Search

Uvod: Obzirom na to da maligne bolesti postaju sve prisutnije, a kao takve predstavljaju golem javnozdravstveni problem i društveni teret sve je učestalija potraga za antitumorskim lijekovima. Obzirom da cis-platina kao jedan od najčešće korišten kemoterapeutika pokazuje brojne nuspojave, a poznavajući ranija antitumorska svojstva bakra, istraživanja su pomaknuta u svrhu istraživanja antiproliferacijskog učinka bakra i bakrovih (II) kompleksa. Ciljevi: Ispitati antiproliferacijski učinak novih bakar (II) spojeva kompleksiranih sa kromon 2-karboksilnom kiselinom na rast četiriju staničnih linija (MRC-5, HT-29, Hep - G2 te KATO III). Materijali i metode: Spojevi koji su ispitivani tijekom ovog istraživanja su: kromon-2- karboksilna kiselina (C10H6O4) ; bakrovi (II) kompleksi s acetatom, sulfatom i nitratom sintetizirani na Odjelu za kemiju, Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku. Spojevi su prethodno pripremljeni otapanjem u DMSO, a konačan niz koncentracija je bio 10-5 M, 10-6 M i 10-7 M. Nakon tretiranja staničnih linija spojevima i inkubacije od 72h u inkubatoru, MTT testom je određen broj živih stanica. Rezultati: Bakrovi (II) spojevi kompleksirani s kromon-2-karboksilnom kiselinom pokazali su inhibitorni učinak na rast ispitivanih staničnih linija. Kompleks Cu (II) sa sulfatom odnosno Kompleks II je pokazao najveći citotoksični učinak, dok se kao najosjetljivija stanična linija istaknula stanična linija karcinoma jetre (Hep-G2). Uočena je povezanost između antiproliferativnog učinka i primijenjene koncentracije određenog ispitivanog spoja. Zaključak: Bakrovi (II) spojevi kompleksirani s kromon-2-karboksilnom kiselinom pokazuju antiproliferativni učinak na stanične linije. Antiproliferativni učinak ovisi o koncentraciji te vrsti stanične linije

Urokinazni plazminogenski aktivator (uPA) ili urokinaza zaslužan je za aktivaciju plazminogena i njegovu pretvorbu u plazmin, proteolitički enzim koji razgrađuje ekstracelularni matriks. Urokinaza je dio sustava koji obuhvaća i receptor uPA (uPAR) koji je veže na staničnu membranu te njene inhibitore, PAI-1 i PAI-2. Cilj ovog rada bio je klonirati sekvence koje kodiraju za urokinazu, njen receptor i inhibitor PAI-1 te ih eksprimirati u različitim staničnim linijama. Analiza ekstracelularne enzimske aktivnosti i ekspresije pojedinih elemenata sustava u različitim tipovima stanica ukazala bi na mehanizme regulacije urokinazne aktivnosti. Konstruirani su plazmidi sa sekvencama gena za uPA, PAI-1 i uPAR te transficirane stanične linije A1235, HeLa i HEK293. Stanice HEK293 i A1235 transficirane plazmidom sa sekvencom za uPA imale su bazalnu aktivnost urokinaze. Sojevi stanica A1235 i HEK293 transficirani plazmidom sa sekvencom za PAI-1, pokazali su smanjenu aktivnost urokinaze. Stanice HeLa nisu pokazale urokinaznu aktivnost. Unos plazmida sa sekvencom uPAR nije utjecao na urokinaznu aktivnost stanica. Analiza ekspresije proteina pokazala je da plazmidi sa sekvencom urokinaze nisu promijenili razinu ekspresije ovog proteina u staničnim lizatima. Kod stanica A1235 i HEK293 detektirano je povećanje ekspresije uPAR i PAI-1 nakon transfekcije plazmidima s njihovim sekvencama. Uzgojene stanične linije s različitom urokinaznom aktivnosti mogu poslužiti kao model za istraživanje utjecaja urokinaznog sustava na staničnu proliferaciju, migraciju i preživljenje. Urokinase plasminogen activator (uPA) or urokinase is responsible for the activation of plasminogen and its conversion into plasmin, a proteolytic enzyme that degrades the extracellular matrix. Urokinase is a part of a system that includes the uPA receptor (uPAR) that binds urokinase to the cell membrane and its inhibitors, PAI-1 and PAI-2. The aim of this study was to clone sequences encoding urokinase, its receptor and PAI-1, and to express them in different cell lines. Analysis of extracellular enzyme activity and expression of individual urokinase system elements in different cell types, could indicate the regulatory mechanisms of urokinase activity. Plasmids with gene sequences for uPA, PAI-1 and uPAR were constructed and A1235, HeLa and HEK293 cell lines were transfected with plasmids. HEK293 and A1235 cells transfected with the uPA sequence plasmid had basal urokinase activity. A1235 and HEK293 cell strains transfected with plasmid containing PAI-1 sequence showed reduced urokinase activity. HeLa cells did not have urokinase activity. Expression of plasmids with the uPAR sequence did not affect urokinase activity in the transfected cell lines. Analysis of protein expression showed that plasmids with the urokinase sequence did not change the expression levels of this protein in the cell lysates. In A1235 and HEK293 cells, an increase in uPAR and PAI-1 expression was detected after transfection with plasmids with corresponding sequences. Cell strains with different urokinase activity can serve as a model for investigating the impact of the urokinase system on cell proliferation, migration and survival.

