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Le rythme impressionnant auquel les technologies de séquençage progressent est alimenté par leur promesse de révolutionner les soins de santé et la recherche biomédicale. Le séquençage par nanopores est devenu une technologie attrayante pour résoudre des lacunes des technologies précédentes, mais aussi pour élargir nos connaissances sur le transcriptome en générant des lectures longues qui simplifient l’assemblage et la détection de grandes variations structurelles. Au cours du processus de séquençage, les nanopores mesurent les signaux de courant électrique représentant les bases (A, C, G, T) qui se déplacent à travers chaque nanopore. Tous les nanopores produisent simultanément des signaux qui peuvent être analysés en temps réel et traduits en bases par le processus d’appel de bases. Malgré la réduction du coût de séquençage et la portabilité des séquenceurs, le taux d’erreur de l’appel de base entrave leur mise en oeuvre dans la recherche biomédicale. Le but de ce mémoire est de classifier des séquences d’ARNm individuelles en différents groupes d’isoformes via l’élucidation de motifs communs dans leur signal brut. Nous proposons d’utiliser l’algorithme de déformation temporelle dynamique (DTW) pour l’alignement de séquences combiné à la technologie nanopore afin de contourner directement le processus d’appel de base. Nous avons exploré de nouvelles stratégies pour démontrer l’impact de différents segments du signal sur la classification des signaux. Nous avons effectué des analyses comparatives pour suggérer des paramètres qui augmentent la performance de classification et orientent les analyses futures sur les données brutes du séquençage par nanopores., The impressive rate at which sequencing technologies are progressing is fueled by their promise to revolutionize healthcare and biomedical research. Nanopore sequencing has become an attractive technology to address shortcomings of previous technologies, but also to expand our knowledge of the transcriptome by generating long reads that simplify assembly and detection of large structural variations. During the sequencing process, the nanopores measure electrical current signals representing the bases (A, C, G, T) moving through each nanopore. All nanopores simultaneously produce signals that can be analyzed in real time and translated into bases by the base calling process. Despite the reduction in sequencing cost and the portability of sequencers, the base call error rate hampers their implementation in biomedical research. The aim of this project is to classify individual mRNA sequences into different groups of isoforms through the elucidation of common motifs in their raw signal. We propose to use the dynamic time warping (DTW) algorithm for sequence alignment combined with nanopore technology to directly bypass the basic calling process. We explored new strategies to demonstrate the impact of different signal segments on signal classification. We performed comparative analyzes to suggest parameters that increase classification performance and guide future analyzes on raw nanopore sequencing data.

Durant le développement préimplantatoire, les défauts de ségrégation des chromosomes conduisent à l'héritage d'un nombre incorrect de chromosomes, connu sous le nom d'aneuploïdie, qui provoque l'infertilité. L’imagerie à intervalle du développement préimplantatoire est introduite pour sélectionner le meilleur embryon et des efforts sont en cours pour utiliser l'imagerie non invasive pour identifier les ovocytes euploïdes en métaphase-II comme prédicteur de la viabilité future de l'embryon. Il est déjà bien établi que les ovocytes de mammifères en métaphase-II subissent des mouvements cytoplasmiques stéréotypés qui peuvent être visualisés par imagerie non invasive à fond clair à intervalle, appelée « flux cytoplasmique ». Ici, nous avons émis l'hypothèse que le flux cytoplasmique pourrait être affecté par le statut de ploïdie de l'ovule et donc être un outil de sélection utile pour sélectionner les ovules euploïdes de manière non invasive. Nous avons développé des conditions pour générer des ovules euploïdes et aneuploïdes à partir du même bassin d'ovocytes sains. Nous avons ensuite utilisé la microscopie d'imagerie en temps réel DIC, permettant de visualiser et de mesurer le flux cytoplasmique sans manipulation de l'ovule. Les mouvements cytoplasmiques ont été liés au statut de ploïdie pour chaque ovule individuel par immunofluorescence. Nos résultats montrent qu'il n'y a pas de différence de flux cytoplasmique entre les ovules euploïdes et aneuploïdes. Nos données démontrent que l'état de la ploïdie n'a pas d'impact sur les mouvements cytoplasmiques, suggérant que l'utilisation d'une imagerie non invasive pour essayer de distinguer l'état de la ploïdie entre des ovocytes autrement sains sera difficile., Chromosome segregation errors during early development lead to inheritance of incorrect number of chromosomes, known as aneuploidy, which causes infertility and birth defects. Time-lapse microscopy of preimplantation development is being widely introduced with the aim of selecting the best embryo and efforts to use non-invasive brightfield imaging to identify euploid oocytes at metaphase-II as a predictor of future embryo viability are underway. It is already well established that mammalian metaphase-II oocytes undergo stereotyped cytoplasmic movements that can be visualised by non-invasive brightfield timelapse imaging, termed “cytoplasmic flow”. Here, we hypothesised that this cytoplasmic flow might be affected by ploidy status of the egg and therefore be a useful selection tool to select euploid eggs non-invasively. To address this, we developed conditions to generate euploid and aneuploid eggs from the same pool of otherwise healthy oocytes. We then used DIC live-imaging microscopy, which allowed us to visualise and measure flow without any manipulation to the egg. Importantly, individual eggs were scored for their ploidy status by immunofluorescence, so that cytoplasmic movements could be related to ploidy on an egg-by-egg basis. Our results show that there is no difference in cytoplasmic flow between euploid and aneuploid eggs. Therefore, our data demonstrates that ploidy status does not impact biologically relevant stereotyped cytoplasmic movements, suggesting that using non-invasive imaging to try to distinguish ploidy status between otherwise healthy oocytes will be challenging.

