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• Introduction: choix de ce sujet – corpus – méthodologie – contexte• Chronologie de l’affaire Pusztai• Les comportements des différents acteurs:journalistes – scientifiques – politiques• Les conséquences pratiques de l’affaire• Bilan et conclusions

Une mutation intronique du gène C9orf72 est une cause prépondérante de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte. Cependant, la fonction de C9orf72 demeure incertaine. Heureusement, les modèles animaux sont une excellente façon d’en faire l’étude in vivo dans des systèmes complexes. Conséquemment, pour étudier la fonction et l’expression de C9orf72, nous avons tenté de développer 3 lignées de poissons-zèbres pour lesquelles des étiquettes 12xhistidines ou eGFP devaient être insérés par CRISPR/Cas9 près du N et C terminal de C9orf72. Surprenamment, ces modifications furent mal tolérées durant le développement, empêchant l’obtention de sujets F0 adultes en mesure de transmettre un tag inséré. Pour étudier l’effet d’une invalidation persistante de C9orf72 chez le poisson, une lignée présentant une délétion près du N-terminal menant à un knock-out fonctionnel de C9orf72 a été développée des poissons injectés pour l’insertion de 12xHistidine. Nos résultats préliminaires suggèrent un phénotype au niveau de la mobilité et de la mortalité. De plus, deux lignées de poissons transgéniques exprimant le gène C9orf72 humain, seul ou marqué au eGFP, ont été développées par Tol2 pour étudier la localisation de C9orf72 et l’effet de sa surexpression. Ces lignées, une fois validées et caractérisées, permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives pour caractériser la fonction et l’expression de C9orf72 ainsi que la modélisation de la SLA. Il semble donc que la perte d'un allèle ou une haplo-insuffisance du gène C9orf72 est mal tolérée, mais que la transgenèse, par addition d'un troisième allèle, permettrait l'étude de C9orf72 in vivo., An intronic mutation in the gene C9orf72 is the most prevailing cause of Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), an adult onset neurodegenerative disease of the motoneurons. Despite this, the function of C9orf72 remains uncertain. As animal models are an excellent way to study gene function and expression in vivo in complex systems, by using the CRISPR/Cas9 system we attempted to generate 3 lines of zebrafishes for which 12xhistidines or eGFP tags were inserted near either the N or C terminal of C9orf72. Surprisingly, these modifications were ill tolerated during the development, preventing us from obtaining F0 specimens able to pass on the inserted tag for any of our lines. To study the effects of a persistent knock-out of C9orf72 in the zebrafish, a line with deletions near the N-terminal, resulting in a functional knock-out of C9orf72, was obtained from the fishes injected for the 12xHistidine insertion. Preliminary results indicate a higher mortality rate and decrease mobility phenotypes. Additionally, two transgenic zebrafish lines expressing human C9orf72 alone or with eGFP were generated, using Tol2 in order to study C9orf72 localisation and the effect of its overexpression namely on morphology, development and the central nervous system. These lines, once validated and characterised will open new avenues to determine the role and subcellular localization of C9orf72, as well as for modeling ALS. Thus, it appears that the loss of an allele or haploinsufficiency of the C9orf72 gene is ill tolerated, but that transgenesis, by addition of a third allele, may allow for in vivo study of C9orf72.

Recently developed transgenic techniques to explore and exploit the metabolic potential of microalgae present several drawbacks associated with the delivery of exogenous DNA into the cells and its subsequent integration at random sites within the genome. Here, we report a highly efficient multiplex genome-editing method in the diatom Phaeodactylum tricornutum, relying on the biolistic delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins coupled with the identification of two endogenous counter-selectable markers, PtUMPS and PtAPT. First, we demonstrate the functionality of RNP delivery by positively selecting the disruption of each of these genes. Then, we illustrate the potential of the approach for multiplexing by generating double-gene knock-out strains, with 65% to 100% efficiency, using RNPs targeting one of these markers and PtAureo1a, a photoreceptor-encoding gene. Finally, we created triple knock-out strains in one step by delivering six RNP complexes into Phaeodactylum cells. This approach could readily be applied to other hard-to-transfect organisms of biotechnological interest.