Uvod: Maligna oboljenja su drugi vodeći uzrok smrti na globalnoj razini. S obzirom na veliki broj smrti uzrokovanih malignim promjenama, potražnja za antitumorskim lijekovima je vrlo velika. Jedan od često primijenjenih kemoterapeutika je cis-platina, međutim primjena cis-platine pokazala je mnoge nuspojave. Stoga se pažnja usmjerava na paladij koji stvara komplekse kao i platina te se stoga može zamijeniti istom. Ciljevi: Ispitati citotoksični učinak paladijevih (II) kompleksa na rast četiriju staničnih linija (PANC1, BJ, MDCK.1, NCI-H358) u uvjetima in vitro. Materijali i metode: Paladijevi (II) kompleksi sintetizirani su na Prehrambeno tehnološkom fakultetu u Osijeku, Katedra za kemiju i ekologiju, pri Zavodu za primjenjenu kemiju i ekologiju. Spojevi su pripremljeni otapanjem u 100% DMSO u koncentraciji 10-2 mol/dm3 (M), a konačan niz koncentracija je bio 10-4 M, 10-5 M i 10-6 M. Kultivacija stanica odvijala se u CO2 inkubatoru pri 37°C. Stanična vijabilnost određena je MTT testom nakon inkubacije od 72 sata. Rezultati: Uočen je antiproliferativni učinak testiranih spojeva na stanične linije gdje je veća citotoksičnost primijećena pri većim koncentracijama ispitivanih kemijskih spojeva. Najučinkovitije antiproliferativno djelovanje pokazali su Pd 1 i Pd 4, na svim tumorskim stanicama, najbolje pri koncentraciji 10-4 M. Normalne stanice humanog podrijetla, BJ, pokazale su dobru otpornost na ispitivane spojeve uz postotak preživljenja od 50-65% pri najvišoj koncentraciji. Najveću osjetljivost pokazala je mišja, MDCK1 stanična linija. Zaključak: Paladijevi (II) kompleksi smanjuju rast tumorskih stanica. Inhibicija rasta ovisi o koncentraciji spoja i vrsti stanične linije.

Kinolin je aromatski spoj dušika sastavljen od benzenskog i piridinskog prstena. Brojne hibridne molekule s kinolinskom strukturom pokazuju antitumorsku aktivnost uzrokujući zaustavljanje staničnog ciklusa i aktivaciju apoptoze. Biološki učinak novosintetiziranih kinolinskih hibrida ispitan je na tumorskim staničnim linijama adenokarcinoma debelog crijeva (CaCo-2), adenokarcinoma dojke (MDAMB231), T limfoma (HuT78), akutne limfoblastične leukemije (CCRF- CEM) i kronične mijeloidne leukemije (K562), kao i na normalnoj staničnoj liniji bubrega psa Madin- Darby (MDCK I). Citotoksičnost je testirana pomoću MTT testa nakon 72 h inkubacije s novim kinolinskim hibridima u koncentracijama od 1x10-4 – 1x10-6 M. Dobiveni rezultati pokazali su nižu osjetljivost normalnih stanica na ispitivane spojeve u usporedbi sa stanicama adenokarcinoma i leukemije. Promjene u distribuciji staničnog ciklusa, povećan broj stanica u apoptotozi i autofagiji također su uočeni nakon 24 - satnog tretmana. Daljnja istraživanja novosintetiziranih kinolinskih hibrida potrebna su za bolje razumijevanje antitumorskog mehanizma djelovanja.

Cilj istraživanja je inducirati autofagiju u kultiviranim uzorcima te pokazati koji od dva glavna satojka medija ima veći ujtecaj na pojavnost autofagije. Materijali i metode: Za potrebe istraživanja korištena je HeLa stanična kultura. Stanične linije nasađene su u tri različita medija, kontrolni, medij s manjim udjelom seruma te medij s manjom koncentracijom glukoze. Stanice su inkubirane na 37 °C uz 5 % CO2 u periodima od 24, 48 i 72 sata. Količina autofagije u uzorcima mjerena je protočnom citometrijom. Rezultati: Praćenjem autofagije u 3 različita medija te 3 različita vremenska perioda, iz grafičkih i histogramskih prikaza se uočava da se najveća pojavnost autofagije očituje u mediju s manjim udjelom seruma, a zatim u mediju s manjom koncentracijom glukoze

Karakteristika svih somatskih stanica je njihov ograničeni životni vijek te regulirana proliferacija, diferencijacija i preživljavanje što je potrebno da bi organizam mogao funkcionirati. Kao posljedica djelovanja unutrašnjih i vanjskih faktora na organizam i zbog nepravilne regulacije kontrolnih mehanizama, stanice dobivaju nove biološke osobine odnosno maligni fenotip. Tumorske stanice imaju svojstvo klonalnosti što znači da tumor nastaje nekontroliranom proliferacijom jedne stanice. Proces karcinogeneze nastaje kao posljedica djelovanja karcinogena koji oštećuju DNA i induciraju mutacije te promotora koji stimuliraju proliferaciju stanica. U kontroli staničnih procesa, ali i u nastanku raka sudjeluju proteini kodirani genima. Onkogeni su geni koji potiču diobu stanica, dok tumor supresor geni inhibiraju proliferaciju i kontroliraju stanični ciklus. Cilj ovog rada je opisati svojstva tumorskih stanica, njihovo nastajanje i rast, objasniti gene uključene u nastanak raka, pristupe u liječenju tumora te važnost pravilne i raznolike prehrane, odnosno važnost hrane za očuvanje zdravlja i prevenciju nastanka tumora., The characteristics of all somatic cells is their limited life duration and regulated proliferation, differentiation and survival necessary for the organism to function properly. As a result of internal and external factors on the organism, along with inappropriate regulation of control mechanism, the cells receive new biological characteristics, also known as malignant. Tumor cells can duplicate meaning that the tumor acquires an ability for uncontrollable proliferation of cells. The process of carcinogenesis begins as a result of carcinogens that damage DNA and induce mutations and promoters that stimulate the proliferation of cells. In the control of cellular processes, the proteins encoded by genes participate in cancer formation. Oncogenes are genes which stimulate cell division, while tumor suppressor genes inhibit proliferation and control the cell’s life cycle. The objective of this thesis is to explain the properties of tumor cells, their formation, growth, and also to explain genes that are involved in the formation of cancer, approaches to treatment of tumors and the importance of a proper diet, as well as the importance of food as a preventative mean to the formation of tumors.

