Search

Porast svetske populacije i savremen način života donose sa sobom i novine na području ishrane u delovima sveta gde ranije određene vrste hrane nisu bile zastupljene. Primer ovoga je primećena zastupljenost korišćenja morskih plodova i insekata u ishrani. U ranijem periodu su morski plodovi bili zastupljeni ishrani prevashodno u zemljama Mediterana, južne, istočne, severne Azije, severne Evrope i Severne Amerike, dok se danas mogu naći na prehrambenom tržištu u gotovo bilo kom delu sveta. Morski plodovi kao što su kozice, škampi, dagnje pored visoke nutritivne vrednosti, što je pozitivan efekat korišćenja ovih proizvoda u ishrani mogu imati i negativan efekat, a to je prisustvo proteina koji su identifikovani kao alergeni, npr. tropomiozin. Zastupljenost insekata u ljudskoj ishrani je najviše zabeležena u Kini, Japanu i drugim azijskim zemljama u ranijem periodu, ali u sadašnjosti ovaj način ishrane se polako proširio i na druge zemlje sveta. Iako su znatno manje zastupljeni u ishrani od morskih plodova, što zbog manje istraženosti i ne tako primamaljivog izgleda, insekti kao npr. cvrčci se trenutno najčešće koriste u sprašenom obliku kao začini. Međitim, insekti takođe sadrže proteine koji su identifikovani kao alergeni; npr. tropomiozin koji može izazvati alergije na ovu vrstu hrane. Tropomiozin iz insekata i morskih plodova je pokazao ukrštenu reaktivnost sa tropomiozinom i drugim proteinima grinja koji su jedni od glavnih izazivača alergijske astme. U ovom završnom radu optimizovana je ekstrakcija ukupnih proteina iz komercijalno kupljenog brašna cvrčka. Koncentracija i proteinski profil ekstrakata je analiziran standardnim biohemijskim metodama, a potom okarakterisan i imunohemijski u reakciji sa specifičnim antitelima ili serumima pacijenata alergičnih na grinje ili morske plodove. Preliminarni rezultati ove studije ukazuju da kvalitet kompletnih proteinskih ekstrakata insekata zavisi od ekstrakcionih uslova. Kompletni proteinski ekstrakt, sa sadržajem protein

Porast svetske populacije uz iscrpljivanje prirodnih resursa na Zemlji, pokrenulo je pitanje i održivost postojenje poljoprivredne proizvodnje u obezbeđivanju dovoljne količine bezbedne hrane u budućnosti. Jestivi insekti su se nametnuli kao alternativa postojećom konvecionalnom stočarstvu i živinarstvu, zbog manjeg uticaja na životnu sredinu i bolje konverzije proteina hrane u proteine insekata u odnosu na svinje, ovcem goveda ili piliće. Mada su jestivi insekti kroz istoriju bili deo tradicionalne ishane za narode koji su vekovima živeli na teritoriji jugo-istočne Azije, Australije, Južne Amerike i Australije, za većinu stanovnika Evrope, Azije i severne Azije oni su hrana koja treba da bude prihvaćena obzirom na osećaj odvratnosti koje stanovnici ovih zemalja imaju prema insektima. Osim ovoga, pitanja kao što su uzgoj insekata na industrijskoj skali, automatizaciju celog postupka gajenja i obrade insekata, mikrobiološka i hemijska ispravnost ovih proizvoda i alergeni potencijal nove hrane još nisu dobila odgovor. U ovom diplomskom radu, prvo je razvijen je protokol za izolovanje i prečiščavanje tropomiozina iz brašnjavog crva (Tenebrio molitore). Količina i elektroforetski profil proteina u pojedinim fazama izolovanja i prečićavanja upoređeni su vizuelno pomoću SDS PAGE. Nakon poslednjeg koraka prečišćavanja na jonoizmenjivačkoj koloni na Q-Sepharose dobijene su dve frakcije, koje su rasoljene i skoncentrovane i u njima je određena koncentracija proteina BCA metodom. U sledećem koraku izoforme tropomiozina iz dobijene dve frakcije su okarakterisane po molekulskoj masi i pI vrednosti na osnovu 2D SDS elektroforeze, a zatim su dalje analizirane masenom spektroskopijom nakon tripsinske digestije. U poslednjem koraku, imunoblotom je upoređena specifičnost vezivanja izolovanog tropomiozina iz brašnjavog crva i drugih beskičmenjaka kao što su kozice, dagnje, školjke i cvrčci prema mišijem anti-kozice tropomiozin monoklonskom antitelu.