O presente artigo analisará os efeitos das normas no avanço da biotecnologia no ordenamento jurídico brasileiro em face dos transgênicos/ segurança alimentar e do Direito da Propriedade Intelectual. Premente à questão alimentar enquanto garantia fundamental de Dignidade humana ratificada na Declaração dos Direitos Humanos. O embate das políticas socioambientais, no tocante a segurança alimentar é de relevância mundial, observadas desde os primórdios da civilização com a utilização de técnicas rudimentares e manejo de sementes. Ao longo do aperfeiçoamento biotecnológico surge a necessidade de coibir eventuais abusos na instrumentalização científica de pesquisa em cultivares, imprimindo na Legislação Nacional e Internacional a regulamentação das instituições públicas e privadas no cenário de representatividade e projeção biotecnológica._________________________________________________________________________________________ ABSTRACT: This article will examine the effects of standards in the advancement of biotechnology in the Brazilian legal system in the face of transgenic / food security and Intellectual Property Law. Urgent the question of food as a fundamental guarantee of human dignity ratified the Declaration of Human Rights. The clash of socio environmental politics with regard to food security is of global significance, observed since the dawn of civilization to the use of rudimentary techniques and handling of seed. Throughout the biotechnological enhancement comes the need to restrain potential abuses in scientific search instrumentalization contents in cultivars, printing to the National Legislation and International regulation of public and private institutions in the representativeness and biotechnology projection scenery._________________________________________________________________________________________ RÉSUMÉ: Cet article examine les effets des normes dans la promotion de la biotechnologie dans le système juridique brésilien en face de GM sécurité / alimentaire et le droit de la propriété intellectuelle. Appuyant question de l'alimentation comme une garantie fondamentale de la dignité humaine a ratifié la Déclaration des droits de l'homme. Le choc des politiques de l'environnement en matière de sécurité alimentaire est d'une importance mondiale, observée depuis l'aube de la civilisation à l'utilisation de techniques et de gestion des semences rudimentaires. Le long de l'amélioration biotechnologique se pose la nécessité de freiner les abus de scientifiques cultivars d'instrumentation de la recherche, de l'impression sur la législation nationale et la réglementation internationale des institutions publiques et privées dans la représentativité et de la biotechnologie scénario de projection.

The translational initiation factors eIF4E represent the main resistance to Potyvirus as well as to other families of plant RNA virus.[br/] Although those factors are encoded by small multigenic families, it has been shown that each virus can only use specific eIF4E to perfom its cycle in plants.[br/] Often, this coincides with the ability of the virus VPg to interact with those host proteins. Using Arabidopsis transgenic approaches, we aimed at better understanding the basis of the virus specificity for eIF4E.

International audience; Aromatase is the only enzyme responsible for the irreversible conversion of androgens into estrogens. Teleost fishes have two copies of the cyp19a1 gene that encode two isoforms of aromatase: cyp19a1a encodes ovarian aromatase, while the cyp19a1b gene encodes brain aromatase (aromatase B). We have shown that (i) aromatase B is strongly expressed in radial glial cells (RGC), that act as stem cells in mammals and fish and ii) the cyp19a1b gene is very sensitive to estrogens, through a mechanism that involves a well conserved ERE. This feature makes this gene an outstanding biomarker of xeno-estrogen exposures and we have developed and validated an in vivo assay allowing detection of estrogenic activity with a very high sensitivity. The in vivo assay is based on a transgenic zebrafish tg(cyp19a1b-GFP) line that expresses GFP in RGCs and we demonstrate the usefulness of the transgenic cyp19a1b-GFP as a reliable, sensitive and rapid in vivo estrogenic screening assay.

The recent discoveries of the kisspeptin system and its involvement in reproduction have been major breakthroughs in neuroendocrinology. In zebrafish, two kisspeptins (Kiss1 and Kiss2) and two kisspeptins receptors (GPR54.1 = Kiss1r and GPR54.2 = Kiss2r) are expressed and each of them is encoded by a single gene. Recently, we have fully described the distribution of the kisspeptins and their receptors in the brain of adult zebrafish. Kiss2 expressing neurons are mostly localized in the dorsal and ventral hypothalamus. They project widely in the midbrain and anterior brain in regions expressing the Kiss2r and are likely in contact with GnRH3 fibers. In contrast, Kiss1 expressing neurons are exclusively localized in the habenula, which also expresses the Kiss1r, and project in the interpeduncular and raphe nuclei. These results suggest a gene speciation in zebrafish, with the Kiss2 system involved in reproductive processes and the Kiss1 system in interactions with others processes like food intake or environmental perception. Interestingly, exposure of juvenile zebrafish to estrogens up-regulates the kiss2 gene, suggesting that the Kiss2 system could mediate the neuroendocrine control of reproduction by estrogens. In order to study (i) the kiss2 expression in early development and (ii) the modulation of this expression in response to estrogens, we developed a transgenic zebrafish line, zftg(kiss2-GFP), expressing GFP under the control of the zebrafish kiss2 promoter. This zebrafish transgenic line, validated by immunohistochemistry, expresses GFP as early as 4 dpf in the hypothalamus, demonstrating that the kiss2 system is functional widely before sexual maturation. Moreover, exposure of zebrafish embryos to estrogens enhances the number of Kiss2 immunoreactive-fibers, suggesting that estrogens modulate the development of kiss2 neurons. Taken together, these results reinforce the view that, in zebrafish, kiss2 is probably linked to the regulation of reproductive processes. Moreover, the zftg(kiss2-GFP) line appears to be a promising tool to study the role of Kiss2 in early development, notably its interaction with the GnRH system, but also its potential disruption by environmental estrogenic compounds.