U uvodnim poglavljima izložena je motivacija problema. Kratko su opisani biološki koncepti čije je poznavanje važno u kasnijim fazama. Glavna tema rada je razvoj generičkog klasifikatora. Naglasak se stavlja na mogućnost određivanja tipova i podtipova tumorskih stanica. U inkrementalnom postupku razvoja koristi se algoritam stroja potpornih vektora (SVM). Prikazan je način optimizacije parametara SVM-a uz pomoć genetskog algoritma. Opisana je implementirana paralelizacija posla pri učenju. Izgrađeni klasifikator ispitan je na različitim vrstama skupova podataka. Ukratko su opisane strategije višerazredne klasifikacije. Predstavljen je način procjene vjerojatnosti pripadnosti uzoraka pojedinim razredima klasifikacije u vidu Plattovog skaliranja. Izloženi su rezultati i uspješnost konačnog modela. Motivation for this assignment’s problem is presented in introductory chapters. Biological concepts, key to understanding later work, are briefly described. Main topic in this assignment is development of generic classifier. Emphasis is put on possibility of determining types and subtypes of tumor cells. Algorithm Support Vector Machine is used in incremental building procedure. Optimization of SVM’s parameters with genetic algorithm is described thoroughly. Implementation of parallel computing for work needed for training is also presented. Built classifier is tested on various types of datasets. Strategies of multiclass classification are shortly described. A way of creating a probability of class association approximation is shown by method of Platt scaling. Results and achievements of final model are stated in the end.

Uvod: Benzimidazol je heterociklički aromatski organski spoj koji nastaje spajanjem benzena i imidazola. Zbog svoje strukture nalikuje biomolekulama koje normalno sudjeluju u staničnim procesima te pokazuje sposobnost vezanja za dvolančanu DNK. Dodavanjem različitih bioaktivnih skupina na osnovu molekule povećavaju se farmakološka svojstva takvih molekula. Zbog toga su uzeti kao osnova za razvoj novih molekula sa protutumorskim djelovanjem. Cilj: Cilj istraživanja jest ispitati utjecaj derivata benzimidazola na rast stanica u uvjetima in vitro te utvrditi da li postoji razlika u djelovanju spojeva na stanice koje rastu u jednom sloju i sferoidima. Materijali i metode: Za potrebe istraživanja pripremljena je dvodimenzionalna i trodimenzionalna HeLa stanična kultura. Stanične linije inkubirane su na 37 °C uz 5 % CO2. Nakon tretiranja stanica derivatima benzimidazola (MB-123, MB-127, MB-129) i inkubacije od 72 sata, učinak ispitivanih spojeva na rast stanica određen je MTT testom. Rezultati: Testirani derivati benzimidazola pokazuju citotoksičan učinak ovisno o primjenjenoj koncentraciji i staničnoj kulturi. Najbolji inhibicijski učinak na rast stanica imao je MB-127 u koncentraciji od 10-4 mol/L. Zaključak: Razlikuje se odgovor stanica uzgojenih u 2D i 3D kulturi na utjecaj derivata benzimidazola ovisno o tipu spoja i primjenjenoj koncentraciji.

Cirkulirajuće tumorske stanice (CTC) najvjerojatnije imaju ključnu ulogu u posredovanju nastanka metastaza. CTC-i putuju kroz krvotok i limfni sustav. Hipoteze današnjih istraživanja jesu da CTC-i idu na udaljena mjesta u različite organe i tkiva. Moraju preživjeti u stranom mikrookolišu a zatim se razmnožavaju, čime se stvaraju mikroskopske, potom makroskopske, a potom i kliničke značajne neoplastične izrasline., Circulating tumor cells (CTC) most likely play a key role in mediating the formation metastasis. CTCs travel through the blood stream and lymphatic system. Today Hypotheses of many researches are that CTCs will go to distant places in different organs and tissues. They have to survive in a foreign microenvironment and then proliferate, thus creating a microscopic than macroscopic, and then clinically significant neoplastic growths.

