de pessoas estão infectadas por A. lumbricoides e as medidas profiláticas que visam o controle do mesmo são limitadas, principalmente em regiões endêmicas. Usadas há séculos, as vacinas, são uma estratégia de intervenção que possuem melhor custo- benefício, sendo as recombinantes, uma das mais promissoras contra uma gama de patógenos e tumores. A produção de vacinas em plantas tem sido estudada há algum tempo, apresentando resultados positivos e grandes vantagens. Assim sendo, o presente trabalho visou a produção de uma vacina quimera e linhagens transgênicas de Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom e Arabidopsis thaliana expressando de forma ectópica a sequência do antígeno vacinal contra A. suum. Para tanto, foram selecionados epítopos para a construção da proteína quimera. Fêmeas de camundongos BALB/c foram imunizadas e pode- se constatar que animais imunizados com a proteína quimera juntamente com MPLA (Formulação Vacinal) apresentaram uma redução de cerca de 73,54% na carga parasitária em relação ao grupo controle imunizado com PBS. Em análise histopatológica, foi possível verificar uma redução da inflamação no pulmão e do espessamento dos septos no grupo imunizado apenas com a proteína quimera bem como no imunizado com a Formulação Vacinal. O grupo imunizado com a Formulação Vacinal apresentou, ainda, maior produção de IgG do que os demais grupos.Em ELISA foi verificado o reconhecimento da proteína quimera por soro de animais infectados com A. suum. Foi estabelecido um protocolo para a imunização de camundongos com a proteína quimera por via oral, bem como verificada a bioacessibilidade da mesma em digestão in vitro. Plantas de Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom e Arabidopsis thaliana foram transformadas geneticamente, obtendo plantas transgênicas na geração T1, com a inserção do gene da proteína quimera, confirmada por PCR e seleção por antibiótico. Por conseguinte, pode-se inferir que a proteína quimera é um bom alvo vacinal frente à infecção por A. suum, sendo seu uso benéfico para o controle da ascaridíase e que a inserção do gene do imunógeno em plantas pode vir a ser um caminho para a produção de vacinas.

Submitted by Roberto Alexandre Yamawaki (ra.yamawaki@unesp.br) on 2020-08-17T17:46:42Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Mestrado_Versão_Definitiva_ Roberto_Alexandre_Yamawaki.pdf: 1193518 bytes, checksum: 6cf33aafe1836863a9fbd2c84afc2eb4 (MD5) Approved for entry into archive by Laudicélia Martins Arantes (lm.arantes@unesp.br) on 2020-08-18T16:25:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 yamawaki_ra_me_jabo.pdf: 1193518 bytes, checksum: 6cf33aafe1836863a9fbd2c84afc2eb4 (MD5) Made available in DSpace on 2020-08-18T16:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 yamawaki_ra_me_jabo.pdf: 1193518 bytes, checksum: 6cf33aafe1836863a9fbd2c84afc2eb4 (MD5) Previous issue date: 2020-07-28 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE) é o principal agente de doenças transmitidas por alimentos (DTA) em seres humanos. Vacinação apresenta-se como uma das ferramentas mais utilizadas para prevenir a colonização e infecção por SE em aves. O presente estudo avaliou a eficácia de um candidato vacinal recombinante contra SE. Trinta aves matrizes pesadas e cinco aves machos com 10 semanas e status Salmonella-free foram alojadas e divididos em 3 grupos: não vacinado (NV), vacinado com candidato vacinal recombinante (VAC) e vacinado com bacterina comercial (BAC). Amostras de soro e ovos embrionados foram colhidos em dois períodos após a dose booster, para quantificação da taxa de transferência de IgY para os ovos e a progênie. Quarenta pintos de um dia da progênie foram divididos em dois grupos, NV e VAC, e desafiados com 107 UFC de SE no segundo dia de vida. Soro, fragmentos de intestino e fígado e conteúdo cecal foram colhidos em cada grupo. Os níveis de IgY foram significativamente maiores no grupo VAC comparado com o NV em todos os períodos no soro e gema de ovos embrionados de matrizes pesadas e no soro das progênies, sendo as taxas de transferências de IgY maiores no grupo VAC comparado com grupo BAC. Foram encontradas maiores relações vilo-cripta no duodeno, jejuno e íleo a 4 dpi na progênie do grupo VAC. Foi utilizado uma elevada dose desafio de SE (107 UFC/pinto), no entanto, apesar da forte resposta imune, não houve diferença estatística na recuperação de SE no conteúdo cecal das progênies. Assim, outros estudos sobre a capacidade de estímulo a resposta imune mediada por células, a proteção a diferentes doses desafio e capacidade de proteção direta na ave vacinada, auxiliarão na elaboração dessa vacina. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE) is the main cause of foodborne diseases (FBD) in humans. Vaccination is one of the most used tools to prevent colonization and infection by SE in birds. The present study evaluated the effectiveness of a candidate for SE recombinant vaccine. Thirty broiler breeders and five roosters with 10 weeks age and Salmonella-free status were housed and divided into 3 groups: unvaccinated (UV), vaccinated with recombinant vaccine candidate (VAC) and vaccinated with commercial bacterin (BAC). Samples of serum and embryonated eggs were collected 7 and 12 weeks after the booster dose, to quantify the transfer rate of IgY to the eggs and the progeny. Forty day-old progeny chicks were divided into two groups, UV and VAC, and challenged with 107 CFU of SE on the second day of life. Serum, fragments of intestine and liver and cecal content were collected in each group. The IgY levels were significantly higher in the VAC group compared to the UV in all periods in the egg yolk and broiler breeders’ serum and in the progeny’s serum, with the IgY transfer rates being higher in the VAC group compared to the BAC group. Greater vilo-crypt ratio were found in the duodenum, jejunum and ileum at 4 dpi in the progeny of the VAC group. A high challenge dose of SE (107 CFU / chick) was used, however, despite the strong immune response, there were no statistical difference in the recovery of SE in the progenies’ cecal contents. Thus, more studies on the ability to stimulate the cell-mediated immune response, the protection at different challenge doses and the ability to directly protect the vaccinated poultry will assist in the development of this vaccine.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Erysipelothrix rhusiopathiae is a gram-positive, bacilliform, and encapsulated bacterium that causes swine erysipelas, a disease characterized by skin lesions and other symptoms such as septicemia, arthritis, and endocarditis in the affected animals. Vaccines from attenuated or inactive E. rhusiopathiae cells are available on the market, but they are not so effective to overcome the acute form of the disease. Also, they can aggravate the symptoms of the chronic form. E. rhusiopathiae extracellular proteins were detected as potentially antigenic. It has previously been cloned the coding sequences for 11 genes related to these proteins in the pJET1.2/blunt vector and pET28 expression vector. The present work aims to perform heterologous expression of four of these proteins, named P1, P3, P6, and P7, for functional characterization of their in vitro antigenicity and protection character against E. rhusiopathiae in a murine model. For this, the following was performed: production of recombinant forms of P1 and P7 proteins in Escherichia coli Rosetta strain (DE3) and of P3 and P6 proteins in BL21 (DE3) strain; purification of the four recombinant proteins by affinity and molecular exclusion chromatography. All recombinant proteins were successfully expressed in E. coli and were functionally evaluated for: in vitro antigenicity by Western blot and ELISA, using sera from swine immunized with the available commercial vaccine; protective effect in mice by challenging with E. rhusiopathiae and monitoring of the animals survival; in vitro antigenicity by ELISA using sera from mice immunized with recombinant proteins and challenged with E. rhusiopathiae. The results demonstrated that all proteins are antigenic in pigs and mice, but only P7 protein provides survival for at least one of the six challenged mice. This work leads to the conclusion that the immunoproteomic analysis was a useful tool for the discovery of new antigens of E. rhusiopathiae, however, the antigenic proteins have limited protection effect for the proposals of effective new vaccines. New studies need to be carried out in order to verify whether the protective effect of the recombinant proteins studied here can be enhanced by changing the dosage or administration routes, or even by a combination of P7 protein with other antigenic proteins for a greater protective efficacy against E. rhusiopathiae. Erysipelothrix rhusiopathiae é uma bactéria Gram positiva, baciliforme e encapsulada, que causa erisipela suína, doença caracterizada por lesões cutâneas e outros sinais como septicemia, artrites e endocardites nos animais afetados. Vacinas a partir de células atenuadas ou inativadas de E. rhusiopathiae estão disponíveis no mercado, porém não são tão eficazes no combate à forma aguda da doença, além de agravarem sintomas da forma crônica. Proteínas extracelulares de E. rhusiopathiae foram detectadas como sendo potencialmente antigênicas, tendo sido clonadas as sequências codificadoras de 11 genes correspondentes a essas proteínas em vetor de propagação pJET1.2/blunt e de expressão pET28. O presente trabalho visa dar continuidade a este trabalho anterior pela expressão heteróloga de quatro dessas proteínas, denominadas P1, P3, P6 e P7, para a caracterização funcional das mesmas quanto à antigenicidade in vitro e ao seu caráter protetor contra E. rhusiopathiae em modelo murino. Para isto, foram realizadas: produção em Escherichia coli das proteínas P1 e P7 na forma recombinante em linhagem Rosetta (DE3) e das proteínas P3 e P6 em linhagem BL21 (DE3); purificação das proteínas recombinantes por cromatografias de afinidade e exclusão molecular. Todas as proteínas recombinantes foram expressas com sucesso em E. coli e foram avaliadas funcionalmente quanto à (ao): antigenicidade in vitro por Western blot e ELISA utilizando soro de suínos previamente