Le virus Nipah (NiV) est un paramyxovirus zoonotique émergent hautement pathogène. Il est capable d’infecter un large spectre d’hôtes incluant notamment la chauve-souris frugivore (réservoir naturel), le porc et l’homme. Bien que les récepteurs cellulaires au virus (EFN B2 et B3) soient fonctionnels chez la souris, celle-ci est résistante à l’infection par voie intrapéritonéale. Nous avons analysé la susceptibilité au NiV de souris transgéniques privées de leur récepteur à l’interféron de type I (IFNAR KO). L’ARN viral est détectable dans tous les organes analysés. L’infection est associée au développement d’une encéphalite fatale aux caractéristiques immunohistologiques similaires à celles observées chez l’homme. Ces résultats permettent donc d’envisager les souris IFNAR KO comme un nouveau modèle animal pour l’étude de la pathogénèse du NiV. Enfin, cette étude suggère que le système interféron de type I joue un rôle crucial dans la limitation de la propagation virale vers le cerveau.

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots., Decoy receptor 3 (DcR3) is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family, and is widely expressed in human normal tissues and malignant tumors. It is a decoy receptor of three TNF family members, i.e., FasL, LIGHT and TL1A. The interaction of DcR3 and its ligands will not transmit signal into cells via DcR3 because DcR3 is a soluble protein without a transmembrane and intracellular segment. Thereby, DcR3 competitively inhibits signaling through three functional receptors, i.e., Fas, HVEM/LTbetaR and DR3. In previous studies, we found that DcR3 could modulate immune cell function, and protect islet viability. Herein, we generated DcR3 transgenic (Tg) mice driven by the human β-actin promoter to further investigate the function of DcR3. Interestingly, the DcR3 Tg mice developed a lupus-like syndrome at 6 months of age. They presented a variety of autoantibodies including anti-nucleus and anti-dsDNA antibodies. They also manifested renal, dermal, hepatic and hematopoietic lesions. Compared to lpr and gld mouse lupus models, DcR3 Tg mice more closely resembled human SLE in terms of Th2-biased immune response and anti-Sm antibody production. Furthermore, we found that DcR3-producing hematopoietic cell were sufficient to cause these pathological changes. Mechanistically, DcR3 may break T-cell homeostasis to interfere with peripheral tolerance, and then induce autoimmunity. In humans, we detected high DcR3 levels in SLE patient sera. The high DcR3 levels were related to elevated IgE titer in some SLE patients, as was the case in the mouse model. Therefore, DcR3 may represent an important pathogenetic factor of human SLE. Utilizing the DcR3 Tg mouse, we further elucidated the mechanism by which DcR3 protected islets from primary nonfunction (PNF). Blocking of LIGHT and TL1A signaling by DcR3 are involved in such protection. Moreover, by mRNA microarray we identified possible downstream molecules, which may mediate such protection. We confirmed that Adcyap1 and Bank1 played critical roles in mediating DcR3’s effect in islet protection. Our studies resolved a puzzle about the relationship between the Fas/FasL apoptosis signaling pathway and the pathogenesis of human SLE. DcR3 can block Fas/FasL pathway even if there is no genetic mutation in Fas and FasL. DcR3 can simultaneously interfere with LIGHT and TL1A signaling to cause a more complex phenotype than the simple Fas or FasL mutation in patients. DcR3 can also be employed as a potential diagnostic parameter for SLE. The discovery of the mechanism of DcR3 in protecting islets allows us to explore novel therapeutic targets to protect islet graft.