Sustav urokinaznoga plazminogenskoga aktivatora (uPA) regulira razgradnju izvanstaničnog matriksa aktivacijom sveprisutne proteaze plazmina. Sudjeluje u nizu fizioloških i patoloških procesa te stanično je specifično reguliran u organizmu na razini ekspresije proenzima, inhibitora i receptora. U ovom je radu opisana regulacija sustava uPA kod stanica glioblastoma A1235, manjkavih u popravku alkilirajućeg oštećenja, nakon obrade inhibitorom poli(ADP-ribozil) polimeraze-1 (PARP-1) i alkilirajućim agensom N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidinom (MNNG). MNNG je povećao uPA aktivnost u uskom rasponu koncentracija, u uvjetima visoke vijabilnosti, ali i zaustavljenog staničnog ciklusa. U tim je uvjetima inhibicija PARP-1 modulirala indukciju uPA aktivnosti inhibicijom popravka oštećenja DNA. Aktivacija uPA bila je posljedica promjene u odnosu ekspresije uPA i njegovog inhibitora PAI-1 u čemu je sudjelovao niz signalnih puteva. U drugom dijelu istraživanja našli smo da je derivat aspirina, natrijev salicilat (NaS) kod stanica tumora dojke MDA MB-231 promijenio ekspresiju uPA i PAI-1 i na taj način smanjio uPA aktivnost u ovisnosti o koncentraciji i vremenu tretmana. NaS je također smanjio ekspresiju integrinskih podjedinica αV i β5, zaustavio stanični rast i inducirao morfološke promjene. Ovi rezultati svjedoče o složenoj regulaciji sustava uPA koja je stanično specifična i uključuje niz signalnih puteva. Urokinase plasminogen activator (uPA) system regulates extracellular matrix remodeling by activating ubiquitous protease plasmin. The system is involved in various physiological and pathological processes and its regulation is cell specific involving the regulation of proenzyme, its inhibitors and receptor. This thesis describes the regulation of uPA system in A1235 glioblastoma cells, deficient in alkylation damage repair, after the treatment with poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitor and alkylating agent N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG). MNNG has induced an increase in uPA activity in the narrow range of concentrations, under the conditions of high viability and the cell cycle arrest. In these experimental conditions, inhibition of PARP-1 has modulated induced uPA activity influencing the process of DNA repair. Increase in uPA activity was a consequence of change in the balance between uPA and its inhibitor PAI-1 expression and involved various signaling pathways. In the second part of this research, we found that sodium salicylate (NaS), a derivative of aspirin, has changed the expression of uPA and PAI-1 in MDA MB-231 breast cancer cells and inhibited uPA activity in a dose- and time-dependent manner. NaS has also inhibited the expression of αV i β5 integrin subunits, arrested cell growth and induced morphological changes. These results altogether confirmed the complex nature of uPA system regulation which is cell specific and involves various signaling pathways.

Usprkos brojnim dosad razvijenim terapijama, rak je jedan od najčešćih uzročnika smrti današnjice te njegovo liječenje predstavlja pravi izazov. U posljednje se vrijeme intenzivno radi na razvijanju onkolitičke viroterapije, koja se ističe svojom efikasnosti i sigurnosti uslijed ograničenosti djelovanja na tumorske stanice. Ovaj oblik terapije podrazumijeva korištenje onkolitičkih virusa koji selektivno inficiraju i liziraju tumorske stanice. Trenutno se klinički ispituje devet virusnih porodica: Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Poxviridae, Retroviridae i Rhabdoviridae. Za usavršavanje onkolitičke terapije potrebno je zadovoljiti nekoliko uvjeta koji se odnose na zaobilaženje imunosnog sustava, pojačavanje selektivnosti virusa za tumorske stanice te na „naoružavanje“ virusa. Sprječavanje neutralizacije virusa djelovanjem imunosnog sustava najčešće se provodi metodama izmjene serotipa, kemijskim modifikacijama virusnih epitopa ili korištenjem stanica transportera. Sve se više proučava mogućnost transporta onkolitičkih virusa matičnim stanicama budući da neke od njih pokazuju svojstvo spontane migracije prema određenim vrstama tumora. Selektivnost za tumorske stanice može se dodatno poboljšati unošenjem gena čiji će produkti specifično vezati virusni antigen. Infekcije netransformiranih stanica mogu se spriječiti metodama negativnog i pozitivnog „ciljanja“. „Naoružavanje“ onkolitičkih virusa provodi se njihovim modificiranjem, kojim se dodatno potiče liza tumorskih stanica, a može se i stimulirati imunosni sustav pacijenta. Uništavanje tumorskih stanica pojačava se, na primjer, opremanjem virusa transgenima za enzime koji pretvaraju netoksične prekursore u toksične produkte unutar tumorskog mikrookoliša ili koncentriranjem radioaktivnog joda u tumorskim stanicama pomoću transgena za stanični simporter natrija i joda. „Naoružavanje“ se može provesti i s obzirom na tumorsku epigenetiku budući da prilikom transformacije stanica dolazi do promjene epigenetičkog koda. Jedna od obećavajućih strategija borbe protiv tumora je i imunoterapija, koja podrazumijeva poticanje imunosnog sustava pacijenta, ublažavanje supresije imunosnog sustava od strane tumorskih stanica te pojačavanje imunogeničnosti tumora radi postizanja što jačeg imunosnog odgovora. In spite of the many therapies developed so far, cancer is still regarded as one of the most common death causes and it therefore presents a real challenge. Much effort has lately been devoted to development of oncolytic virotherapy because of its effectiveness and safety, due to its ability to specifically target tumor cells. This therapy uses oncolytic viruses to selectively infect and to lyse tumor cells. Currently, nine different families of viruses are used in clinical trials: Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Poxviridae, Retroviridae i Rhabdoviridae. There are several conditions that have to be satisfied for further improvement of oncolytic virotherapy, and they relate to bypassing the immune system, modifying viruses in order to enhance their specificity for tumor cells and “virus arming”. Neutralization of viruses by the immune system is most commonly overcome through serotype exchange, chemical modification of virus epitopes, or by using cell carriers. Much research focuses on employing stem cells to carry oncolytic viruses because some stem cell types spontaneously migrate towards certain types of tumors. Tumor cell specificity can be further enhanced by introducing genes whose products specifically bind viral antigens. Infection of untransformed cells can be prevented by positive or negative targeting. “Arming” of oncolytic viruses is achieved by modifying them so as to further enhance the lysis of tumor cells and stimulate the patient’s immune system. Destruction of tumor cells can be promoted in various ways, for example by arming viruses with transgenes for enzymes that convert non-toxic precursors into toxic metabolites in the tumor microenvironment, or by employing transgenes for sodium-iodide symporter which concentrate radioactive iodide ions in tumor cells. “Arming” of viruses can also be carried out with regard to tumor epigenetics since transformation of cells alters the epigenetic code. One of the promising strategies in fighting cancer is immunotherapy, which involves boosting the patient’s immune system, decreasing the tumor-induced immunosuppression as well as increasing the immunogenicity of the tumor in order to strengthen the immune response.