Il a été établi que la majorité des plantes vasculaires abritent des micro-organismes endophytes bactériens et fongiques, qui peuvent coloniser les tissus végétaux et former des associations allant du mutualisme à la pathogénèse. Les symbioses végétales mutualistes les plus communes impliquent les champignons endo-mycorhiziens arbusculaires (AMF). Ces champignons s’associent aux racines des plantes et leur permettent d’améliorer leur nutrition minérale, tandis qu’ils bénéficient des composés produits par l'hôte. Toutefois, les plantes de la famille Ericaceae s’engagent plutôt dans des associations mutualistes avec les champignons mycorhiziens éricoïdes (ErMF). Ces derniers sont morphologiquement et taxonomiquement mal définis, en apparence distribués aléatoirement parmi les espèces issues des grandes divisions taxonomiques des Ascomycota et Basidiomycota. En raison de cette incohérence taxonomique et de l'absence d'une histoire évolutive explicative, la diversité réelle de ces champignons est mal caractérisée. De ce fait, ce projet vise à étudier le microbiote associé à la plante Ericaceae Vaccinium macrocarpon Aït (canneberge), axant la recherche sur les angles morphologiques, génomiques et transcriptomiques des champignons de type ErMF et autres endophytes capables de contrôler la croissance des agents phytopathogènes et de stimuler la croissance des plantes. Notre première démarche présentée dans le chapitre 2 s’est focalisée sur la caractérisation du microbiote endophyte bactérien et fongique de la canneberge, une plante vivace principalement produite en Amérique du Nord, notamment au Québec. Nous avons isolé et identifié 180 micro-organismes à partir de plantes de cultivars variés, collectées de champs différents, et avons démontré l'existence d'une variabilité dans le microbiote selon les tissus, les cultivars, et même entre les champs d'une même ferme. Parmi les endophytes d’intérêt identifiés, l’isolat fongique Lachnum sp. EC5 a stimulé la croissance des cultivars de canneberge Stevens et Mullica Queen et a formé des structures intracellulaires similaires à celles des ErMF à l’intérieur des cellules racinaires de la canneberge. De plus, l’isolat EB37 identifié Bacillus velezensis s’est révélé être un puissant agent antifongique, montrant cependant une tolérance particulière au champignon Lachnum sp. EC5, lors des tests de confrontation. Ce volet sera détaillé avec plus de précision dans le chapitre 4. Le chapitre 3 a porté sur l’analyse génomique comparative de l’isolat fongique Lachnum sp. EC5 avec plusieurs espèces de champignons Leotiomycetes ErMF, saprophytes et pathogènes. Nous avons analysé le sécrétome protéique prédit de ces champignons et mis en évidence que les gènes codant pour les enzymes de dégradation des parois végétales ne sont pas corrélés au mode de vie fongique (mycorhizien, pathogène ou saprophyte). A l’inverse, 10 protéines effectrices de Lachnum sp. EC5 prédites pour cibler spécifiquement un compartiment intracellulaire chez les cellules végétales ont des similarités avec celles d’espèces mutualistes comme Meliniomyces variabilis et Oidiodendron maius. Aussi, la protéine effectrice putative Zn-MP, prédite pour cibler, potentiellement, les chloroplastes végétaux nous permet de proposer un rôle dans le renforcement de l’immunité végétale. Le chapitre 4 s’est intéressé aux mécanismes de régulation d'expression de gènes induits lors de l’interaction entre le champignon Lachnum sp. EC5 et la bactérie B. velezensis EB37. Ces mécanismes ont été comparés à ceux activés chez la bactérie en présence de champignons pathogènes. Nous avons démontré une physiologique cellulaire bactérienne distincte en présence de Lachnum sp. EC5, dénotée par une faible expression des gènes induits lors du stress nutritif associé aux processus de sporulation, de formation du biofilm, de secretion de CAZymes et de lipopeptides. Nous avons suggéré que la sous-régulation de ces mécanismes serait essentiellement explicable par une disponibilité plus importante en glucose ou en d’autres sources de carbone préférentielles pour la bactérie. En réponse, le champignon Lachnum sp. EC5 a vécu différents changements morphologiques. Il aurait détoxifié ses environnements intra et extra-cellulaires et surexprimé sa voie de production de carbone dépendante du cycle du glyoxylate, générant ainsi des conditions favorisant un contact physique entre les deux micro-organismes. En conclusion, nous avons argumenté et documenté que la définition des ErMF basée uniquement sur des critères morphologiques est mal adaptée à catégoriser ces champignons. Notre approche multidisciplinaire a mis en évidence la diversité du microbiote de la canneberge, a étendu la notion d’ErMF à d'autres champignons jusqu'ici exclus de ce groupe, et a souligné l'importance des associations interspécifiques sur l’interaction ErMF-plantes. Ces avancées permettront d’améliorer nos connaissances sur le microbiote des plantes éricacées contribuant, au développement de solutions environnementales éco-responsables pour l’industrie de la canneberge., It has been established that the majority of vascular plants harbour bacterial and fungal endophytes that colonize plant tissues, and thus form associations that range from mutualism to pathogenesis. Mycorrhizal fungi are a particular class of endophytes that associate with plant roots and enhance plant mineral uptake. The most common type of mutualistic plant symbiosis involves arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), whereas plants of the Ericaceae family instead engage in mutualistic associations with ericoid mycorrhizal fungi (ErMF). The ErMF group, in its current definition, includes both ascomycete and basidiomycete species, yet is morphologically, taxonomically and evolutionarily poorly defined, which implies that the group’s true diversity is not well understood. The objective of this project is to complement morphological information with genomic and transcriptomic data to better understand the role of ErMF in 1) controlling the negative effects of pathogenic infections, and 2) the potential plant growth stimulation for the Ericaceous plant Vaccinium macrocarpon Ait. Our first approach presented in Chapter 2 focused on the characterization of the bacterial and fungal endo-symbiotic microbiota of the Ericaceous plant, Vaccinium macrocarpon Ait (cranberry), a perennial plant mainly in North America, particularly in Quebec. We isolated ~180 distinct bacterial and fungal endophytes collected from roots, stems, and leaves of cranberry plants cultivated in Quebec, Canada. We show that the cranberry microbiome varies substantially between tissues, cultivars, and across fields of the same farm. Among the isolated endophytes, the fungus Lachnum sp. EC5 was found to promote the growth of cranberry cultivars Stevens and Mullica Queen, and to form intracellular structures resembling those other ErMF inside the cortical root cells. In addition, the bacterium Bacillus velezensis (EB37) has been found to be a potent antifungal agent. Interestingly, a confrontation test between EB37 and the fungus Lachnum sp. EC5 revealed a mutual tolerance, which we will describe later in chapter 4. In chapter 3, our project focused on the comparative genomic analysis of the fungus Lachnum sp. EC5 with several Leotiomycete ErMF, saprophytes and pathogens. We analyzed fungal secretomes and demonstrated that genes encoding plant cell wall degradation enzymes are conserved between the tested fungi which suggests that such proteins are not indicative of a particular fungal lifestyle. On the other hand, 10 effector proteins identified in Lachnum sp. EC5 were also only found in mutualistic fungi, such as Meliniomyces variabilis, Oidiodendron maius and have been reported to target the plant intracellular compartments. Also, the identification of the putative effector protein Zn-MP, specific to Lachnum sp. EC5 and predicted to target plant chloroplasts, suggest a role in the reinforcement of plant immunity. Chapter 4 focuses on the patterns of gene expression regulation induced in the biocontrol bacterium B. velezensis EB37 in interaction with the potentially mutualistic fungus Lachnum sp. EC5. These mechanisms were then compared to those activated when the bacterium is in the presence of pathogenic/saprophytic fungi. We demonstrated that in co-culture with Lachnum sp. EC5, EB37expresses fewer genes related to stress, and fewer related to the stationary phase which often involves production of bacterial biofilms and lipopeptides, such as mycosubtilin. We suggest that the lessened response to stress is related to an increased availability of glucose or other preferential sources of carbons for the bacterium. Conversely, Lachnum sp. EC5 in the presence of EB37 underwent morphological changes by a higher lateral branching., detoxified its external and internal environment by expressing both a catalase activity and efflux pumps, and overexpressed its glyoxylate cycle-dependent carbon production pathway, and thus promoting favourable conditions for close physical contact with the bacterium. In conclusion, we demonstrated that the morphological-based definitions are poorly adapted to the categorization of ErMF fungi. Our multidisciplinary approach highlighted the diversity of the cranberry microbiota, extended the notion of ErMF to other fungi hitherto excluded from this fungal group and underlined the importance of interspecific associations on the ErMF-plant interaction. These advances enhance our understanding of the Ericaceous plant microbiota and contributes to the development of sustainable solutions for the cranberry industry.

We are taking advantage of the launch of the latest version (v4.6) of our web-based data mining tool "breast cancer gene-expression miner" (bc-GenExMiner) to take stock of its position within the oncology research landscape and to present an activity report ten years after its establishment (http://bcgenex.ico.unicancer.fr). bc-GenExMiner is an open-access, user-friendly tool for statistical mining on breast tumor transcriptomes, annotated with more than 20 clinicopathologic and molecular characteristics. The database comprises more than 16,000 patients from 64 cohorts - including TCGA, METABRIC and SCAN-B - for whom several thousands of genes have been quantified by microarrays or RNA-seq. Correlation, expression and prognostic analyses are available for targeted, exhaustive or customized explorations of queried genes. bc-GenExMiner facilitates the validation, investigation, and prioritization of discoveries and hypotheses on genes of interest. It allows users to analyse large databases, create data visualizations, and obtain robust statistical analysis, thereby accelerating biomarker discovery. Ten years after its launch, judging by the number of visits, analyses, and scientific citations of bc-GenExMiner, we conclude that this web resource serves its purpose in the international scientific community working in breast cancer research, with a never-ending rise in its use., Nous profitons de l’occasion de la mise en ligne de la dernière version (v.4.6) de l’outil web breast cancer gene-expression miner (bc-GenExMiner) pour rappeler sa place dans le paysage de la recherche en oncologie et réaliser un bilan d’activité, dix ans après sa création (http://bcgenex.ico.unicancer.fr). bc-GenExMiner est un outil web de fouille statistique de données d’expressions géniques issues du criblage du transcriptome de tumeurs du sein annotées par une vingtaine de critères clinicopathologiques et moléculaires. Sa base de données inclut plus de 16 000 patientes issues de 64 cohortes, dont les cohortes METABRIC, SCAN-B et TCGA, pour lesquelles l’expression de plusieurs milliers de gènes a été mesurée par des puces à ADN ou par RNAseq. Il est composé de trois modules : « Corrélation », « Expression » et « Pronostic », qui permettent différentes sortes d’analyses. bc-GenExMiner offre aux chercheurs des possibilités de validation, d’exploration, de hiérarchisation d’hypothèses et de découverte concernant leurs gènes d’intérêt. Il permet de s’autonomiser par rapport à l’analyse de grandes bases de données, la production de figures, d’obtenir des résultats robustes et ainsi de gagner du temps pour la découverte de biomarqueurs. Dix ans après sa mise en ligne, à en juger par le nombre de visites, d’analyses et de citations de bc-GenExMiner dans des articles scientifiques, nous pouvons conclure que cet outil web sert la communauté scientifique internationale engagée dans la recherche sur le cancer du sein, et qu’il est de plus en plus utilisé.