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète., Drak2 is a member of the death-associated protein family, and is a serine threonine kinase. In Drak2 null mutant mice, T cells have no apparent defect in activation-induced apoptosis after stimulation with anti-CD3 and anti-CD28, but have a lowered threshold to stimulation, compared with wild type (WT) T cells. In our study, in situ hybridization analysis has revealed that Drak2 expression is ubiquitous at the mid-gestation stage in embryos, followed by more focal expression in various organs in the perinatal period and adulthood, notably in the thymus, spleen, lymph nodes, cerebellum, suprachiasmatic nuclei, pituitary, olfactory lobes, adrenal medulla, stomach, skin and testes. We generated Drak2 transgenic (Tg) mice using the human beta-actin promoter. These Tg mice showed normal T cell versus B cell and CD4 versus CD8 populations in the spleen, but their spleen weight cellularity was lower in comparison with wild type mice. After TCR activation, the proliferation response in Drak2 Tg T cells was normal, although their interleukin (IL)-2 and IL-4 but not interferon-r production was augmented. Activated Drak2 Tg T cells demonstrated significantly enhanced apoptosis in the presence of exogenous IL-2. At the molecular level, Drak2 Tg T cells manifested a lower increase of anti-apoptotic factors during activation; such a change probably rendered the cells vulnerable to subsequent IL-2 insults. The heightened apoptosis in Drak2 Tg T cells was associated with reduced numbers of T cells with the memory cell phenotype (CD62Llo) and repressed secondary T cell responses in delayed type hypersensitivity. These results demonstrate that Drak2expresses in the T cell compartment but is not T cell-specific; and it plays critical roles in T cell apoptosis and memory T cell development. Further, we investigated the role of Drak2 in beta-cell survival and diabetes. Drak2 mRNA and protein were rapidly induced in islet beta-cells after exogenous inflammatory cytokine or free fatty acid stimulation, which is present endogenously in either type 1 or type 2 diabetes. Drak2 upregulation was accompanied by increased beta-cell apoptosis. The beta-cells apoptosis caused by the said stimuli was inhibited by Drak2 knockdown using siRNA. Conversely, transgenic (Tg) Drak2 overexpression led to aggravated beta-cell apoptosis triggered by the stimuli. Drak2 overexpression in islets compromised the increase of anti-apoptotic factors, such as Bcl-2, Bcl-xL and Flip, upon the cytokine and free fatty acid stimulation. Further in vivo experiments demonstrated that Drak2 Tg mice were prone to type 1 diabetes in a multiple-low-dose streptozotocin-induced diabetes model, and they were also prone to type 2 diabetes in a diet-induced obesity model. Our data show that Drak2 is detrimental to beta-cell survival. We also investigated the signalling pathway of Drak2. We found that purified Drak2 could phosphorylate p70S6 kinase in an in vitro kinase assay. Drak2 overexpression in NIT-1 cells led to enhanced p70S6 kinase phosphorylation, while Drak2 knockdown in these cells reduced the phosphorylation. These mechanistic studies proved that p70S6 kinase was a bona fide Drak2 substrate in vitro and in vivo.This study has discovered the important functions of Drak2 in T cell homeostasis and diabetes. We proved that p70S6 kinase was a substrate of Drak2. Our findings have broadened our knowledge of Drak2 in the immune and endocrine system. Some of our findings, such as the roles of Drak2 in memory T cell development and beta cell survival could be explored for clinical application in the areas of transplantation and diabetes.

Mon document "Titres et travaux" contient 5 articles au format éditeur.; Mes premiers travaux de recherche, me permettant de soutenir une thèse de doctorat en décembre 1999, ont été effectués au sein du laboratoire du professeur Bernard GRANDCHAMP (unité 409 de l'INSERM) sous la direction du docteur Marie-Christine LECOMTE. Mon travail s'est intégré dans l'étude fonctionnelle et structurale de certains domaines des spectrines érythroïdes et non érythroïdes, principalement le site de tétramérisation et le domaine SH3. Concernant la tétramérisation de la spectrine érythroïde j'ai identifié les régions minimales nécessaires et suffisantes pour former le tétramère puis j'ai mis en évidence une relation entre certaines mutations de la spectrine associées à des anomalies membranaires du globule rouge et la sévérité du défaut de formation du tétramère. J'ai ensuite identifié plusieurs ligands du domaine SH3 de la spectrine non érythroïde. L'un d'entre eux m'a permis de définir une régulation de la protéolyse ciblée de cette spectrine faisant intervenir un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation. Ma formation initiale fut donc celle d'un biochimiste que j'ai étendue peu à peu vers la biologie moléculaire et la biologie cellulaire.Puis, souhaitant acquérir les connaissances nécessaires au développement de modèles murins, j'ai décidé d'effectuer mon stage post-doctoral à l'Institut COCHIN (unité 567 de l'INSERM) dans une équipe co-dirigée par le docteur Sophie VAULONT et le professeur Axel KAHN. Je me suis ainsi familiarisé avec la souris comme « outil » de recherche (gestion d'un élevage, établissement de nouvelles lignées, génotypage, phénotypage). Je travaillais initialement sur le métabolisme du glucose mais j'ai complètement réorienté ma thématique de recherche au bout d'un an pour finalement identifier et caractériser une hormone, l'hepcidine, contrôlant l'homéostasie du fer.J'ai été nommé chargé de recherche de grade 2 dans l'unité 409 de l'INSERM en octobre 2002 pour y développer une souche de souris exprimant une spectrine non érythroïde résistante à des mécanismes de protéolyse ciblée. Il s'agit donc toujours d'appréhender certaines fonctions des spectrines mais dans un contexte in vivo. En janvier 2005 j'ai intégré l'unité 665 de l'INSERM dirigée par Yves COLIN afin de poursuivre ce projet. Aujourd'hui, je suis chargé de recherche de grade 1.Le chapitre scientifique de ce mémoire est divisé en deux parties distinctes : la première traite de mon travail sur la spectrine tandis que la seconde porte sur l'hepcidine. Chaque partie est composée d'une introduction au sujet suivie d'un résumé des travaux que j'ai effectués et/ou dirigés.