U ovom radu je istražen potencijalni protutumorski učinak pčelinjega otrova i njegove glavne sastavnice melitina prema različitim tipovima tumorskih stanica i njihovim sublinijama otpornima na citostatike kao i njihov učinak prema normalnim ne-tumorskim stanicama. Nakon obrade pčelinjim otrovom i melitinom sve stanine linije pokazale su citotoksini učinak koji je bio ovisan o dozi. Nadalje, obrada pčelinjim otrovom i melitinom uzrokovala je značajne morfološke promjene i staninu smrt uzrokovanu dominantno nekrozom. Nakon zajedničke obrade sa kemoterapeutikom cisplatinom, pčelinji otrov je pokazao aditivan učinak koji bi mogao biti koristan u vidu smanjivanja doze cisplatine za vrijeme kemoterapije. Također, pčelinji otrov i melitin uzrokovali su citotoksičnost i kod normalnih stanica uzrokujući smanjenje stanične vijabilnosti, morfološke promjene i oštećenja molekule DNA. Smanjenje glutationa i porast koncentracije malondialdehida, uz oksidativna oštećenja molekule DNA i porast aktivnosti fosfolipaze C, ukazuju da pčelinji otrov i melitin djeluju putem lipidne peroksidacije te da je oksidativni stres barem djelomično uključen u mehanizam djelovanja ovih spojeva. Iako toksičan kod svih ispitanih staninčih tipova, toksičnost pčelinjega otrova i melitina ovisna je o tipu stanica čineći tumorske stanice osjetljivijima na oba spoja naspram ne-tumorskih stanica. Ovisno o podrijetlu, stanice otporne na citostatike mogle bi biti osjetljivije na pčelinji otrov i melitin od svojih roditeljskih linija. Iako su se pokazali toksičnim kod svih ispitanih stanica, ovi rezultati idu u prilog upotrebe pčelinjega otrova i melitina u terapiji protiv tumora. Possible anticancer ability of bee venom and its major component melittin towards different types of tumour cells and their drug resistant sublines as well as their impact on normal non-tumour cells was investigated. After the treatment with whole bee venom or melittin all the cell lines tested displayed dose dependent cytotoxicity. In addition, treatment with bee venom and melittin caused significant morphological changes and induced dominantly necrotic type of cell death. Following a combined treatment with chemotherapeutic drug cisplatin, bee venom exhibited additive effect what could be useful from the point of minimizing cisplatin concentration during chemotherapy. Bee venom and melittin were toxic to normal cells as well; causing lover cell viability, morphological cell alterations and DNA damage. Depletion of glutathione and increment in malondialdehid concentration parallel with oxidative DNA damage and induction of phospholipase C activity, suggest that both bee venom and melittin act through lipid peroxidation and that oxidative stress is at least partly involved in their mode of action. Although toxic to all cell types tested, toxicity of bee venom and melittin was cell type dependent making tumour cells more sensitive to both, as compared to the non-tumour cells. Depending on the origin, drug resistant cells could be more sensitive to bee venom and melittin than parental cells. Although toxic to all the cell lines tested, our results speak in favour of application of bee venom and melittin in anticancer therapy.

Istražen je citolitički učinak soja ZG1999HSD virusa newcastleske bolesti (VNB) izdvojenog u Hrvatskoj 1999. godine iz pluća, ali ne istodobno i mozga tovnih pilića. Tijekom 28 dana od ukupno 16.150 useljenih pilića pomor je iznosio 77.29%, s klinički očitovanim znakovima zarazne kržljavosti te ugušenja neposredno prije uginuća. za virus dokazano je da se razlikuje od danas poznatih te da je lentogenih svojstava i imunogeničan. njegovo citolitičko svojstvo istraženo je in vitro na kulturama tumorskih stanica i in vivo na miševima te uspoređeno s djelovanjem La Sota soja virusa newcastleske bolesti. Stanične linijske kulture mišjeg fibrosarkoma (FsaR), mišjeg karcinoma pločastih stanica (SCCVII), mišjeg adenokarcinoma debelog crijeva (CT26WT) i mišjeg adenokarcinoma dojke (4T1) inficirane su bili s 20 ili 200 EID50 istraživanih virusa po stanici te je učinak uspoređen s rastom normalnih stanica L929, mišjih fibroblasta. Soj ZG1999HSD u odnosu na soj La Sota VNB statistički je značajno jače inhibirao rast tumorskih stanica i tumora. Predlaže se istraživanje njegove moguće primjene kao onkolitičkog cjepiva.