Cerebral malaria (CM) is the most serious form of P. falciparun infection and children under 5 years of age now constitute the population most at risk in endemic areas. The specific adhesion of erythrocytes infected with P. falciparum to endothelial receptors located in the brain is a known mechanism involved in the pathophysiology of CM, but all the parasitic factors have not yet been elucidated. We sought to characterize the gene expression profile of parasites from children with cerebral malaria, compared to children with an uncomplicated form of the disease (UM), in Benin. From a clinical point of view, the CM children included presented a higher parasitaemia and the UM children were older. Based on the total transcriptome, we showed that parasites were younger in CM children suggesting a reduced circulation time of these isolates, as a consequence of greater adhesion to endothelial receptors. We also measured overexpression of var genes, encoding surface antigens, suggesting increased parasite adhesion capacity in CM children. Differences in the host-specific immune response could also modulate parasite adhesion, which we could not demonstrate by antibody assay. The decrease in the circulation time of isolates is an effective mechanism to escape elimination by the spleen and could be the cause of the higher parasitaemia measured in CM. Differential expression analysis showed distinct transcriptomic profiles in CM and UM isolates. Genes involved in adhesion, excluding variant surface antigens, were dysregulated, supporting the idea of increased adhesion capacity of CM parasites. Finally, we found a deregulated expression of genes involved in erythrocyte entry, which may reflect a greater invasive capacity of CM parasites. In parallel, an integrative analysis of the expression of circulating parasite transcripts and sequestered parasite proteins was performed, based on laboratory strains with specific adhesion background phenotypes for receptors involved in CM. We found strong positive correlations between all transcriptomes, meaning that most of the expressed transcripts were strongly shared between samples. Proteomes showed even higher positive correlations, reflecting stronger regulatory mechanisms at the protein level. Finally, we observed a strong correlation of abundance values between transcripts and proteins, which means that the more a transcript is abundant, the more the corresponding protein is expressed. However, some very abundant transcripts were not detected at the protein level, suggesting post-transcriptional or translational regulatory mechanisms. Moreover, some proteins were not identified in transcripts, due to the dynamics of the expression of these transcripts in P. falciparum. These observations could also be the consequence of technical problems specific to high-throughput sequencing or mass spectrometry techniques. In conclusion, the alternate use of targeted multi-omics approaches could significantly improve the validation of transcript and protein levels.; Le paludisme cérébral (CM) est la forme la plus grave de l’infection à P. falciparun et les enfants de moins de 5 ans constituent aujourd’hui la population la plus à risque en zone d’endémie. L’adhésion spécifique des érythrocytes infectés par P. falciparum à des récepteurs endothéliaux situés dans le cerveau est un mécanisme connu impliqué dans la physiopathologie du CM, mais tous les facteurs parasitaires ne sont pas encore élucidés. Nous avons cherché à caractériser le profil d'expression génique de parasites retrouvés chez des enfants atteints de neuropaludisme, en comparaison à des enfants atteints de forme non grave de la maladie (UM), au Bénin. D’un point de vue clinique, les enfants CM inclus présentaient une parasitémie plus élevée et les enfants UM étaient plus âgés. Basé sur le transcriptome total, nous avons montré que les parasites étaient plus jeunes chez les enfants CM suggérant un temps de circulation réduit de ces isolats, en conséquence à une adhérence plus grande aux récepteurs endothéliaux. Nous avons également mesuré une surexpression des gènes var, codant pour des antigènes de surface, suggérant une capacité d’adhérence des parasites accrue chez les enfants CM. Des différences dans la réponse immunitaire spécifique de l’hôte pourrait également moduler l’adhésion des parasites, ce que nous n’avons pas pu démontrer par le dosage des anticorps. La diminution du temps de circulation des isolats est un mécanisme efficace pour échapper à l’élimination par la rate, et pourrait être à l’origine des parasitémies plus élevées mesurées chez les CM. L’analyse différentielle d’expression a montré des profils transcriptomiques distincts chez les isolats CM et UM. Des gènes impliqués dans l'adhésion, à l'exclusion des antigènes variants de surface, étaient dérégulés, soutenant l'idée d'une capacité d’adhérence accrue des parasites CM. Enfin, nous avons trouvé une expression dérégulée des gènes impliqués dans l’entrée dans l’érythrocyte, pouvant être le reflet d’une plus grande capacité d'invasion des parasites CM. Parallèlement, une analyse intégrative de l'expression des transcrits des parasites circulants et des protéines des parasites séquestrés a été effectuée, basée sur des souches de laboratoire avec des phénotypes de fond d’adhérences spécifiques pour des récepteurs impliqués dans le CM. Nous avons trouvé de fortes corrélations positives entre tous les transcriptomes, ce qui signifie que la plupart des transcrits exprimés étaient fortement partagés entre les échantillons. Les protéomes ont montré des corrélations positives encore plus élevées, reflétant des mécanismes de régulation plus forts au niveau des protéines. Enfin, nous avons observé une forte corrélation des valeurs d'abondance entre les transcrits et protéines, ce qui signifie que plus un transcrit est abondant, plus la protéine correspondante est exprimée. Cependant, certains transcrits très abondants n'ont pas été détectés au niveau protéique, suggérant des mécanismes de régulation post-transcriptionnels ou traductionnels. De plus, certaines protéines n’ont pas été identifiées en transcrits, dû à la dynamique de l'expression de ces transcrits chez P. falciparum. Ces observations pourraient aussi être la conséquence de problèmes techniques, spécifiques aux techniques de séquençage à haut débit ou de spectrométrie de masse. En conclusion, l’utilisation alternée d’approches multi-omiques ciblées pourrait permettre d’améliorer de manière significative la validation des niveaux de transcrits et de protéines.