Les biotechnologies, si elles s’inscrivent dans le cadre d’un développement durable conciliant enjeux économiques et éthiques, semblent promises à une forte croissance. La mise en place d’un cadre statistique international devrait accompagner leur essor, facilitant le suivi et les comparaisons. Les études réalisées font le constat d’un retard de la France et plus globalement de l’Europe par rapport aux États-Unis.Le CNRS via son implication dans le Genopole® d’Évry, ses partenariats industriels, son soutien à la création de sociétés et le dynamisme de ses laboratoires est un acteur important de ce domaine où « le continuum formation, recherche et innovation » se trouve être un facteur clé pour réussir.Pour l’industrie pharmaceutique, les biotechnologies sont considérées comme une source fondamentale d’innovation appliquée aux différents stades de l’élaboration d’un médicament :génomique structurale et fonctionnelle, thérapie génique, pharmaco-génomique... Elles tendent vers le développement de traitements ciblés, plus efficaces, moins toxiques et adaptés à chacun.La recherche dans ces différentes thématiques nécessite une approche multidisciplinaire et la mise en place de partenariats entre les acteurs. Le CNRS de part sa taille et ses prédispositions devrait au niveau français et européen jouer un rôle majeur.

The composition of T lymphocyte's compartments is constantly modified, because of the production of new TCR specificities, selection after antigen encounter and cell death. In order to control the cell transition between central and peripheral compartments, mechanisms of homeostatic regulation maintain the immune system in a steady-state. As seen in any ecosystem, T lymphocytes are in competition for limited selection niches and resources. During this thesis, we have used mice in order to analyse the behaviour of CD8+ T ab lymphocytes after an environmental perturbation. We have also used MHC class I molecules as a model of resource necessary for CD8+ T cell survival.We have first studied central and peripheral selection of CD8+ T cells double-transgenic for the male-specific TCR aHY and the TCR P14, specific for the the epitope gp33-41 from the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). This mouse model is representative of a common phenomenon in the immune system, since 30% of human and mouse T cells can express two different TCRs at their surface. Our results show that the expression of two TCRs is sufficient to escape partially to negative selection in the thymus, and to resist to clonal deletion at the periphery. We have next analysed the establishment of LCMV chronic infection in mice expressing only the P14 TCR (MoP14 mice). We could observe the selective emergence of viral mutants, all specifically mutated in the epitope gp33-41, and a modification of the functional behaviour of CD8+ T cells in the chronically infected animals. Altogether, these data suggest that CD8+ T cells adapt to their environmental conditions.Finally, we have focused our attention on the survival and homeostatic proliferation of CD8+ T cells, by studying the influence of MHC class I molecules in these processes. Our results indicates that the T cell fate is directly linked with the cross-reactivity of the different TCRs used in our experiments.; La composition des compartiments lymphocytaires T est soumise à de constantes modifications, sous l'effet conjugué de la production de nouvelles spécificités, de la sélection lors d'une rencontre avec un antigène et de la mort cellulaire. Face à ces flux de cellules entre les différents compartiments centraux et périphériques, les mécanismes de la régulation homéostatique assurent le fait que le système immunitaire se maintienne à l'équilibre. A l'image d'un écosystème, on peut alors observer que les lymphocytes T entrent en compétition les uns avec les autres pour des niches de sélection et des ressources en quantité limitée. Durant ce travail de thèse, réalisé chez la souris, nous avons analysé le comportement des lymphocytes T ab CD8+ face à un bouleversement de leur environnement, et nous avons travaillé sur les molécules de classe I du CMH comme modèle de ressource nécessaire à la survie des cellules T ab CD8+.Dans un premier temps, nous avons étudié la sélection centrale et périphérique de cellules T ab CD8+ exprimant deux transgènes codant respectivement pour le TCR aHY, spécifique de l'antigène mâle H-Y, et le TCR P14, spécifique du peptide gp33-41 issu du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Ce modèle reproduit un phénomène courant dans le système immunitaire, puisqu'on trouve chez l'homme et la souris jusqu'à 30% de cellules exprimant deux TCR différents à leur surface. Nos résultats montrent que l'expression de deux TCR par les cellules T ab CD8+ leur permet d'échapper partiellement à la sélection négative dans le thymus, et de résister à la délétion clonale à la périphérie. Dans un second temps, nous avons étudié l'établissement d'une infection chronique par le LCMV dans des souris n'ayant pour lymphocytes que des cellules T exprimant le TCR P14 (souris MoP14). Nous avons pu observer que cette infection passe par la sélection de variants viraux spécifiquement mutés au niveau de l'épitope gp33-41, mais également par la modification du comportement des cellules T ab CD8+ des animaux. L'ensemble de ces données plaide pour un modèle d'adaptation des lymphocytes T ab CD8+ à leurs conditions environnementales.Enfin, nous avons étendu ce travail à l'étude de l'influence des molécules de classe I du CMH sur la survie et la prolifération homéostatique des lymphocytes T ab CD8+, en utilisant une gamme de souris transgéniques pour le TCR. Nos résultats montrent une variété de comportements en relation avec la réactivité croisée supposée des différents TCR utilisés.