Procjena individualne osjetljivosti na mutagene često je dio istraživanja u epidemiološkim studijama koje prate pojavnost zloćudnih bolesti u populacijama. Posljedica djelovanja mutagena u genomu izloženih osoba jest nastanak određene, manje ili veće, količine oštećenja, uvjetovane individualnim razlikama u osjetljivosti. Viša razina takve genomske nestabilnosti znači opasnost (rizik) od razvoja zloćudnih bolesti. Interindividualne razlike u odgovoru na mutagene obično se povezuju i s promijenjenom (većinom smanjenom) sposobnosti (kapacitetom) za popravak DNA. Citogenetičke studije su pokazale da je genom tumorskih stanica nestabilniji od normalnih, a time i skloniji akumuliranju oštećenja, bilo da je nestabilnost uzrokovana nasljeđem, izloženošću ili kombinacijom tih dvaju učinaka. U oboljelih ispitanika utvrđena je povećana učestalost kromatidnih i kromosomskih aberacija naspram normalne populacije te sklonost razvoju određenih vrsta neoplazija. U praćenju povezanosti promijenjenog odgovora i pojavnosti tumora služe nam različiti biomarkeri. Kao indirektni pokazatelji uspješnosti popravka DNA često se rabe testovi osjetljivosti na mutagene u kulturama limfocita periferne krvi. Jedan od takvih testova je i bleomicinski test. Radiomimetik i citostatik, a po strukturi glikopeptid, bleomicin se u stanici prevodi u aktivni oblik sposoban cijepati molekulu DNA što uzrokuje brojne jednolančane i dvolančane lomove. Kao jednostavna i jeftina metoda, zasniva se na utvrđivanju ukupnog broja jednolančanih lomova u kromosomima limfocita uzgajanih u staničnoj kulturi koji su u uvjetima in vitro tijekom kasne G2-faze staničnog ciklusa bili izloženi bleomicinu. Ovaj revijalni rad daje pregled utjecaja raznih faktora na rezultate samog testa i pokazuje njegovu široku primjenu u proučavanju genomske nestabilnosti koju najčešće uzrokuje kombinacija raznih faktora., Estimation of individual susceptibility to mutagens is often a part of epidemiological studies monitoring the appearance of malignant disease in different populations. Genome exposure to mutagens can lead to DNA damage. The rate of damage depends on individual differences in response, which are usually associated with differences in DNA repair capacity. Cytogenetic studies have shown that the genome of tumour cells is less stable than normal cells and therefore accumulates more damage. Tumour patients show a higher frequency of chromatid and chromosomal aberrations and a predisposition to certain types of tumours. One of the common biomarkers used in monitoring tumour appearance and changed response to DNA damage is the bleomycin test. In its active form, bleomycin (glycopeptid) is a radiomimetic cytostatic that can damage the DNA molecule and cause multiple single and double strands. The bleomycin test is simple and inexpensive, and is based on scoring chromatid breaks in lymphocytes in vitro exposed to bleomycin during the late G2 phase of the cell cycle. This review looks into different factors that may affect test results and discusses its wide implementation in studies of genome instability usually caused by a combination of factors.

Autofagija je proces lizosomalne razgradnje unutarstaničnih sastojaka koji je aktivan u fiziološkim uvjetima, ali predstavlja također i odgovor na stres. Ima važnu ulogu u razvoju i progresiji tumora te utječe na kemosenzitivnost tumorskih stanica. Stanično starenje podrazumijeva trajni zastoj u staničnom ciklusu i uobičajeno se javlja zbog skraćenja telomera nakon brojnih dioba, međutim moguće ga je izazvati određenim kemoterapeuticima i genskom terapijom i tako inhibirati diobu tumorskih stanica. Obzirom da tumorske stanice često razvijaju rezistentnost na kemoterapiju zbog nemogućnosti indukcije apoptoze, oba su ova procesa potencijalni ciljevi protutumorskih lijekova. Cilj ovog rada bio je ispitati da li se autofagija i stanično starenje aktiviraju u odgovoru stanica na tretman cisplatinom i p21 te u kojoj su mjeri povezana ta dva procesa. Stanice SW480 i HCT116 izložili smo cisplatini i povišenoj ekspresiji p21 izazvanoj egzogenim unosom adenoviralnim vektorom i pokazali da oba tretmana aktiviraju autofagiju i stanično starenje te inhibiraju diobu tumorskih stanica. Uz pomoć aktivatora i inhibitora autofagije pokazali smo da su ova dva procesa povezana i da se inhibiranjem autofagije inhibira i stanično starenje.