imunizados com a vacina comercial disponível; efeito protetor em camundongos, os quais foram desafiados com E. rhusiopathiae e monitorados quanto à sobrevivência; antigenicidade in vitro por ELISA utilizando soros de camundongos imunizados com as proteínas recombinantes e desafiados com E. rhusiopathiae. Os resultados demonstraram que todas as proteínas foram antigênicas em suínos e camundongos, porém somente a proteína P7 proporcionou sobrevida para ao menos um dos seis camundongos desafiados. Este trabalho nos leva a concluir que a análise imunoproteômica foi uma ferramenta eficaz para a descoberta de novos potenciais antígenos de E. rhusiopathiae, no entanto as proteínas antigências possuem efeito protetor limitado para fins de proposição de novas vacinas. Novos estudos precisam ser realizados a fim de se verificar se o efeito protetor das proteínas recombinantes aqui estudadas pode ser mais eficaz por modificação da dosagem e/ou via de administração, ou ainda, se a imunização combinada da proteína P7 com outras proteínas antigênicas poderia apresentar maior eficácia protetiva contra E. rhusiopathiae. CAPES: Código de Financiamento 001

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A dengue é uma das principais arboviroses que afeta o ser humano e um grave problema de saúde pública. Os quatro sorotipos do Dengue virus (DENV1, 2, 3 e 4) são transmitidos através da picada de mosquitos fêmea do gênero Aedes. A vacina disponível atualmente apresenta lacunas imunológicas, o que motiva a continuidade de pesquisas em busca de uma vacina eficaz. O vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) está entre os vetores virais mais promissores e intensamente estudados mundialmente e é considerado como uma excelente ferramenta para a geração de vacinas. O objetivo dessa pesquisa foi construir MVA recombinantes expressando a proteína E de DENV1, 2 e 4 e avaliar o potencial protetor dessas construções em modelo murino. Genes sintéticos da proteína E de DENV1, 2 e 4 foram desenhados, otimizados, obtidos comercialmente e subclonados no plasmídeo pLW44, dando origem aos plasmídeos de transferência, utilizados na construção dos vírus recombinantes. Culturas de fibroblasto de embrião de galinha (CEF) ou BHK-21 foram infectadas por MVA e transfectadas pelos plasmídeos de transferência pLW44-DENV1, pLW44-DENV2 ou pLW44-DENV4, separadamente, para a construção dos MVAs recombinantes (rMVAs). Os rMVAs gerados tiveram a sua construção confirmada por PCR, sequenciamento e citometria de fluxo. O potencial protetor do rMVA-DENV1 foi testado em camundongos C57/BL6 em esquema de imunização dose-reforço homólogo, seguido de desafio intracranial com o DENV correspondente. Os animais foram imunizados com 107 pfu ou 108 pfu de rMVA-DENV1 e desafiados com DENV1 Mochizucki. Durante o desafio os animais foram monitorados e avaliados quanto ao seu estado geral de saúde pelo protocolo SHIRPA. Com base nos resultados obtidos podemos concluir que as construções dos diferentes vírus recombinantes se deram de maneira eficaz, sobretudo a de rMVA-DENV1, a única testada quanto à capacidade protetora. Os dados gerados nessa pesquisa serão somados aos obtidos anteriormente para DENV3 visando à obtenção de uma vacina tetravalente contra DENV. Dengue is the main arbovirus that affecting humans and a serious public health problem. The four dengue virus serotypes (DENV1, 2, 3 and 4) are transmitted through the bite of female Aedes mosquitoes. A vaccine available worldwide has immunological gaps, which motivates further research for an effective vaccine. The Modified Vaccinia Ankara Virus (MVA) is among the most advanced and intensely studied viral vectors worldwide, and is considered as an excellent tool for vaccine generation. The aim of this work was to construct recombinant MVAs expressing the protein E of DENV1, 2 and 4 and to evaluate the protective potential of these constructs in a murine model. Synthetic genes coding for protein E from DENV1, 2 and 4 were designed, optimized, commercially obtained and subcloned into plasmid pLW44, giving rise to transfer plasmids used in the construction of recombinant viruses. Chicken embryo fibroblast cultures – CEF, or BHK-21 were infected with MVA and transfected with the transfer plasmids pLW44-DENV1, pLW44-DENV2 and pLW44-DENV4 for the construction of recombinant MVAs (rMVA). The generated rMVAs had their correct construction confirmed by PCR, sequencing and flow cytometry. The protective potential of rMVA-DENV1 was tested in C57 / BL6 mice on a homologous dose-boosting immunization schedule, followed by intracranial challenge with the corresponding DENV. Animals were immunized with 107 pfu or 108 pfu of rVA-DENV1 and challenged with DENV1 Mochizuki. During the challenge, they were monitored evaluated through a SHIRPA protocol. Based on the results we can conclude that the construction of the different recombinant viruses was effective, especially rMVA-DENV1, the only one tested for protective capacity. The data generated in this research can be added to those previously obtained for DENV3 in order to obtain a tetravalent vaccine against DENV.