The composition of T lymphocyte's compartments is constantly modified, because of the production of new TCR specificities, selection after antigen encounter and cell death. In order to control the cell transition between central and peripheral compartments, mechanisms of homeostatic regulation maintain the immune system in a steady-state. As seen in any ecosystem, T lymphocytes are in competition for limited selection niches and resources. During this thesis, we have used mice in order to analyse the behaviour of CD8+ T ab lymphocytes after an environmental perturbation. We have also used MHC class I molecules as a model of resource necessary for CD8+ T cell survival.We have first studied central and peripheral selection of CD8+ T cells double-transgenic for the male-specific TCR aHY and the TCR P14, specific for the the epitope gp33-41 from the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). This mouse model is representative of a common phenomenon in the immune system, since 30% of human and mouse T cells can express two different TCRs at their surface. Our results show that the expression of two TCRs is sufficient to escape partially to negative selection in the thymus, and to resist to clonal deletion at the periphery. We have next analysed the establishment of LCMV chronic infection in mice expressing only the P14 TCR (MoP14 mice). We could observe the selective emergence of viral mutants, all specifically mutated in the epitope gp33-41, and a modification of the functional behaviour of CD8+ T cells in the chronically infected animals. Altogether, these data suggest that CD8+ T cells adapt to their environmental conditions.Finally, we have focused our attention on the survival and homeostatic proliferation of CD8+ T cells, by studying the influence of MHC class I molecules in these processes. Our results indicates that the T cell fate is directly linked with the cross-reactivity of the different TCRs used in our experiments.; La composition des compartiments lymphocytaires T est soumise à de constantes modifications, sous l'effet conjugué de la production de nouvelles spécificités, de la sélection lors d'une rencontre avec un antigène et de la mort cellulaire. Face à ces flux de cellules entre les différents compartiments centraux et périphériques, les mécanismes de la régulation homéostatique assurent le fait que le système immunitaire se maintienne à l'équilibre. A l'image d'un écosystème, on peut alors observer que les lymphocytes T entrent en compétition les uns avec les autres pour des niches de sélection et des ressources en quantité limitée. Durant ce travail de thèse, réalisé chez la souris, nous avons analysé le comportement des lymphocytes T ab CD8+ face à un bouleversement de leur environnement, et nous avons travaillé sur les molécules de classe I du CMH comme modèle de ressource nécessaire à la survie des cellules T ab CD8+.Dans un premier temps, nous avons étudié la sélection centrale et périphérique de cellules T ab CD8+ exprimant deux transgènes codant respectivement pour le TCR aHY, spécifique de l'antigène mâle H-Y, et le TCR P14, spécifique du peptide gp33-41 issu du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Ce modèle reproduit un phénomène courant dans le système immunitaire, puisqu'on trouve chez l'homme et la souris jusqu'à 30% de cellules exprimant deux TCR différents à leur surface. Nos résultats montrent que l'expression de deux TCR par les cellules T ab CD8+ leur permet d'échapper partiellement à la sélection négative dans le thymus, et de résister à la délétion clonale à la périphérie. Dans un second temps, nous avons étudié l'établissement d'une infection chronique par le LCMV dans des souris n'ayant pour lymphocytes que des cellules T exprimant le TCR P14 (souris MoP14). Nous avons pu observer que cette infection passe par la sélection de variants viraux spécifiquement mutés au niveau de l'épitope gp33-41, mais également par la modification du comportement des cellules T ab CD8+ des animaux. L'ensemble de ces données plaide pour un modèle d'adaptation des lymphocytes T ab CD8+ à leurs conditions environnementales.Enfin, nous avons étendu ce travail à l'étude de l'influence des molécules de classe I du CMH sur la survie et la prolifération homéostatique des lymphocytes T ab CD8+, en utilisant une gamme de souris transgéniques pour le TCR. Nos résultats montrent une variété de comportements en relation avec la réactivité croisée supposée des différents TCR utilisés.