Betanin belongs to a large family of betacyanin pigments, betalains, and in food industry it is established as a powerful antioxidant and natural colorant. The main source of betanin is a red beet (Beta vulgaris L.), whose yield depends on abiotic and biotic factors in the field. Sugar beet cells, transformed by a wild strain B6S3 of Agrobacterium tumefaciens, overproduce betanin and could be its alternative and stable production source. With the aim to enhance its production, cell suspensions were initiated. Biomass accumulation, betanin production and yield were monitored during 21 days in relation to changes of sucrose content, modifications of minerals in nutrient medium, and usage of elicitors. Results showed that elevating sucrose levels from 3 to 4, 5, or 6% (w/v) in original medium strongly induced biomass accumulation, resulting in increase in betanin production and yield up to 250%. Modification of minerals in the medium additionally increased it up to 20%. The highest production at 4.1 mg L-1 day-1 and yield at 41 mg L-1 was recorded at day 7 of subculture in modified medium with 6% of sucrose. Calcium and yeast extract were used as elicitors in early exponential phase of subculture (day 7). Calcium ions (at 10 fold higher concentration than in control) failed to increase betanin yield as well as yeast extract at 0.25% (w/v). Yeast extract at 1.25% provoked excretion of betanin at day 4, and cell necrosis at day 7 after elicitation. Taken together, sucrose was stronger stimulant of betanin production than medium modifications or elicitors. Yeast extract could be used for reverse-sequestration of betanin where the cells can be used over an extended period.

Prognostička vrijednost angiogeneze i sadržaja DNA tumorskih stanica u bolesnica sa seroznim rakom jajnika

Pčelinji otrov (Apis mellifera) koristi se u tradicionalnoj medicini za liječenje različitih bolesti. U novije vrijeme zabilježen je i antitumorski učinak pčelinjeg otrova i njegove glavne aktivne sastavnice, melitina, na tumorskim stanicama. Cilj ovog istraživanja je procjena citotoksičnosti pčelinjeg otrova i melitina na različitim tipovima tumorskih stanica (Hep-2, CK2, CA3, HeLa K, HeLa CK, Hef, Mcf, 293, A1235 i SW 620) koje su tretirane pčelinjim otrovom i melitinom u različitim koncentracijama. Pčelinji otrov je testiran u koncentracijama od 0.4 μ g/ml do 200 μ g/ml dok je melitin dodavan u kulture tumorskih stanica u koncentracijama od 0.1 μ g/ml do 100 μ g/ml. Citotoksičnost pčelinjeg otrova i melitina procjenjena je spektrofotometrijski MTT testom. Dobiveni rezultati ukazuju na citotoksično djelovanje pčelinjeg otrova u svim testiranim tumorskim stanicama u različitim koncentracijama primjenjenima u ovom istraživanju ovisno o njihovoj osjetljivosti. Melitin, kao glavni aktivni sastojak pčelinjeg otrova, sa svojih 50% pokazao je još veću citotoksičnost prema testiranim tumorskim stanicama. Dobiveni razultati ukazuju da pčelinji otrov i njegova glavna aktivna komponenta melitin, mogu uzrokovati oštećenje tumorskih stanica i citotoksičnost u ovisnosti o koncentraciji te bi se na taj način mogli koristiti kao potencijalni kemoterapeutici. U skladu s ovim rezultatima preporučuju se daljnja antitumorska ispitivanja pčelinjeg otrova i njegovih pojedinih komponenata.

Cilj rada bio je odrediti učinak jednokratnog izlaganja stanica ljudskog karcinoma debelog crijeva (Caco-2) i karcinoma grkljana HEp-2 inhalacijskim anesteticima sevofluranu i halotanu. Materijal i metode: Stanice su uzgojene u monosloju na 37 °C u ovlaženoj atmosferi s 5% CO2 te izložene sevofluranu 3 vol % i halotanu 1, 5 vol % u smjesi anestezijskih plinova O2:N2O:CO2 (35:60:5 vol. %) u trajanju 1 i 2 sata. Jedna skupina stanica nakon izlaganja inhalacijskom anestetiku je analizirana isti dan, a druga je nakon izlaganja ostavljena u CO2 inkubatoru i analizirana nakon 24 sata. Stanična smrt ispitana je metodom protočne citometrije. Ispitana je ekspresija gena GAPDH, p53, kaspaza 3 i CYP 2E1 metodom RT-PCR. Fluorometrijskom metodom ispitana je enzimska aktivnost kaspaze 3, dok je aktivnost kisele i neutralne sfingomijelinaze mjerena razgradnjom [metil-14C] sfingomijelina. Nakon inkubacije s [3H]palmitinskom kiselinom, izolirana je iz ukupnih lipda frakcija u kojoj je de novo sinteza ceramida mjerena ugradnjom 3H. Svi dobiveni rezultati uspoređeni su s kontrolnim, netretiranim stanicama. Rezultati: Halotan i sevofluran doveli su do porasta broja apoptotičkih stanica , koji je bio najizraženiji 24 sata nakon izlaganja i iznosio 16, 9 % kod stanica izloženih sevofluranu u trajanju 2 sata. U stanicama Caco-2 porasla je ekspresija kaspaza 3 i CYP 2E1 gena nakon izlaganja sevofluranu, dok je opala ekspresija gena GAPDH. U stanicama HEp-2 je porasla ekspresija GAPDH gena a smanjena je ekspresija p53 i kaspaza 3 gena. Iako je postojao trend porasta katalitičke aktivnosti kaspaze 3, razlike nisu bile stastistički značajne u odnosu na kontrolnu skupinu. Smanjena je enzimska aktivnost neutralne i kisele sfingomijelinaze u stanicama Caco-2 i Hep-2 izloženim halotanu, dok je aktivnost sfingomijelinaze manje promijenjena u stanicama izloženim sevofluranu u odnosu na kontrolne stanica. Smanjenje de novo sinteze ceramida opaženo je u stanicama Caco-2 izloženim halotanu 1 i 2 sata, dok je porasla u stanicama HEp-2 izloženim sevofluranu nakon 24 sata. Zaključak: Inhalacijski anestetici, sevofluran i halotan utječu na sfingomijelinski signalni put već nakon kratkog izlaganja tumorskih stanica dobivenih iz tumora karcinoma debelog crijeva i karcinoma grkljana.