O carrapato bovino Rhipicephalus microplus é um ectoparasita que transmite patógenos causadores de doenças, como babesiose (Babesia bovis e B. bigemina) e anaplasmose (Anaplasma marginale). Como as vacinas comerciais atualmente disponíveis oferecem apenas uma proteção parcial contra R. microplus, a necessidade de se buscar vacinas mais eficientes é uma tarefa contínua. Proteínas recombinantes foram avaliados usando diferentes estratégias de imunização e elas representam uma grande promessa de potenciais vacinais. Este trabalho teve como objetivo principal, selecionar antígenos candidatos à vacina contra carrapatos Rhipicephalus microplus e posteriormente caracterizar, por métodos moleculares, desenvolvendo uma vacina baseada na proteína recombinante rRmLTI-rBmCG-LTB contra o ectoparasita. Outro objetivo deste trabalho, foi avaliar por métodos in silico, a possibilidade de criar uma vacina global baseada em epítopos conservados da proteína Bm86, contra carrapatos Rhipicephalus microplus. Os antígenos selecionados são partes das proteínas RmLTI e Bm86-CG, fusionados a um antígeno de Escherichia coli (subunidade B). Nesta mesma bactéria, em cepas distintas, foi possível clonar e expressar a proteína recombinate rRmLTI- rBmCG-LTB e caracterizá-la por Western blotting. A proteína recombinante foi avaliada como potencial imunógeno em teste de estábulo com modelos bovinos. A proteína recombinante homogeneizada em adjuvante Montanide? ISA 61 (Seppic), obteve 55,6% de eficiência vacinal. A análise dos soros dos bovinos em teste ELISA possibilitou verificar que a proteína recombinante rRmLTI- rBmCG-LTB, aumentou a imunidade humoral adquirida contra este antígeno. Conclui-se que, foi possível selecionar os antígenos contra o carrapato Rhipicephalus microplus, além de caracterizar e desenvolver uma proteína recombinante com os antígenos selecionados. Apesar da eficiência encontrada para os antígenos serem razoáveis, pesquisas para melhorar esta ferramenta de controle serão indispensáveis. Com relação à possiblidade de se fazer uma vacina global, distintas análises in silico possibilitaram obter três epítopos conservados para a proteína Bm86, que podem ser reconhecidos por células B e MHC, tornando-se potenciais imunogênicos tanto para populações de Rhipicephalus microplus de regiões geograficamente distintas como para a espécies irmã como R. australis, além de outras espécies como R. annulatus, R. decoloratus, devido ao carater conservado de seus peptídeos. Made available in DSpace on 2019-07-05T00:53:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Selecaodeantigenoscandidatosavacina.pdf: 5616456 bytes, checksum: c8cdb8be5d3aa5efc146f987a5d1e84b (MD5) Previous issue date: 2019 Orientação: Pesquisador da Embrapa Gado de Corte Renato Andreotti, matrícula: 239802 Coorientador Dr. Rodrigo Casquero Cunha.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Parapoxvirus ovis (PPVO) or orf virus (ORFV) is the causative agent of contagious ecthyma (or orf), a mucocutaneous disease that affects mainly sheep and goats. The ORFV belongs to the family Poxviridae, subfamily Chordopoxvirinae and genus Parapoxvirus. The virions are enveloped and their genome consist of a linear, double stranded DNA molecule of approximately 138 kb and contains at least 131 genes. ORFV has several biological and genomic properties that make it an attractive candidate for a vaccine vector. Therefore, it has been proposed as a vaccine platform to carry heterologous genes of veterinary interest. The first study reports the construction and characterization of two ORFV recombinants out of the parental strain ORFV IA82, expressing the rabies virus glycoprotein G (RABVG) at the loci of ORFV024 or ORFV121 genes, respectively, and an evaluation of their immunogenicity in swine and cattle. The in vitro characterization showed that the recombinants ORFVΔ024RABV-G and ORFVΔ121RABV-G retained their replicative capacity in cell culture, compared to the parental virus. The recombinant viruses expressed RABV-G efficiently even after 10 passages in cell culture, demonstrating the stability of the inserts. Immunization of swine and cattle with ORFVΔ024RABV-G and ORFVΔ121RABV-G resulted in a robust neutralizing antibody response against the rabies virus (RABV). The neutralizing antibodies titers induced by ORFVΔ121RABV-G in swine and cattle were higher than those induced ORFVΔ024RABV-G, indicating a higher efficiency of ORFVΔ121 as a vector in these species. In a second study, ORFV mutants with individual deletions of genes ORFV112, ORFV117 or ORFV127 were constructed, characterized in vitro and inoculated experimentally in lambs. When characterized in vitro, the deletion mutants replicated in ovine fetal turbinate (OFTu) cells with the same efficiency of the parental virus, with no changes in replication kinetics, plaque size and morphology. Experimental inoculation of lambs at the mucocutaneous junction of the oral commissure demonstrated that individual deletions of ORFV112, ORFV117 or ORFV127 genes did not result in obvious changes in virulence, since the mutants produced lesions as severe as those induced by the parental virus. However, resolution of the lesions apparently occurred more rapidly in the animals inoculated with the mutant virus than in those inoculated with the parental virus. In addition, the mutant viruses were excreted from the lesions in lower titers than those of the parental virus. These results demonstrated that genes ORFV112, ORFV117 and ORFV127 are not essential for viability of ORFV in vitro and interfere only partially in ORFV virulence in lambs. A third study was conducted to compare the magnitude and duration of the serological response induced in cattle by four commercial vaccines against RABV. After two vaccinations 30-days apart, the animals received a booster vaccination one year later, and were subjected to serological tests for virus neutralizing (VN) antibodies at different intervals after vaccination and booster. The four vaccines were found to be suitably immunogenic, e.g., induced high titers of VN antibodies in the animals after primary