On affirme, même sans preuve avérée, que les aliments issus de la transformation génétique des plantes présentent des risques pour l’homme et les animaux. On reconnaît seulement les avantages agronomiques des plantes génétiquement modifiées (GM) ayant fait l’objet d’une autorisation de dissémination. L’équivalence en substance (composition chimique), la sécurité et l’innocuité ont pourtant été vérifiées préalablement à leur autorisation. C’est seulement récemment que l’on a démontré chez les animaux de ferme l’équivalence nutritionnelle de ces plantes et de leurs dérivés. Aucun signe de toxicité du soja, du pois, du lupin, du coton, de la pomme de terre chez le rat ou du colza chez le lapin n’ont été observés. De nombreux travaux sur animaux cibles ont été récemment publiés : ils sont récapitulés et interprétés dans cet article. Ainsi, par exemple, 11 tests combinés de tolérance et de valeur alimentaire ont été effectués sur le poulet de chair et 11 tests sur le porc concernent le maïs grain, ou le soja résistant aux herbicides ou aux insectes. Les fourrages à base de plantes entières, les graines de coton , de soja GM ont fait l’objet de 17 publications de résultats observés sur les ruminants, vaches laitières et bovins à l’engrais, sur des durées allant de 21 à 246 jours. Ces essais montrent l’équivalence alimentaire des plantes GM par rapport aux plantes parentales ; aucun effet n’a été observé sur la composition et les propriétés technologiques du lait. La recherche de résidus de l’ADN transformant dans les muscles du poulet ou dans le lait des vaches s’est toujours avérée négative. Par ailleurs, la résistance aux insectes chez le maïs s’accompagne d’une réduction substantielle de la teneur en mycotoxines (trichotécènes, fumonisine B1) dans le maïs grain. Enfin, la réduction du taux de phosphore phytique dans le maïs permet de réduire considérablement les rejets de phosphore dans les effluents des élevages d’animaux monogastriques., Novel feedstaffs must be rigourously assessed for their safety for farm animals and further for the human food chain. Several publications in the scientific literature have recently reported data from experimental tests performed on laboratory animals, then on poultry, pig and ruminants species. A review of the most recent results concerning GM maize, soybean, sugar- and fodder beet, peas, cotton, potatoes and lupine has been undertaken. Toxicological studies performed up to 28 days on rats failed to demonstrate any detrimental effects on performance, metabolism and histo-pathological traits. Complementary data concerning herbicide or insect tolerant GM plants fed to chickens and pigs during their all life have confirmed the nutritional equivalence predicted by chemical analysis. Dairy cows fed whole maize plants and long term-feeding trials conducted on fattening bulls reinforced these results. The composition and the quality of milk and meat was not affected by feeding GM plants. Appropriate experimental procedures can be proposed to test the safety and the nutritional value of new GM feedstuffs for farm animals.

Plant characteristics are known to alter endophytic and rhizosphere microbial communities; however, the effect of crop breeding programs on the microbial endophytic and rhizosphere communities is not clear. The purpose of this study was to determine if root-associated microbial communities differed between three cultivars of canola (Brassica spp.) and wheat (Triticum spp.). BiologTM analysis was used to characterize the microbial communities associated with the root interior and rhizosphere soil of field grown canola (Parkland, Excel, and Quest cultivars) as well as wheat (PI 167549, Red Fife, and CDC Teal cultivars). Fatty acid methyl ester (FAME) profiles of roots and rhizosphere soil of the cultivars were also compared. These crop cultivars represent a continuum from older to the most recent crop cultivars, with Quest being a transgenic canola variety tolerant of the herbicide glyphosate. To the best of our knowledge, Quest is not directly related to Parkland or Excel. The endophytic community of Quest used the BiologTM polymer, carbohydrate, amino acid, and miscellaneous functional guilds at a slower rate than the endophytic community of Excel or Parkland. Furthermore, there were lower levels of the microbial FAMEs, 18:0, 18:3 w6c (6,9,12), 16:0 2OH, and 15:0 2OH in the roots of Quest compared with Excel or Parkland. In contrast, there were no differences in the utilization rate of BiologTM functional guilds or the microbial FAMEs in the roots of the three wheat cultivars studied. The correlation between the ability of endophytic and rhizosphere communities to utilize BiologTM substrates was lower in Quest and CDC Teal compared with earlier crop cultivars. Our results indicate that endophytic and rhizosphere microbial communities of the transgenic cultivar Quest were different from nontransgenic cultivars grown at the same field site.Key words: Brassica spp., Triticum spp., rhizosphere, endophytes, FAME, BiologTM, transgenic.