U zadnjih nekoliko desetljeća značajno se promijenio pogled na strukturu i funkciju genoma normalnih stanica. Danas se zna da je dugo uvriježeno mišljenje da je eukaritski genom relativno stabilan i konstantan krivo i da je genom zapravo fleksibilan i plastičan. S druge strane, genomska nestabilnost je fenomen koji uključuje translokacije, aneuploidiju, rekombinacije, delecije, amplifikacije gena itd., te predstavlja glavno obilježje tumorskih stanica, dok se rijetko može uočiti u normalnim stanicama. Telomere, nukleoproteinski kompleksi na krajevima eukariotskih kromososma, spriječavaju kromosomske aberacije te stoga imaju iznimno važnu ulogu u održavanju stabilnosti genoma. Izvankromososmska DNA jedan je od fenomena koju vežemo uz genomsku nestabilnost. Te male molekule DNA imaju kromososmsko podrijetlo i prisutne su u svim dosad istraživanim eukariotskim stanicama. Tumorske stanice pokazuju povečanu količina izvankromosomske DNA.Telomere stanica MDA-MB-231 analizirao sam pomoću tehnike PNA-FISH. Kromosomi su pokazivali nekoliko obilježja genomske nestabilnosti: poliploidiju, heterogeno obilježavanje telomera i prisutstvo odlomljenih dijelova kromososma. Izvankromosomsku DNA izolirao sam iz intaktnih stanica MDA-MB-231 pomoću alkalne elektroforeze u agaroznom gelu i elektroelucije. . Nakon pročišćavanja, izvankromosomsku DNA analizirao sam agaroznom gel-elektroforezom i elekrtronskom mikroskopijom.

U ovoj studiji istraživani su učinci inhalacijskih anestetika halotana 1, 5 vol%, izoflurana 2 vol% i sevoflurana 3 vol% na rast ljudskih tumorskih stanica karcinoma debelog crijeva Caco-2, karcinoma grkljana HEp-2, stanica karcinoma dojke MCF-7, karcinoma gušterače MIA PaCa-2, metastatskog karcinoma debelog crijeva iz limfnog čvora SW620 i normalnih fibroblasta WI 38. Ispitivane stanične kulture su izložene ovlaženoj smjesi inhalacijskih anestetika u 35% O2, 60% N2O, 5% CO2 na temperaturi 37 &ordm ; C u trajanju od 2, 4 i 6 sati. Zatim je citotoksičnost svih inhalacijskih anestetika je određena MTT-testom. Dobivene vrijednosti su iskazane kao postotak u odnosu na metaboličku aktivnost u kontrolnoj, netretiranoj, skupini stanica. Nađeno je da inhalacijski anestetici imaju različiti citotoksični učinak na ispitivane stanične kulture. Inhibicija staničnog rasta je ovisna o vrsti primjenjenog anestetika, tipu stanica i dužini izlaganja anestetiku. Najjači citotoksični učinak je iskazao halotan, s inhibicijom rasta svih ispitivanih tipova stanica, izraženom već nakon 2 sati u kulturi stanica HEp-2 (82, 7%), Caco-2 (85, 1%) i SW620 (72, 1%), a najmanjim u kulturi fibroblasta (86, 2%). Citotoksičnog učinak je nakon 6 sati bio kod HEp-2 (67, 7%), Caco-2 (76, 3%), SW620 (80, 9%) i najmanji kod fibroblasta (87, 6%). Ovi učinci halotana su bili praćeni promjenama u sintezi DNA (52, 4% kod Caco-2, 45, 2% kod HEp-2 i 74, 9% kod SW620), RNA (39, 2% kod Caco-2, 59, 1% kod HEp-2 i 60, 5% kod SW620) i proteina (19, 2% kod Caco-2, 14, 0% kod HEp-2 i 24, 4% kod SW620) nakon 4 sata izlaganja. Elektroforezom u 1% agaroznom gelu je nađena fragmentacija DNA. U stanicama izloženim halotanu dolazi do povećanja broja stanica koje su u apoptozi u odnosu na kontrolne, netretirane stanice, što je vidljivo iz ireverzibilnog izlaganja fosfatidilserina na vanjsku stranu stanične membrane. Sevofluran je izazvao manje izraženu inhibiciju staničnog rasta nego halotan u svim staničnim kulturama, osim kod stanica MIA PaCa-2 čiji rast nije značajnije mijenjao. Izofluran nije iskazao inhibicijski učinak na rast tumorskih stanica. Naši rezultati upućuju na apoptozu kao mehanizam smrti tumorskih stanica izloženih halotanu. Da bi se rasvijetlio mehanizam smrti tih stanica potrebna su daljnja istraživanja.

Molekularni mehanizam djelovanja klinoptilolita na tumorske stanice

xx

Manganove soli (10mg/ml) uzrokuju značajan pad ugradnje timidina u tumorske stanice (FsaR, SCCVII) u kulturi ali ne i normalnih stanica. Blokada ugradnje ostaje dulje od 48 sati nakod odstranjenja mangana. Serlektivni učinci manganovih soli na tumorske stanice zaslužuju sdaljnji rad