vaccination. However, a marked decrease in antibody levels was observed prior to the annual booster. Therefore, it is recommended that annual revaccination protocols be reviewed, since part of the vaccinated animals no longer have adequate antibodies levels one year after vaccination. In summary, the experiments presented in this thesis demonstrate that ORFV represents a promising platform for vectoring vaccine antigens in swine and cattle and that, in addition to the ORFV024 and ORFV121 genes, loci ORFV112, ORF117 and ORFV127 can also be used for heterologous gene insertion. O Parapoxvirus ovis (PPVO) ou vírus da orf (ORFV) é o agente do ectima contagioso (ou orf), uma enfermidade mucocutânea que afeta principalmente ovinos e caprinos. O ORFV pertence à família Poxviridae, subfamília Chordopoxvirinae e gênero Parapoxvirus. Os vírions possuem envelope e o genoma consiste de uma molécula de DNA linear e de fita dupla, com aproximadamente 138 quilobases (kb) e contém pelo menos 131 genes. O ORFV possui várias propriedades biológicas e genômicas que o tornam um atraente candidato a vetor vacinal. Por isso, tem sido proposto como plataforma vacinal para vetorar genes heterólogos de interesse veterinário. Em um primeiro estudo, descreve-se a construção e caracterização de dois recombinantes do ORFV, a partir da cepa parental ORFV IA82, que expressam a glicoproteína G do vírus da raiva (RABV-G) nos loci dos genes ORFV024 ou ORFV121, respectivamente, e a avaliação da sua imunogenicidade em suínos e bovinos. A caracterização in vitro demonstrou que os recombinantes ORFVΔ024RABV-G e ORFVΔ121RABV-G não apresentaram alterações na capacidade replicativa em cultivo celular, comparando-se ao vírus parental. Foi demonstrado que os recombinantes expressam a RABV-G com eficiência, mesmo após 10 passagens em cultivo celular, demonstrando a estabilidade dessas inserções. A imunização de suínos e bovinos com o ORFVΔ024RABV-G e ORFVΔ121RABV-G resultou em resposta robusta de anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva (RABV). Os títulos de anticorpos induzidos pelo recombinante ORFVΔ121RABV-G em suínos e bovinos foram superiores aos induzidos pelo ORFVΔ024RABV-G, indicando uma maior eficiência do recombinante ORFVΔ121 como vetor nessas espécies. Em um segundo estudo, mutantes do ORFV com deleções individuais nos genes ORFV112, ORFV117 ou ORFV127 foram construídos, caracterizados in vitro e inoculados experimentalmente em cordeiros. Quando caracterizados in vitro, os mutantes de deleção replicaram em células de corneto etmoidal ovino (OFTu) com a mesma eficiência do vírus parental, sem alterações na cinética de replicação, tamanho e morfologia de placas virais. A inoculação experimental de cordeiros na junção mucocutânea da comissura oral demonstrou que as deleções individuais dos genes ORFV112, ORFV117 ou ORFV127 não resultaram em alterações evidentes de virulência, pois os mutantes produziram lesões tão severas quanto as induzidas pelo vírus parental. No entanto, a resolução das lesões aparentemente ocorreu de forma mais rápida nos animais inoculados com os vírus mutantes do que naqueles inoculados com o vírus parental. Além disso, os vírus mutantes foram excretados das lesões em títulos inferiores aos do vírus parental. Estes resultados demonstraram que os genes ORFV112, ORFV117 e ORFV127 não são essenciais para a viabilidade do ORFV in vitro ou in vivo e interferem apenas parcialmente na virulência em ovinos. Um terceiro estudo foi conduzido para comparar a magnitude e duração da resposta sorológica induzida em bovinos por quatro vacinas comerciais contra o RABV. Após duas vacinações com intervalo de 30 dias, os animais receberam reforço vacinal um ano após, sendo submetidos a pesquisa e quantificação de anticorpos neutralizantes a diferentes intervalos após a vacinação e reforço. Verificou-se que as quatro vacinas são adequadamente imunogênicas, ou seja, induziram altos títulos de anticorpos neutralizantes nos animais após a primovacinação. Porém, verificou-se um decréscimo acentuado nos níveis de anticorpos antes do reforço, de forma que vários animais já não apresentavam níveis adequados de anticorpos por ocasião do reforço. Assim, recomenda-se que os protocolos de revacinação anual sejam revistos, antecipando-se a data prevista para reforçar a vacinação. Em resumo, os experimentos apresentados na presente tese demonstram que o ORFV representa uma plataforma promissora para vetorar antígenos vacinais em suínos e bovinos e que, além dos genes ORFV024 e ORFV121, os loci ORFV112, ORFV117 e ORFV127 também podem ser utilizados para a inserção de genes heterólogos de interesse.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_sergio_jorge.pdf: 2951290 bytes, checksum: 56f3ca5434b1ecaa09d8776156f09097 (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia (EP), a contagious respiratory disease that affects swine production worldwide. M. hyopneumoniae colonizes the ciliated epithelial cells of the respiratory tract, damaging the cells and predisposing the infected animals to secondary infections, causing significant economic losses. The commonly used vaccines to control this disease consist of inactivated whole cells (bacterins). These bacterins provide only partial protection and do not prevent the colonization of M. hyopneumoniae on the epithelial cells. Efforts to develop a more effective vaccine against mycoplasmas have been proposed and vaccines developed using recombinant DNA technology represents a promissing alternative. Although the genomes of four strains of. M hyopneumoniae have been sequenced, few recombinant antigens have been evaluated as candidate vaccines. Our research group produced and evaluated the immunogenicity and antigenicity of 35 secreted recombinant proteins and 6 transmembrane recombinant proteins. Some of these proteins were identified as having the potential to be used as vaccine antigens, including the molecular chaperone DnaK (P42 heat shock protein). The aim of this study was to assess the potential of recombinant P42 in vaccine preparations against EP, using swine animal model housed under field condictions in a M. hyopneumoniae-positive farm. Both, humoral and cellular immune responses were elicited when rP42 was delivered in Phosphate buffer saline, when combined to an oil based adjuvant, and when added to a whole cell vaccine preparation. The results indicate that immunization with rP42 emulsified in oil based adjuvant is able to induce antibodies against M. hyopneumoniae as well as the expression and the anti-inflammatory cytokine IL-10 in pigs. These immunogenic properties make recombinant antigen P42 a promising candidate for a recombinant subunit vaccine against EP. Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A bactéria coloniza e paralisa as células epiteliais do trato respiratório, predispondo o hospedeiro a infecções secundárias, causando significativas perdas econômicas. As vacinas atualmente disponíveis são compostas por células bacterianas inteiras inativadas (bacterinas), as quais proporcionam apenas uma proteção parcial aos suínos. Elas são capazes de reduzir as lesões pulmonares e os sinais clínicos, mas não impedem a colonização pelo agente. Com a finalidade de desenvolver uma vacina mais eficiente contra a PES, o uso da tecnologia do DNA recombinante representa uma estratégia promissora. Após o sequenciamento e análise proteômica de quatro cepas de M. hyopneumoniae, nosso grupo de pesquisa produziu e avaliou a imunogenicidade e antigenicidade de 35 proteínas recombinantes secretadas e 6 proteínas transmembrana. Algumas destas proteínas apresentaram potencial para serem usadas como antígenos vacinais, onde se destacou a chaperona molecular DnaK P42 (proteína de choque térmico). O objetivo deste estudo foi avaliar a proteina recombinante P42 em formulações vacinais contra a PES. Para tanto, foram realizados ensaios utilizando suínos mantidos em condições de campo numa granja com status de positiva para M. hyopneumonia. Foram avaliadas as respostas humoral e celular dos grupos de animais imunizados com a rP42 em tampão fosfato salina, com a rP42 emulsificada em adjuvante oleoso e com a rP42 associada à bacterina comercial. Os resultados mostraram que a imunização com rP42 emulsificada em adjuvante oleoso é capaz de induzir anticorpos contra M. hyopneumoniae além da expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Estas propriedades imunogênicas tornam o antigeno rP42 um candidato para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante contra a PES.

Valée S.A. Swine erysipelas is among the diseases that causes great economic losses in swine cultures worldwide. The disease is caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae, and the surface protein SpaA is one of its main antigens. Herein, we report studies concerning the development of recombinant vaccines against swine erysipelas based on the SpaA antigen. Protein production for a subunit vaccine formulation was studied in shaken flasks and 5.0 L bioreactors. For this propose, a 1026 bp fragment of the spaA gene was cloned in Escherichia coli cells under the lac promoter control. The recombinant organism (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) was cultivated in fed batch using complex medium with glycerol as carbon source. Nonconventional induction strategies were evaluated and high protein yield (198 mgprot/gDCW) and productivity values (0.4 gprot/L.h) were reached. The same antigen was cloned for expression and secretion in attenuated Salmonella typhimurium cells to obtain a live bacterial vector for the SpaA antigen. The recombinant lineage was able to express and secrete the SpaA fragment fused to the alpha-hemolysin secretion signal both in vitro and in vivo. High plasmid maintenance was observed in both conditions. The vaccinal vehicle showed to be able to colonize the Peyer patches and to invade the gut epithelial barrier in the inoculated animals. Immunization tests in murine model showed that the recombinant antigen delivered by Salmonella cells inoculated by oral route induced the production of seric IgG antibodies anti-SpaA. According to the literature, these antibodies must be able to promote pathogen opsonization in case of infection, contributing to confer a protective immunity against swine erysipelas to the vaccinated animals. In summary, this work presents contributions to development of subunit vaccines against swine erysipelas, in the form of recombinant protein formulations, or SpaA antigen delivery by attenuated S. typhimurium cells. A erisipela suína é uma das enfermidades que causam grandes prejuízos na suinocultura em todo o mundo. A doença é causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e a proteína de superfície SpaA desse microrganismo é um de seus principais antígenos. Neste trabalho, estudou-se o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a erisipela suína a partir do antígeno SpaA. Avaliou-se a produção de uma vacina de subunidade composta pelo antígeno recombinante, a qual foi estudada em frascos agitados e em biorretores de bancada de 5,0 L. Para isso, um fragmento de 1026 pb do gene spaA foi clonado em células de Escherichia coli sob controle do promotor lac e o organismo recombinante (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) foi cultivado em batelada alimentada, utilizando-se meio complexo contendo glicerol como fonte de carbono. Estratégias não convencionais de indução foram avaliadas e altos valores de rendimento (198 mgprot/gDCW) e produtividade (0,4 gprot/L.h) da proteína recombinante foram alcançados. O mesmo antígeno foi clonado em um plasmídeo que possibilita a expressão e secreção da proteína recombinante em Salmonella typhimurium atenuada, a fim de se obter um vetor bacteriano vivo para o antígeno em questão. A linhagem recombinante foi capaz de expressar e secretar o fragmento da proteína SpaA fusionado ao sinal de secreção da alfa-hemolisina tanto in vitro quanto in vivo, apresentando alta taxa de manutenção plasmidial nas duas condições. Além disso, o veículo vacinal se mostrou capaz de colonizar as placas de Peyer e de invadir a barreira epitelial do intestino dos animais inoculados. Ensaios de imunização em modelo murino mostraram que a veiculação do antígeno pelas células de Salmonella inoculadas por via oral induziu a produção de anticorpos IgG séricos anti-SpaA, que de acordo com a literatura, devem ser capazes de promover a opsonização do patógeno em caso de infecção, contribuindo para conferir uma imunidade protetora contra a erisipela suína aos animais vacinados. Em suma, este trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de vacinas de subunidade contra a erisipela suína na forma de uma vacina de proteína recombinante, ou por veiculação do antígeno SpaA por linhagens atenuadas de S. typhimurium.