Eubacterium limosum is a strict anaerobic bacterium, belonging to the group of acetogens. It’s interest lies in its ability to transform one carbon (C1) feedstock into butyrate, a C4 molecule, through the oldest metabolic pathway on earth, called the Wood-Ljungdahl Pathway (WLP).Nevertheless, yields and productivities must be improved to reach performances close to chemical processes. For this purpose, metabolic engineering strategies are needed but improving our knowledge on primary metabolism is of paramount importance to reach this goal.The work performed in this thesis project aimed to characterize, by a systems biology approach, the central metabolism of E. limosum B2 growing in chemostat cultures on methanol or on glucose as a carbon source.Following an adaptive laboratory evolution process, the wild strain was cultivated on synthetic methanol medium without yeast extract. The maximum growth rate for the evolved clone was improved by 2.72. In addition, we succeeded in substituting the cysteine of the synthetic medium, described as essential, with sodium thiosulfate. The wild type strain was unable to grow under these conditions, suggesting positive mutations in the evolved clone. The complete genome of the wild strain was first sequenced, de novo, followed by the genomes of the population on several generations and the isolated clone in order to identify and study the dynamics of genetic evolution. No mutation that could explain this change in phenotype was detected in the genes encoding enzymes of the primary metabolism. A proteomic study was carried out on the wild type and the adapted strain to clarify the adaptation mechanisms. Among overexpressed proteins measured in the adapted strain, four proteins involved in central metabolism, including two in the WLP and two in gluconeogenesis, as well as a protein complex linked to sulfur assimilation were identified. In addition, exploration of the methylome revealed a homologous recombination event on the type I restriction-modification system between the two strains. This event by changing the methylome of the evolved clone, could play a key role in the regulatory mechanism on synthetic methanol medium.The adapted strain was grown in chemostat cultures for the characterization of its central metabolism on methanol or glucose as a carbon source. The physiological parameters were4determined as well as all the input and output fluxes. These values were integrated into a in silico genome scale model to estimate the specific fluxes of each enzyme of primary metabolism. From these estimations, energy conversation models were developed for the two conditions studied. The absolute number of protein copies per cell was then determined and these data allowed the estimation of the in vivo turnover rates for each enzyme. This parameter was useful to compare enzyme activities and identify the most limiting ones.For the transcriptomic part, the development of a total mRNA extraction method was a major challenge. We developed a strategy for the absolute quantification of mRNA per cell reinforced by the addition of two mixes of external standards during the extraction process. The first was added after the cell lysis step and the second before ribodepletion. RNA-Seq sequencing showed satisfactory results with a good correlation between the number of reads obtained for each standard and their theoretical concentration, indicating a minimal loss of mRNA during the extraction process. The determination of the absolute mRNA content for each gene is now possible.By combining proteomics and transcriptomics data, the in vivo specific synthesis rate of each protein can be determined. Our work will improve the in silico model of E. limosum and allow the use of a rational metabolic engineering approach.; Eubacterium limosum est une bactérie anaérobie stricte, faisant partie du groupe des acétogènes. Son intérêt réside dans sa capacité à transformer des sources de carbone à un atome de carbone (C1) telle que le méthanol en butyrate, composé en C4 présentant un intérêt industriel. Néanmoins, les rendements et productivité doivent être améliorés pour se rapprocher des performances de l’industrie chimique. L’ingénierie métabolique des souches permettrait d’atteindre cet objectif mais pour cela il est nécessaire d’améliorer nos connaissances du métabolisme central.L’objectif principal de ce projet de thèse était de caractériser le métabolisme central de E. limosum B2 cultivé en chemostat sur méthanol ou sur glucose comme source de carbone, par une approche de biologie des systèmes.Suivant un processus d’adaptation évolutive en laboratoire, la souche sauvage a été adaptée milieu synthétique méthanol sans extrait de levure. Le taux de croissance maximal chez le clone isolé a été amélioré par 2,72. De plus, nous sommes parvenus à substituer la cystéine du milieu synthétique, décrite comme indispensable, par du thiosulfate de sodium. La souche sauvage s’est montrée incapable de croître dans ces conditions, suggérant l’apparition de mutations favorable chez le mutant. Le génome de la souche sauvage a d’abord été séquencé de novo, suivi des génomes de la population sur plusieurs générations et de trois clones isolés pour étudier la dynamique d’évolution génétique. Aucune mutation pouvant expliquer ce changement de phénotype n’a a été détectée dans le métabolisme central. Une étude protéomique a été réalisée sur la souche sauvage et adaptée afin d’éclaircir les mécanismes d’adaptations. Parmi les protéines surproduites chez la souche adaptée, deux dans le WLP et deux en gluconéogenèse, ainsi qu’un complexe lié à l’assimilation du soufre ont été identifiés. De plus, l’exploration du méthylome a révélé un évènement de recombinaison homologue au niveau du système de restriction-modification de type I entre les deux souches. Cette modification pourrait jouer un rôle clé dans le mécanisme de régulation sur milieu minéral méthanol.La souche adaptée a été cultivée en chémostat pour la caractérisation de son métabolisme central sur méthanol ou sur glucose comme seule source de carbone. Les paramètres physiologiques ont été déterminés et les flux d’entrée et de production ont été calculés. Ces valeurs ont été intégrées dans un modèle in silico à l’échelle du génome pour estimer les flux spécifiques de chaque enzyme du métabolisme primaire. De ces estimations, des modèles de conversation de l’énergie ont été élaborés pour les deux conditions étudiées. Le nombre absolu de copies de protéines par cellule a ensuite été déterminé puis ces données ont permis d’estimer la constante catalytique in vivo de chaque enzyme du métabolisme central. Ce paramètre nous a été utile pour comparer les activités des enzymes et identifier les plus limitantes.Pour la partie transcriptomique, le développement d’une méthode d’extraction totale des ARNm a été un défi majeur. Nous avons élaboré une stratégie de quantification absolue des ARNm par cellule renforcée par l’ajout de deux mélanges de standards externes lors du procédé d’extraction des ARNm. Le premier a été ajouté après l’étape de lyse cellulaire et le second avant la ribodéplétion. Les résultats de séquençage par RNA-Seq ont été satisfaisant, avec une bonne corrélation entre le nombre de « reads » obtenus pour chaque standard et leur concentration théorique, indiquant une perte minimale en ARNm durant le processus d’extraction. La détermination de la quantité absolue de chaque transcrits est désormais possible.En combinant les données de protéomique et de transcriptomique, la vitesse spécifique de traduction in vivo de chaque protéine pourra être déterminée. Nos travaux permettront d’améliorer le modèle in silico d'E. limosum et permettre l’utilisation d’une approche rationnelle d’ingénierie métabolique.

Cette étude pilote vise à développer une méthode d'analyse intégrative qui permet d'augmenter le taux de réussite du diagnostic clinique des mutations génétiques rares. De plus, l'identification de nouveaux gènes associés à l'ataxie épisodique (EA) et l'évaluation de nouveaux algorithmes de prédiction, pour un examen de variants plus robuste, découleront de l'enquête. Caractérisé par une perte sporadique de la coordination des mouvements volontaires, l'EA se manifeste généralement tardivement, avec une hétérogénéité clinique et génétique élevée, compliquant largement l’obtention d’un diagnostic précis. Alors que quatre gènes ont été liés aux huit sous-types d'EA, de nombreux patients demeurent sans diagnostic moléculaire dû aux limites des méthodes de séquençage d’ADN. Ces lacunes accentuent l’intérêt d’implanter le séquençage de l’ARN en milieu clinique, afin d’obtenir l’information fonctionnelle offerte par l’approche. Des patients atteints d’EA, sans diagnostic moléculaire malgré un examen approfondi, ont été recrutés à Montréal. Le séquençage du génome entier (WGS) et de l'ARN a été effectué sur des échantillons de sang pour identifier les variants nucléotidiques, l'expression différentielle, les événements d'épissage ainsi que les expansions de microsatellites. Plusieurs algorithmes de prédiction de la pathogénicité récents ont été choisis pour être testés parallèlement aux algorithmes standard. Des données WGS provenant d’un trio familial atteint de pathologies neurologiques ont également été soumises au pipeline génomique développé pour la cohorte EA. Des variants candidats ont été identifiés pour chaque patient en fonction des scores de pathogénicité, de la rareté des événements génétiques et des informations fonctionnelles et cliniques connues pour un gène altéré donné. Parmi les découvertes figurent des mutations non-sens, des faux-sens, de l'épissage alternatif ainsi que des expansions nucléotidiques dans des gènes associés aux ataxies spinocérébelleuses ou aux paraplégies spastiques. En plus d'être présents dans les ensembles de données de séquençage disponibles pour chaque patient, les événements génomiques ont été vérifiés par séquençage Sanger de l'ADN et de l'ARN lorsque possible. Les effets fonctionnels potentiels, prédits principalement à partir du RNA-seq et suggérant une expression anormale de l'ARNm, ont également été évalués par amplification PCR et qPCR traditionnelle. À ce jour, quatre des dix patients ont reçu ou sont en voie de recevoir un diagnostic clinique, et quatre autres présentent d’excellents candidats moléculaires pour expliquer une pathologie ataxique. Ce projet devrait permettre un diagnostic mieux défini, conduisant à une meilleure qualité de vie, une meilleure évaluation du pronostic et une meilleure prise en charge des patients. L’identification de modulateurs génétiques chez certains d’entre eux devrait également permettre une meilleure caractérisation clinique des conditions rapportées, bénéficiant les évaluations symptomatiques futures. De plus, la méta-analyse des données RNA-seq offre le potentiel de découvrir des régulateurs de pathogenèse communs à l’EA. Il favorisera également l'approche intégrative pour un plus large éventail de troubles et pourrait éventuellement conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques., This pilot study aims to develop an integrative analysis method that allows for an increased diagnosis success rate of rare genetic mutations. Moreover, identification of novel genes associated with Episodic Ataxia (EA) and evaluation of new AI-generated prediction algorithms, for a more robust variant examination, will ensue from the investigation. Characterized by sporadic loss of voluntary movement coordination, EA typically manifest with a late onset as well as high-clinical and genetic heterogeneity, setting additional hurdles to diagnosis. While four genes have been linked to the eight subtypes of EA, many patients are left without molecular diagnosis due to the limitations of individual DNA-sequencing methods, which can be mitigated by the functional overview that RNA sequencing (RNA-seq) offers. EA patients, lacking molecular diagnosis despite in-depth examination, were recruited in Montreal. Whole-Genome sequencing (WGS) and RNA-seq were performed on blood samples to identify single nucleotide variants, differential expression, splicing events, structural variants and repeat expansions. Multiple recent pathogenicity prediction algorithms were chosen for testing concurrently to standard ones, in order to evaluate their performance and potential for clinical pipelines integration. WGS data of a family trio from France, in which the father and the daughter present neurologic pathologies, were also processed through the genomic pipeline that was developed for the EA cohort in order to identify the cause of their disorder. Candidate variants were identified for each patient according to pathogenicity scores, rarity of genetic events, and known functional as well as clinical information for a given altered gene. Among the findings are truncations, missenses, alternative splicing, and repeat expansions in genes already associated to either spinocerebellar ataxia or spastic paraplegia. In addition to being present in both datasets when available, validation of these interesting genomic events has been performed through Sanger Sequencing of both DNA and RNA when feasible. For strong candidates where the available functional information from RNA-seq suggests abnormal mRNA expression, validation includes PCR amplification as well as a traditional qPCR to support effects on transcripts. To this day, four out of ten patients have received or are on the verge of receiving a diagnosis, and four others are carrying excellent molecular candidates requiring further validation to explain their ataxic pathologies. This project should provide more defined diagnosis, leading to better quality of life, better evaluation of prognosis and better management of care for patients. Identification of genetic modifier in some of them should also allow for a better clinical characterization of the reported conditions, benefiting future patient examinations. A meta-analysis of our patients’ transcriptomic profiles could also uncover commonly affected pathways in EA development. It will also promote the integrative approach for a larger spectrum of disorders and might eventually lead to new therapeutic strategies.