Tropomiozini su visoko očuvani kontraktilni proteini kod kičmenjaka i beskičmenjaka, molekulske mase od oko 35-38 kDa. Uprkos njihovoj relativno maloj zastupljenosti, kod porodice beskičmenjaka prepoznati su kao pan-alergeni. Prema statistici tropomiozini su treći najčešći uzrok anafilakse izazvane hranom. U ovom radu ispitani su uslovi optimalne ekstrakcije proteina sirovih i kuvanih dagnji. Krajnji cilj je bila kvantifikacija tropomiozina u dobijenim ekstraktima sirovih i kuvanih dagnji, razvijanjem i optimizacijom uslova ELISA testa. Za potrebe optimizacije uslova ekstrakcije korišćeno je nekoliko pufera različitih pH vrednosti i jonske sile, kao i različito vreme ekstrakcije (2 h i 24 h). Kao model organizam izabrana je mediteranska dagnja. Kvantifikacija proteina u ekstraktima urađena je Bredfordovom metodom, proteinski profili ekstrakata vizualizovani su pomoću natrijum-dodecilsulfat poliakrilamidne gel elektroforeze (SDS-PAGE), a potom je potvrđeno prisustvo tropomiozina Western blotom sa monoklonskim i poliklonskim antitelima. Nakon optimizacije ELISA testa urađena je kvantifikacija tropomiozina u dobijenim ekstraktima. Prema dobijenim rezultatima, nije primećena statistički značajna razlika u koncentracijama proteina u ekstraktima dobijenim nakon 2 h i 24 h. Ekstrakcija proteina dagnji pokazala se efikasnijom sa porastom pH pufera. Vrednosti koncentracija proteina u ekstraktima sirovih i kuvanih dagnji, dobijene Bredfordovom metodom, u skladu su sa elektroforetskim profilima ekstrakata. Denzitometrijom, sa gela kuvanih uzoraka nakon SDS-PAGE, procenjene su bile koncentracije tropomiozina. Western blotom, odrađenim nakon SDS-PAGE, potvrđeno je prisustvo tropomiozina. Pokazano je da tropomiozin kuvanih ekstrakata daje jači signal od tropomiozina iz sirovih solubilnih ekstrakata dagnji. Radi kvantifikacije tropomiozina razvijen je sendvič ELISA test i izračunati su limit detekcije i limit kvantifikacije testa. Koncentracije tropomiozina u ekstraktima dobijene

Morski plodovi su česti uzročnici alergija širom svijeta koje mogu imati i fatalan ishod. Stoga, u cilju njihove prevencije neophodna je detekcija i kvantifikacija alergena, kao i redukcija njihove alergenosti. Termalno procesovanje hrane je jedan od načina smanjenja alergenosti, ali problem je stabilnost određenih proteina na visokim temperaturama, među kojima je i tropomiozin. Riječ je o glavnom termostabilnom alergenu rakova. U ovom radu su optimizovani uslovi ekstrakcije ukupnih proteina zapadno-pacifičkih kozica (lat. Solenocera melantho). Dobijen je uvid u uspješnost ekstrakcije određivanjem koncentracije ukupnih proteina i upoređivanjem elektroforetskih profila. Tropomiozin i ostali alergeni kozica su detektovani Western blotom, a u cilju osjetljive kvantifikacije tropomiozina u ekstraktima razvijen je i ELISA test. Takođe, ispitana je ukrštena reaktivnost tropomiozina iz morskih plodova i iz grinja Western blotom.