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andre_grassmann.pdf: 1497268 bytes, checksum: 73f55a329ef2c9be70227b63b45785a2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 Leptospirosis is an infectious disease that affects humans, wild and domestic animals worldwide. Pathogenic spirochetes from the Leptospira genus are the causative agents of this zoonosis. The several Leptospira species have noted antigenic diversity, even within the same species. This is the main reason current bacterin vaccines have limitations, such as adverse effects and short term immunity, restricting their use in human populations. The need for effective leptospirosis vaccines promoted studies on characterization of new vaccine candidates. The 32 kDa outer membrane lipoprotein, LipL32, is the most abundant protein in the whole leptospira proteome, it is conserved in all pathogenic serovars and absent in saprophytes. This protein is immunogenic and able to bind to mammalian extracellular matrix. However, LipL32 subunit vaccines did not protect animals against challenge. In an attempt to solve this, we use LipL32 fused and coadministered with B subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB) to enhance the immune response. LTB is a non-toxic molecule with immunoestimulatory and immunomodulatory properties. The recombinant proteins rLTB, rLipL32 and rLTB::LipL32 were expressed in E. coli, purified and characterized. Female hamsters were distributed in groups as follows: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, homologous bacterin; PBS. The serum from each animal was collected for humoral immune response determination by ELISA. The animals were challenged with 5×LD50 dose of Leptospira interrogans strain Fiocruz L1-130. Both treatments induced high titers of anti-rLipL32 antibodies. The rLTB+rLipL32 and rLTB::LipL32 treatments afforded significant protective response upon challenge, when compared to control groups (p

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_daiane_drawanz_hartwig.pdf: 4007239 bytes, checksum: 7d50e5824c8c66e23049bd005ad56ea6 (MD5) Previous issue date: 2010-12-20 Leptospirosis is a serious infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, it is classified as a zoonosis of worldwide distribution. This disease results morbidity and mortality in humans and animals, justifying the application of prophylactic strategies. Current vaccines against leptospirosis are composed of inactivated bacteria and do not stimulate cross-protection. Thus, there is need to develop a safe and effective vaccine. In this study, we used the outer membrane proteins LigANI e LipL32, because they have been identified as vaccinogens. These, in their recombinant form, are usually expressed in Escherichia coli and as subunit vaccines have shown variable efficacy. We describe in this work the use of Pichia pastoris as an alternative expression system. The genes ligANI and lipL32 were cloned into vector pPICZαB, which allowed the secretory expression of proteins in P. pastoris. The protein yield in this system was 276 mg/L for LigANI and 285 mg/L for LipL32. The recombinant proteins were glycosylated and remained antigenic. The immunoprotective potential was evaluated in the hamster model, challenged with virulent L. interrogans serovar Copenhageni. Both proteins induced high levels of antibodies (P < 0.001). The animals immunized with LigANI and LipL32 using aluminium hydroxide as adjuvant, showed no protection against challenge, but showed a significant increase in survival (P < 0.001). In conclusion, the yeast P. pastoris has proved an efficient heterologous expression system of LigANI and LipL32 L. interrogans proteins. The secreted and glycosylated LigANI protein may be used in the control of leptospirosis, although additional studies are needed. Leptospirose é uma doença infecciosa grave causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, sendo classificada como uma zoonose de ampla distribuição mundial. Esta doença resulta morbidade e mortalidade em humanos e animais, justificando a aplicação de estratégias profiláticas. As vacinas atuais contra a leptospirose são compostas por bactérias inativadas e não estimulam proteção cruzada. Assim, existe a necessidade de desenvolver uma vacina efetiva. No presente estudo, as proteínas de membrana externa LigANI e LipL32 foram utilizadas, pois são apontadas como potenciais vacinógenos. Estas, em sua forma recombinante, costumam ser expressas em Escherichia coli e, como vacina de subunidade tem apresentado eficiência variável. Nós descrevemos neste trabalho a utilização da levedura Pichia pastoris como sistema de expressão alternativo. Os genes ligANI e lipL32 foram clonados no vetor pPICZαB, que permitiu a expressão secretória das proteínas em P. pastoris. O rendimento das proteínas neste sistema foi de 276 mg/L para LigANI e 285 mg/L para LipL32. As proteínas recombinantes foram glicosiladas e mantiveram-se antigênicas. O potencial imunoprotetor das proteínas foi avaliado em modelo hamster desafiado com cepa virulenta de L. interrogans sorovar Copenhageni. Ambas as proteínas induziram altas taxas de anticorpos (P < 0,001). Os animais imunizados com LigANI e LipL32, utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante, não apresentaram proteção contra o desafio, mas demonstraram um aumento significativo na sobrevida (P < 0,001). Em conclusão, a levedura P. pastoris demonstrou ser um eficiente sistema de expressão heterólogo das proteínas LigANI e LipL32 de L. interrogans. A proteína LigANI secretada e glicosilada pode ser utilizada no controle da leptospirose, embora estudos adicionais sejam necessários.