Pigmentation is a complex process that provides many diverse benefits for the organism. Pigment production takes place in the pigment cell lineage in dedicated organelles called melanosomes. Several proteins are specifically recruited to melanosomes for this purpose, and many of them are involved in melanin synthesis. MART-1 is one of the melanosomal proteins. It has been widely studied as an agent for immunotherapy against malignant melanoma but very little is known about the gene and its function. Here, I used different approaches in order to understand the biology of this pigment cell specific gene. First, I analyzed transcriptional regulation of the mouse MART-1 gene. I found that the shortest promoter region (0.6kb) alone is not sufficient to drive the expected MART-1 expression in vivo, even though it was able to express a luciferase reporter in vitro, in transfected cells. The largest promoter region (6.0kb) was able to produce expression of a LacZ reporter gene in the RPE layer starting from the early stages of embryogenesis. However it failed to drive melanoblast-specific expression in embryos and, only after birth, reporter gene expression in melanocytes became visible, indicating that distal regulatory elements might be involved in melanocyte/melanoblastspecific MART-1 expression. In order to visualize the spatial and temporal expression pattern of MART-1, I developed a MART-1::LacZ BAC reporter mouse and showed that in mouse, MART-1 expression starts at around E11.5-12.5, and its expression is exclusive to melanocytes and RPE. To understand the function of MART-1, I developed a knockout mouse model. I have shown for the first time that MART-1 is directly involved in pigmentation and that its loss leads to coat color dilution. It has been reported that MART-1 might be involved in trafficking and processing of the melanosomal proteins Pmel17 and OA1. I analyzed the distribution of Pmel17 and OA1, as well as other melanosomal proteins in melanocyte lines derived from MART-1 knockout mice, however no mislocalizations were observed. Besides, in primary knockout melanocytes, the processing of Pmel17 was not affected. Nevertheless, electron microscopy studies revealed that MART-1 knockout mice had severe morphological defects in melanosomes of the hair follicle melanocytes. This indicated that the coat color dilution observed in MART-1 knockout mice might be due to the structural defects in the melanosomes, suggesting that MART-1 is required for melanosome biogenesis in the hair follicle.

In animals, pigment cells are essential for coloration, as seen in feathers, fur, skin and eyes. In mammals, neural crest-derived melanocytes constitute the major population of pigment cells that is located mainly in the skin epidermis, as well as in hair follicles. A minor population of pigment cells originates from the optic cup and forms the retinal pigment epithelium (RPE), a cell monolayer lying between the neural retina and the choroid. In many cell types, the Notch signaling pathway regulates diverse biological processes such as cell fate decision, differentiation, stem cell maintenance or apoptosis. In my thesis project, the role of this pathway was investigated using Notch1, Notch2 and RBP-Jκ conditional knockout mice. Disruption of the Notch pathway by inactivation of Notch1 and Notch2, or RBP-Jκ in the melanocyte lineage using Tyr::Cre transgenic mice resulted in a gene dosage-dependent precocious hair graying, with the most pronounced effect seen in mice lacking both Notch1 and Notch2 in melanocytes. Histologically, this coat color dilution was explained by the progressive elimination of melanocytes and melanocyte stem cells, identified in skin or embryos by X-Gal staining (Dct::LacZ reporter mouse line) and immunofluorescence analyses. As in neural crest-derived melanocytes, members of the Notch signaling pathway are normally expressed in pigment cells of the RPE. The RPE-restricted deletion of RBP-Jκ using Tyrp1::Cre transgenic mice resulted in a microphthalmic eye phenotype and thus indicated a role of the Notch pathway in the development of the RPE. Further analyses demonstrated that misregulation of Notch signaling in RPE induced a reduction in the number of these pigment cells. In addition to these knockout studies, I have generated transgenic mouse lines that express the constitutively activated intracellular part of Notch (NotchIC) in melanocytes (Dct::NotchIC) and RPE cells (Tyrp1::NotchIC). Since these mice rescue the phenotypes observed in the conditional Notch receptor knockouts, they are instrumental to assess the implication of active Notch signaling in pigment cell development and tumorigenesis. Moreover, it might be determined whether constitutive activation of Notch can prevent physiological hair graying and loss of stem cells. In summary, my results underline the importance of fine-tuned Notch signaling for proper hair pigmentation and, more generally, for pigment cell development.