Le syndrome de Tatton-Brown-Rahman (TBRS) est une maladie génétique rare caractérisée par une taille plus grande que la normale, une déficience intellectuelle et des traits faciaux dysmorphiques. Ce trouble est associé à une mutation fonctionnelle de DNMT3A, une enzyme responsable de l’établissement de modifications de la méthylation de l’ADN impliquée dans la régulation des gènes et indispensable au développement. Actuellement, nous ne savons pas comment les mutations fonctionnelles de la protéine DNMT3A peuvent être à l'origine d’altération lors du développement neurologique et d'autres problèmes observés chez les patients atteints de TBRS. Ainsi, il existe un besoin urgent de développer des modèles chez l’humain pour comprendre les causes moléculaires et cellulaires du TBRS et pour trouver des traitements potentiels et spécifiques pour les patients. Par conséquent, nous proposons d'utiliser des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), une technologie qui permet de convertir les cellules d'un patient en cellules souches, que nous avons reprogrammées en progéniteurs neuronaux (NPC). Grâce à cette approche, nous avons pu effectuer une série d’analyses bio-informatiques, nous permettant de déterminer comment les cellules neuronales sont affectées. Le séquençage des profils de méthylation et de transcription des cellules iPSC et NPC nous a permis de démontrer que les mutations étudiées dans le domaine Mtase du gène DNMT3A induisent des changements de méthylation et d’expression significatifs dans les cellules mutées, et ce pour les deux types cellulaires (iPSC et NPC). L’annotation des régions et des transcrits différentiellement méthylés et exprimés a permis d’associer ces derniers à des gènes et des enrichissements biologiques liés au développement ainsi qu’au neurodéveloppement démontrant ainsi une perturbation de ces processus. Dans l'ensemble, ce projet permettra de découvrir l’impact des mutations dans le gène DNMT3A et fournira un modèle fonctionnel permettant de tester de nouvelles avenues thérapeutiques pour traiter le TBRS., Tatton-Brown-Rahman syndrome (TBRS) is a rare genetic disorder characterized by larger than normal height, intellectual disability, and dysmorphic facial features. This disorder is associated with a functional mutation in DNMT3A, an enzyme responsible for establishing DNA methylation changes involved in gene regulation and essential for development. Currently, we do not know how functional mutations in the DNMT3A protein may cause neurodevelopmental impairment and other problems seen in patients with TBRS. Thus, there is an urgent need to develop models in humans to understand the molecular and cellular causes of TBRS and to find potential and specific treatments for patients. Therefore, we propose to use induced pluripotent stem cells (iPSC), a technology that converts a patient's cells into stem cells, which we reprogrammed into neuronal progenitors (NPCs). Using this approach, we were able to perform a series of bioinformatics analyzes allowing us to determine how neuronal cells are affected. The sequencing of the methylation and transcription profiles of iPSC and NPC cells allowed us to demonstrate that the mutations studied in the Mtase domain of the DNMT3A gene induce significant methylation and expression changes in the mutated cells, for both cell types (iPSC and NPC). Annotation of the differentially methylated and expressed regions and transcripts allowed them to be associated with genes and biological enrichments related to development as well as neurodevelopment, demonstrating a disruption of these processes. Overall, this project will uncover the impact of mutations in the DNMT3A gene and provide a functional model for testing new therapeutic avenues for treating TBRS.

International audience; Le virus de la diarrhée virale bovine 1 ( BVDV-1 ), appartenant au pestivirusgenre, est caractérisé par la présence de deux biotypes, cytopathogène (cp) ou non cytopathogène (ncp). Pour une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogène, nous avons cherché à identifier des signatures transcriptomiques de cellules primaires pulmonaires bovines (BPC) infectées par une souche cp ou ncp. Pour cela, nous avons utilisé à la fois une approche ciblée par PCR numérique par gouttelettes de transcription inverse et une approche du génome entier utilisant RNAseq. L'analyse des données a montré 3571 transcrits exprimés de manière différentielle au fil du temps (Fold Change > 2) et a révélé que les voies les plus dérégulées pour la souche cp sont les voies de signalisation impliquées dans les réponses à l'infection virale telles que les voies de réponse inflammatoire ou d'apoptose. Fait intéressant, notre analyse des données a révélé une dérégulation de la voie de signalisation Wnt, une voie décrite dans l'embryogenèse

Schistosoma mansoni is a parasite responsible for bilharzia. This neglected tropical disease has also been prevalent in Corsica since 2013. The life cycle of the parasite is divided between a mammalian host where it does it sexual reproduction and a freshwater snail host where it does clonal multiplication. Cercariae is the parasite form that infests the mammal. The cercariae shedding follows a 24-hour rhythm based on the water activity peak of the mammalian host. In order to enhance the understanding of schistosome transmission to the mammalian host, the work of this thesis focuses on the cercariae shedding rhythm of the diurnal and nocturnal chronotypes of Schistosoma mansoni. This study is transversal by studying the phenomenon of cercariae shedding rhythm from the phenotype (chronobiology, histology) to the genes involved (genetics, epigenetics and transcriptomics). Chronobiology approaches revealed that the cercariae shedding rhythm adapts to photoperiod inversion and disappears in the absence of day/night alternation (continuous light or darkness) without however ruling on the endogenous or exogenous nature of this rhythm. The histological approach revealed that, in the absence of day/night alternation, there is an accumulation of mature cercariae waiting inside the sporocysts and an arrest of cercariogenesis thus highlighting the sporocyst as another actor in the phenotype of the cercarial emission rhythm. At the molecular level, the combination of genetic (linkage mapping), epigenetic (ChIPmentation) and transcriptomic (RNA-seq) approaches showed that no canonical clock gene is involved. However, all three approaches identified genes involved in the phototransduction mechanism with rhodopsin as the photoreceptor., Schistosoma mansoni est un parasite responsable de la bilharziose. Cette maladie tropicale négligée sévit aussi en Corse depuis 2013. Le cycle de vie du parasite est divisé entre un hôte mammifère où il fait sa reproduction sexuée et un hôte mollusque d'eau douce où il fait une multiplication clonale. La forme du parasite qui infeste le mammifère est la cercaire. L'émission de ces cercaires suit un rythme de 24h dont le pic est calqué sur le pic d'activité aquatique de l'hôte mammifère. Afin de mieux comprendre la transmission des schistosomes vers l'hôte mammifère, les travaux de cette thèse s'intéressent au rythme d'émission des cercaires des chronotypes diurne et nocturne de Schistosoma mansoni. Cette étude est transversale en étudiant le phénomène de rythme des cercaires du phénotype (chronobiologie, histologie) jusqu'aux gènes impliqués (génétique, épigénétique et transcriptomique). Les approches de chronobiologie ont révélé que le rythme d'émission des cercaires s'adapte à l'inversion de photopériode et disparaît en l'absence d'alternance jour/nuit (lumière ou obscurité continue) sans pour autant statuer sur la nature endogène ou exogène de ce rythme. L'approche histologique a dévoilé que, en absence d'alternance jour/nuit, il y a une accumulation de cercaires matures en attente à l'intérieur des sporocystes et un arrêt de la cercariogenèse mettant ainsi en lumière le sporocyste comme autre acteur dans le phénotype du rythme d'émission des cercaires. Au niveau moléculaire, l'association des approches génétique (linkage mapping), épigénétique (ChIPmentation) et transcriptomique (RNA-seq) a montré qu'aucun gène canonique de l'horloge (clock) n'est impliqué. Toutefois les trois approches ont identifié des gènes impliqués dans le mécanisme de phototransduction, avec la rhodopsine comme photorécepteur.