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_samuel_felix.pdf: 602038 bytes, checksum: eceae88e84666382061d981461317748 (MD5) Previous issue date: 2009-11-27 Leptospirosis is a disease caused by pathogenic spirochetes of the Leptospira genus. It is the most widespread zoonosis in the world, representing a veterinarian and public health problem especially in developing countries. From a veterinarian point of view, leptospirosis is important both as a medical problem, mainly in dogs, which can suffer the ailment as well as transmit it, and as an economic problem, mainly in cattle and pigs, where it causes direct production and reproductive losses. Vaccination of these animals is largely applied, however protection is limited. Conventional vaccines confer protection restricted to the sorovars present in the preparation and fail to protect against renal infection, allowing seemingly healthy animals to shed bacteria, and produce short term protection requiring frequent revaccination. The vaccines are also available for humans, but are used only in a few countries such as Cuba and China. The goal of this work was to test the immune protective potential of recombinant Leptospira interrogans proteins produced in Escherichia coli, using the hamster model. Twenty recombinant vaccine candidates were produced and inoculated in hamsters in two doses, fourteen days apart. Two weeks after the second dose all animals were challenged with 100 leptospires (~2xLD50). After the challenge, animals were observed daily for disease. Of all the proteins tested, seven protected animals to some extent, ranging from 16.7% to 50%. Two proteins presented promising results, and were recommended for further studies, as potential leptospira subunit vaccine candidates. A leptospirose é uma doença causada por espiroquetas do gênero Leptospira. Ela é a zoonose mais difundida no mundo, sendo um problema de saúde pública e veterinária, principalmente em países em desenvolvimento. Na área de veterinária, a leptospirose é preocupante do ponto de vista clínico e econômico, devido ao risco à saúde pública, perdas reprodutivas e óbitos. A vacinação animal é amplamente realizada como medida de prevenção da enfermidade. Entretanto, a proteção conferida pelas vacinas convencionais é limitada aos sorovares nelas presentes, não evitando o estado portador, mantendo assim o potencial transmissor desses animais, para humanos e outros animais. Por outro lado, vacinas para humanos estão disponíveis e empregadas em alguns países como a China e Cuba. O objetivo deste trabalho foi avaliar, em modelo animal, proteínas recombinantes de Leptospira interrogans quanto ao seu potencial imunoprotetor. Para tanto, vinte proteínas foram expressas em Escherichia coli e, após a adsorção em hidróxido de alumínio, foram administradas em hamsters através da via intramuscular, em duas doses, com intervalo de 14 dias. Duas semanas após a segunda dose realizou-se o desafio dos animais com 100 leptospiras (~2xDL50). Após o desafio, os animais foram observados diariamente para o aparecimento de sinais clínicos da enfermidade e óbitos, e após 24 dias procedeu-se a eutanásia e necropsia dos animais sobreviventes. Como resultado da avaliação realizada, sete proteínas conferiram proteção ao modelo animal que variou de 16,7% a 50%. Das proteínas que apresentaram maiores níveis de proteção, duas foram indicadas como possíveis candidatas à vacina recombinante contra leptospirose.

The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is one of the most important parasitic diseases of the equine, causing damage to animal health and economic losses. In T. equi, 2 merozoite surface proteins, equi merozoite antigen EMA-1 and EMA-2, have been identified as the most immunodominant antigens. This suggests that these antigens might be used as immunobiological tools. The EMA-1 of Theileria equi was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris. The transformed yeast was grown at high cell density, expressing up to 389 mg.L-1 of recombinant protein. The protein was concentrated and detected in Dot blot. The recombinant product was antigenically similar to the native protein as determined using monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies obtained from equines naturally infected with T. equi. The immunogenicity of rEMA-1 protein was demonstrated by IFAT using sera from recombinant-protein-immunized mice using aluminum hydroxide as adjuvant. All animals vaccinated with rEMA-1 developed a high specific antibody response. This results suggest that rEMA-1expressed in P. pastoris might be a strong candidate to be used as an antigen for immune diagnostics as well as a vaccine antigen. A piroplasmose equina causada por Theileria equi é uma das mais importantes doenças parasitárias de equídeos, causando danos a saúde animal e perdas econômicas. Em T. equi, 2 proteínas de superfície de merozoítos, equi merozoite antigen EMA-1 e EMA-2, têm sido identificadas como antígenos imunodominantes. Sugerindo que estes antígenos possam ser usados como produtos imunobiológicos. O gene EMA-1 de T. equi foi clonado e expressado na levedura Pichia pastoris. As leveduras transformadas foram cultivadas a altas densidades celulares expressando 389 mg.L-1 de proteína recombinante. A proteína foi concentrada e detectada em Dot blot. O produto recombinante foi antigenicamente similar à proteína nativa quando determinado usando anticorpo monoclonal e anticorpos policlonais obtidos de equinos naturalmente infectados com T. equi. A imunogenicidade da proteína rEMA-1 foi demonstrada por RIFI utilizando soro de camundongos imunizados com proteína recombinante usando hidróxido de alumínio como adjuvante. Todos os animais vacinados com rEMA-1 desenvolveram uma alta resposta específica de anticorpos. Esses resultados sugerem que rEMA-1 expressa em P. pastoris possa ser um candidato para ser usado como antígeno para diagnóstico imunológico bem como antígeno para vacinas.