A more sustainable use of plant protection products (PPPs) is promoted by European Union governments. Indeed, each country is encouraging the development of complements and alternatives to chemical PPPs in order to reduce their use. From this initiative, PPPs from natural sources are promoted, namely biocontrol products (BPs). These new BPs are complex mixtures or microbial strains that are difficult to monitor in complex environmental matrices. Besides, they present modes of action that are not fully understood. More knowledge is therefore needed to better use and regulate these BPs. Thus, this thesis focuses on (1): the investigation of BPs fate on treated plants through a kinetics study monitoring their residues and (2): the plant response to the treatment; in order to better understand the mechanisms involved in BPs efficacy and how they interact with the plant and the environment. Firstly, a new tool was developed in order to study residues fate. It is based on an innovative approach (Environmental Metabolic Footprinting, EMF) that was optimized during the thesis in order (1): to be adapted to fruit matrix (peach peels) and (2): to target only the xenometabolome (residues fate). Secondly, plant response to two BPs treatments at transcripts and metabolites levels was evaluated. RNA sequencing gave data about the different genes expression following treatments with BPs compared to the untreated controls. These data were completed with metabolic analysis (phytohormones, phenols, and organic acids). Strong hints were found on grapevine defense induction by the treatments, but further investigations are necessary in order to confirm these first results., Une utilisation plus durable des produits phytosanitaires (PPPs) est plébiscitée par les gouvernements de l'Union Européenne (UE). Chaque pays de l'UE encourage le développement d'alternatives pour réduire l'utilisation des PPPs chimiques, comme les produits de biocontrôle (BPs) qui sont des PPPs d'origine naturelle. Ces BPs sont des mélanges complexes difficiles à détecter et à suivre dans les matrices environnementales, de plus ils présentent des modes d'action qui ne sont pas entièrement décrits. Ainsi, de plus amples connaissances sont nécessaires pour mieux utiliser et réguler ces BPs. C’est pourquoi cette thèse porte sur la caractérisation de l'effet des BPs sur les plantes traitées. Pour cela, le devenir des résidus de BPs et la réponse des plantes au traitement sont étudiés. Tout d'abord, pour étudier le devenir des résidus, un nouvel outil a été mis au point ; il est basé sur une approche innovante (Environmental Metabolic Footprinting, EMF) qui a été optimisée au cours de la thèse pour être adaptée à la matrice fruits (peaux de pêches) et pour cibler les résidus. Deuxièmement, la réponse des plantes aux traitements BPs à l’échelle des transcrits et des métabolites a donné un aperçu des modes d'action potentiels des BPs étudiés. Le séquençage de l'ARN a fourni des informations sur l’expression différentielle des gènes après traitement avec les BPs par rapport aux contrôles non traités. Ces informations ont été complétées par une analyse métabolique (hormones de défenses, phénols et acides organiques). De solides indices ont été trouvés en faveur de l’hypothèse d’une stimulation des défenses de la vigne après les traitements.

Common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.), a particularly troublesome and allergenic weed, is mainly controlled in agricultural fields using ALS inhibitor herbicides. Recent cases of herbicide resistance have been reported in France and are jeopardising the efficacy of this mode of action. Both target site resistance (TSR, structural mutation in ALS gene) and non target site resistance (NTSR, regulatory and/or structural mutations in secondary metabolism) are involved. The fundamental aim of this work was to identify the genetic determinisms of resistance to ALS inhibitors that have evolved in common ragweed populations in France. As an applied objective, this work also aimed to prepare the development of a high- throughput molecular diagnostic tool that would ensure a rapid detection of resistance. We first assessed the situation of common ragweed resistance in France and identified the mechanisms involved and their modalities of evolution. Using herbicide sensitivity bioassays coupled with ALS gene sequencing, we showed that ragweed resistance to two active substances, imazamox and tribenuron, is emerging in France and is mainly due to NTSR mechanisms. The observed resistance patterns suggest that a diversity of NTSR mechanisms are evolving in France. Furthermore, we demonstrated that TSR evolved locally, through multiple and independent appearance of mutations in the ALS gene. Thanks to the innovative application of high- throughput sequencing for the diagnosis of TSR on a national scale, we identified several foci of TSR emergence, as well as an unsuspected diversity of mutations in the ALS gene. We then studied the genetic determinisms of NTSR. A transcriptomic approach (RNASeq) associated with an analysis of nucleotide polymorphisms was conducted, based on the hypothesis that genes and/or markers of NTSR differed by their expression level and/or by sequence polymorphisms between plants resistant or sensitive to ALS inhibitors. For the first time, this approach was conducted directly on field plant material, i.e. six populations with distinct geographical origins and/or resistance profiles. Constitutive expression differences between resistant and sensitive plants were identified, especially in genes from families known to be involved in herbicide metabolism (cytochromes P450, transferase enzymes, transporters, etc.), but also in genes that may be involved in regulatory cascades activated by the herbicide. Validation of their relative expression levels and their ability to predict NTSR was performed on a massive sampling of plants. Taken together, the results indicate that a very high diversity of mechanisms is involved in RNLC within and between populations, highlighting the highly polygenic nature of RNLC in ragweed. In addition, assessment of the early response of plants to herbicide application showed that genes involved in secondary plant metabolism are specifically induced by treatment in resistant plants from different populations. Finally, sequence variants potentially correlated with NTSR were identified. Their validity as resistance markers remains to be confirmed. The diversity of resistance mechanisms identified within each population renders the development of a molecular diagnosis tool complex. On the other hand, it opens exciting perspectives for the study of the evolutionary dynamics of the adaptation of an invasive species subjected to a particularly intense anthropogenic selection pressure., L’ambroisie à feuilles d’armoise (Ambrosia artemisiifolia L.) est une adventice nuisible et allergisante, principalement contrôlée en milieu agricole par des herbicides de la famille des inhibiteurs de l’acétolactate synthase (ALS). L’efficacité de cette gestion chimique a récemment été confrontée à l’apparition de cas de résistance impliquant les deux grandes catégories de mécanismes : la résistance liée à la cible (RLC, mutations structurales dans le gène de l’ALS) et la résistance non liée à la cible (RNLC, mutation régulatrices et/ou structurales du métabolisme secondaire). L’objectif fondamental de ce travail était d’identifier des déterminismes génétiques de la résistance aux inhibiteurs de l’ALS ayant évolué chez l’ambroisie en France. D’un point de vue appliqué, ce travail visait également à préparer le développement d’un outil de diagnostic moléculaire « à haut débit » destiné à assurer un diagnostic rapide de la résistance. Dans une première partie, nous avons évalué la situation de la résistance de l’ambroisie en France, caractérisé les mécanismes en cause et leurs modalités d’évolution. À l’aide de tests biologiques couplés au séquençage du gène de l’ALS, nous avons montré que la résistance de l’ambroisie à deux substances actives, l’imazamox et le tribénuron, est émergente en France, et principalement due à des mécanismes de RNLC. Les profils de résistance observés suggèrent qu’il existe une diversité de mécanismes de RNLC. Concernant la RLC, nous avons montré qu’elle évolue localement, par l’apparition multiple et indépendante d’allèles mutants de l’ALS. L’application innovante du séquençage à haut débit pour le diagnostic de la RLC à l’échelle nationale a permis d’identifier plusieurs foyers émergents de RLC, ainsi qu’une diversité insoupçonnée de mutations dans le gène de l’ALS. Dans une seconde partie, nous nous sommes concentrés sur la recherche de déterminismes génétiques de la RNLC. Une approche transcriptomique (RNASeq) associée à la recherche de polymorphismes nucléotidiques a été conduite, sur l’hypothèse que des gènes et/ou des marqueurs de la RNLC peuvent être identifiés sur la base de leur niveau d’expression et/ou de polymorphismes de séquence caractéristiques des plantes résistantes aux inhibiteurs de l’ALS. Pour la première fois, cette approche a été conduite directement sur du matériel végétal du champ, à savoir : six populations possédant des origines géographiques et/ou des profils de résistance distincts. Des différences d’expression constitutives entre plantes résistantes et sensibles ont été identifiées. Elles concernaient notamment des familles de gènes dont l’implication dans la métabolisation des herbicides est connue (cytochromes à P450, enzymes à activité transférase, transporteurs…), ainsi que des gènes pouvant intervenir dans des cascades de régulation activées par l’herbicide. La validation du niveau d’expression relatif et de la capacité des candidats à prédire la RNLC a été effectuée à partir d’un échantillonnage massif de plantes. L’ensemble des résultats indique qu’une très grande diversité de mécanismes est impliquée dans la RNLC au sein et entre chacune des populations, soulignant le caractère hautement polygénique de la RNLC chez l’ambroisie. En outre, l’analyse de la réponse précoce des plantes au traitement a montré que des gènes impliqués dans le métabolisme secondaire des plantes sont spécifiquement induits par le traitement chez les plantes résistantes des différentes populations. Enfin, des polymorphismes potentiellement corrélés à la RNLC ont été identifié. Leur validité en tant que marqueurs de résistance reste à vérifier. La diversité des mécanismes identifiés au sein de chacune des populations rend le développement d’un outil de diagnostic moléculaire complexe, mais ouvre des perspectives passionnantes quant à l’étude de la dynamique évolutive de l’adaptation d’une espèce envahissante soumise à une pression de sélection anthropique particulièrement intense.

It has been suggested the composition of the ionome (i.e. macro, micro and beneficial elements) of plant tissues resulting from multiple interactions between nutrients and affected more globally by plant environment, can reveal the physiological status of plants. The aims of this study were to highlight the ionomic modification, potential interactions between elements and ionomic signatures resulting from different mineral deficiencies in Brassica napus (a dicot) and Triticum aestivum (a monocot). Thus, plants were subjected to 18 individual element deficiencies (N, Mg, P, S, K, Ca, B, Cl, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Mo, Na, Si, Co, and Se) and harvested before growth reduction. The main objectives were i) to analyze the ionomic signatures of plant tissues and to compare the response of both species to different mineral deficiencies, ii) to identify some potential metabolic pathways, iii) to characterize in Brassica napus, the molecular responses (transcriptomic and metabolomics) to each macronutrient deficiency, focusing to the roots, the first tissue facing the macronutrient deficiencies.In both species, the main results revealed numerous elemental interactions, some being already described in the literature, such as a strong increase of Mo and Se uptake under S deprivation, a strong increase of Na uptake under K deficiency or of divalent cations under Fe deprivation. These ionomic modifications could be the consequence of the up-regulation of non-specific root transporters, thus increasing the uptake of other elements available in nutrient solutions. Our study also identified original interactions, such as the increase of vanadium uptake in S-deficient plants, probably resulting from an overexpression of root sulfate transporters, confirmed in particular by the ionomic analysis of Arabidopsis knockout lines Sultr1;1 and Sultr1;2. Another original, but negative interaction between N and Na has been shown and suggests that Na transport could be functionally linked to N uptake. This hypothesis was supported by ionomic analysis of Arabidopsis knockout lines for genes encoding nitrate transporters (nrt1.1 and nrt2.1). These interactions between elements led to the identification of potentially specific ionomic signatures of each deficiency, that were then compared between Brassica napus and Triticum aestivum. Finally, in macronutrient-deficient rapeseed roots, specific and common molecular processes were identified using broad transcriptomic and metabolomic approaches. We were then able to identify a set of differentially expressed genes and metabolomic profiles that were specific to each macronutrient deficiency, which could be used for early diagnosis of each nutritional deficiency., La composition du ionome (i.e. macro, micro et éléments bénéfiques) des tissus végétaux résultant de multiples interactions entre éléments mais plus globalement avec l’environnement, est à même de révéler l'état physiologique des plantes. Cette étude vise à mettre en évidence les modifications ionomiques, les interactions potentielles entre éléments et les signatures ionomiques résultant de différentes carences minérales chez Brassica napus (une dicotylédone) et Triticum aestivum (une monocotylédone). Ainsi, les plantes ont été soumises à 18 carences nutritionnelles individuelles (N, Mg, P, S, K, Ca, B, Cl, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Mo, Na, Si, Co et Se) et récoltées avant la réduction de leur croissance. Les principaux objectifs étaient i) d'analyser les signatures ionomiques des tissus végétaux et de comparer la réponse des deux espèces aux différentes carences minérales, ii) d'identifier certaines voies métaboliques sous-jacentes et enfin iii) de caractériser chez Brassica napus, les réponses moléculaires (transcriptomiques et métabolomiques) à chaque carence en macroéléments en se focalisant au niveau des racines, le premier organe exposé à l’absence de disponibilité en macroéléments.Chez ces deux espèces, les principaux résultats ont révélé des interactions élémentaires dont certaines sont décrites dans la littérature, telles qu'une forte augmentation de l'absorption du Mo et du Se lors d'une carence en S, une absorption accrue de Na lors d’une privation en K ou des cations divalents en cas de carence en Fe. Ces modifications ionomiques pourraient être la conséquence de la surexpression de transporteurs racinaires non spécifiques, augmentant ainsi l'absorption d'autres éléments disponibles dans les solutions nutritives. Notre étude a également montré d’autres interactions plus originales et notamment l’augmentation de l'absorption du vanadium chez les plantes soumises à une carence en S, résultant probablement d'une surexpression des transporteurs racinaires de sulfate, confirmée notamment par l'analyse ionomique de lignées d'Arabidopsis knock-out sultr1;1 et sultr1;2. Une autre interaction originale, mais négative, entre N et Na a été démontrée suggérant que le transport de Na pourrait être fonctionnellement lié à l'absorption de N. Cette hypothèse a été soutenue par l’analyse ionomique des lignées d'Arabidopsis knock-out pour les gènes codant les transporteurs de nitrate (nrt1.1 et nrt2.1). Ces interactions entre éléments ont conduit à l’identification des signatures ionomiques potentiellement spécifiques de chaque carence, qui ont été comparées entre les deux espèces végétales considérées. Enfin, dans les racines de colzas carencés en macroéléments, des processus moléculaires spécifiques et communs ont été identifiés en utilisant des approches transcriptomiques et métabolomiques. Ces approches ont également permis d’établir des listes de gènes différentiellement exprimés et des profils métabolomiques spécifiques de chaque privation en macroéléments, susceptibles d’être utilisés afin de diagnostiquer précocement chaque carence nutritionnelle.

International audience; Dansla recherche de ces dernières annéesdans alimentset les sciences de la nutrition sont passées des méthodes analytiques classiques à des approches omiques très sophistiquées qui créent une quantité impressionnante de données. Les dernières ne peuvent être analysées qu'à l'aide d'outils bioinformatiques. Les travaux publiés jusqu'à présent ont montré la puissance des technologies omiquesdansLe domaine defoodomique. La plupart des études menées jusqu'à présent ont utilisé une ou deux approches telles que la transcriptomique et la métabolomique, et un défi majeur consiste à intégrer et à connecter des ensembles de données de différents niveaux d'expression tels que gène, transcrit, protéine et métabolite. Cependant, des développements restent à faire pour transférer cette approche utilisée principalementdanslaboratoires de recherche au monde industriel. La plupart des techniques utiliséesdans foodomiqueles approches sont complexes, coûteuses et nécessitent des personnes hautement qualifiées pour obtenir des données solides. Des équipes qui travaillentdansce domaine doit être composé de personnes ayant des compétences complémentairesdanschimie, analyse, statistiques, biologie et bioinformatique. Les gouvernements de différents pays ont développé de grands centres « omiques », utilisant parfois des coentreprises avec des industries privées. D'autres entreprises privées ont investi de l'argent et fournissent des services aux laboratoires du secteur public. Des initiatives de partage de bases de données et d'outils bioinformatiques ont également été proposées. Par conséquent, une façon d'innoverdansce domaine passerait par des collaborations plus étroites entre le monde académique etindustrie

Introduction - Spondyloarthritis (SpA) is a frequent chronic inflammatory disease. Both in human and in HLA-B27/human β2-microglobulin transgenic rat model (B27-rat), SpA development is associated with the activation of interleukin (IL)-23/IL-17 axis, including a biased differentiation of naive CD4+ T cells into T helper-17 (Th17), favored by dendritic cells (DC). We aimed to decipher the transcriptomic and epigenomic mechanisms leading to altered naive CD4+ T cells differentiation in B27-rat.Results - We first demonstrated that both DC and naive CD4+ T cells from B27-rats contributed additively to a Th17 proinflammatory profile of CD4+ T cells, even before rat-SpA. This was supported by a Th1/Th17 imbalance at the transcriptomic level, that was reflected at the epigenomic level. STAT1 and STAT3 appeared as upstream transcription factors regulating this biased programing of naive CD4+ T cells. At the protein level, STAT1 deficiency appeared as an early and persistent characteristic of B27-rat naive CD4+ T cells, even before disease onset, whereas STAT3 protein increased upon rat-SpA development. In vitro, IL-17A expression by B27-rats naive CD4+ T cells was reversed by a selective STAT1 transcriptional activator, IFNγ, or IL-27, which effects were related to STAT1/STAT3-related genes rebalancing. Moreover, Stat1 mRNA expression was decreased in naive CD4+ T cells from SpA patients as compared to healthy controls and rheumatoid arthritis patients. The propensity of CD4+ T cells from SpA patients to produce increased level of IL-17A was dampened by IL-27 in vitro. In vivo, in B27-rat, IL-27 reduced arthritis and colitis severity, in relation with a decrease in Th17 effector T cells.Conclusion - Naive CD4+ T cells from B27-rats harbor an intrinsic bias favoring to Th17 differentiation, imprinted at the epigenomic level, preceding disease onset, and related to a precocious STAT1 defect. Induction of STAT1 signaling reversed Th17 differentiation bias in vitro and in vivo. Next perspectives are to decipher the mechanisms linking HLA-B27 to STAT1 defect and to develop IL-27 as a new therapeutic target in SpA., Introduction - La spondyloarthrite (SpA) est une maladie inflammatoire chronique fréquente. Chez l'homme et dans le modèle du rat transgénique pour le HLA-B27 et la β2-microglobuline humaine (rat-B27, SpA-rat), le développement de la SpA est associé à l'activation de l'axe interleukine (IL)-23/IL-17, impliquant notamment un biais de différenciation des lymphocyte T CD4+ naïfs en T helper 17 (Th17), favorisé par les cellules dendritiques (DC). Nous avons cherché à comprendre les mécanismes moléculaires conduisant à ce biais de différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs chez le rat-B27.Résultats - Nous avons d'abord démontré que les DC et les lymphocytes T CD4+ naïfs de rats-B27 contribuaient de façon additive la survenue d'un profil pro-inflammatoire Th17 des lymphocytes T CD4+, même avant le début de la SpA-rat. Ceci était lié à un déséquilibre de la balance Th1/Th17 au plan transcriptomique, par ailleurs imprimé au plan épigénomique. STAT1 et STAT3 sont apparus comme des facteurs de transcription clés possiblement responsables de la programmation biaisée des lymphocytes T CD4+ naïfs. Au niveau protéique, un déficit en STAT1 était une caractéristique précoce et persistante des lymphocytes T CD4+ naïfs du rat-B27, précédant l'apparition de la maladie, alors que STAT3 n'augmentait qu'après l'apparition de la SpA-rat. In vitro, l'expression de l'IL-17A par les lymphocytes T CD4+ naïfs des rats-B27 était inhibée par un activateur transcriptionnel sélectif de STAT1, l'IFNγ, et également par l'IL-27 dont les effets étaient liés au rééquilibrage de la balance d'expression entre des gènes dépendants de STAT1 ou de STAT3, en faveur du premier. De plus, l'expression de l'ARNm de Stat1 était diminuée dans les lymphocytes T CD4+ naïfs des patients atteints de SpA, comparativement à des témoins sains ou atteints de polyarthrite rhumatoïde. La propension des lymphocytes T CD4+ des patients atteints de SpA à produire un niveau accru d'IL-17A était réduite par l'IL-27 in vitro. In vivo, chez le rat-B27, l'IL-27 réduisait la sévérité de l'arthrite et de la colite, en lien avec la diminution de cellules T effectrices au profil Th17.Conclusion - Les lymphocytes T CD4+ naïfs de rats-B27 présentent un biais intrinsèque favorisant leur différenciation en Th17, imprimé au niveau épigénomique, précédant l'apparition de la maladie et lié à un défaut précoce de la voie STAT1. L'induction de la signalisation STAT1 inhibe le biais de différenciation Th17 in vitro et in vivo. En perspective, nous tâcherons de préciser les mécanismes liant l'expression du HLA-B27 au défaut de STAT1 et de développer l'IL-27 comme une nouvelle cible thérapeutique pour la SpA.

Seed quality acquisition is an environmental moduled process that is finely controlled by the expression of many interconnected molecular and metabolic actors. Current climate projections predict that crops will be exposed to an increase of multiple and combined environmental constraints, leading to complex and generally non-deductible impacts. A better knowledge of these impacts on seed development, still poorly studied, appears thus as a relevant lever to enhance environmental resilience of agricultural productions. This thesis work is part of this scientific theme and sought to answer the following question: what are the impacts of a combination of biotic and abiotic stress on the yield elaboration and seed quality acquisition of the rapeseed?To answer this question, two rapeseed genotypes were grown in a large experimental device and subjected to a combination of stresses that are major for this crop, the water deficit and clubroot, caused by the pathogen Plasmodiophora brassicae. Signature impacts of water deficit on plants and mature seed quality have been identified using physiological and metabolic data, as well as germination kinetics. Subsequently, RNAseq, metabolic and physiological data, were used for the characterization of the rapeseed transcritional developing seed gene transcrotions and quality acquisition. The correlations between these modulations and their agronomic perspectives are discussed.; L’acquisition de la qualité de la graine est un processus contrôlé par l’expression de nombreux acteurs moléculaires et métaboliques interconnectés et modulés par l’environnement. Les modélisations climatiques actuelles prévoient l’augmentation des contraintes environnementales multiples et combinées sur les cultures, dont les effets complexes s’avèrent généralement peu prédictibles. Une meilleure compréhension de ces impacts sur le développement des graines représente un levier pertinent pour l’augmentation de la résilience environnementale des productions agricoles. Le travail de thèse s’est inscrit dans cette thématique scientifique et a cherché à répondre à la question suivante : quels sont les impacts d’une combinaison de stress biotique et abiotique sur l’élaboration du rendement et l’acquisition de la qualité de la graine de colza ?Pour y répondre, deux génotypes de colza ont été cultivés au sein d’un large dispositif expérimental et exposés à une combinaison de stress majeurs pour cette culture que sont le déficit hydrique et la hernie des crucifères, causée par le pathogène Plasmodiophora brassicae. Des impacts du déficit hydrique sur les plantes et la qualité des graines matures ont été identifiés. Par la suite, des données RNAseq, métaboliques et physiologiques ont permis de caractériser le programme transcriptionnel développemental des graines de colza et d’identifier des modulations spécifiques d’un stress ou de leur combinaison sur la transcription des gènes et l’acquisition de la qualité de graine en développement. Les corrélations entre ces modulations et leurs perspectives agronomiques sont discutées.

Eukaryotic genes are composed of exons and introns. Introns are spliced out during the maturation of pre-mRNA to mRNA. Splice site usage may vary from one transcript to another for a same gene. Alternative splicing is a source of diversity in eucaryotic transcriptomes and one gene can sometimes lead to several proteins. We can study alternative splicing using RNAseq data. Nowadays second (2GS) and third generation sequencing (3GS) technologies coexist. 2GS produce short (from 100 to 250 pb) high quality reads whereas 3GS produce long reads (up to several kilobases) but with a lot of errors. In the first part of my PhD, I analysed Nanopore long reads datasets to understand how this technology can help us to study eucaryotic transcriptomes. Particularly, I wondered if transcripts and genes quantifications obtained with Nanopore data were reliable. We used Spike-in (artificial transcripts from which we know the real quantification) and we showed that the most precise quantifications were obtained with the RNA direct protocol. Furthermore, we observed that only a fraction of the long reads covered full length transcripts. Then, I worked on a new model for complex alternative splicing events in non-model species. KisSplice, the local RNAseq assembler developped in the team, always considers parwise event even when there are more than two transcripts locally. I propose here a new scale to study alternative splicing : we consider all the splicing variations observed between two constitutive exons of a gene.; Les gènes des organismes eucaryotes sont structurés en exons et en introns. Lors de l'épissage, les introns sont retirés et les exons reliés entre eux. L'utilisation des sites d'épissage par la machinerie cellulaire peut varier d'un transcrit à l'autre pour un même gène. L'épissage alternatif permet alors à un seul gène de produire plusieurs transcrits et parfois plusieurs protéines. L'étude des données issues du séquençage des transcrits (RNAseq) nous permet d'étudier l'épissage. Actuellement deux technologies de séquençage coexistent : les technologies de seconde génération, permettant de produire des lectures courtes (100 à 250pb) avec un taux d'erreur faible et les technologies de 3ème génération permettant de produire des lectures longues (plusieurs kb) avec des taux d'erreur plus élevés. Dans un premier temps, j'ai analysé des jeux de données Nanopore (lectures longues) afin de comprendre comment ces technologies, récentes et en constante évolution, peuvent nous aider à étudier les transcriptomes eucaryotes. Plus particulièrement, je me suis demandée si les quantifications des gènes et des transcrits obtenues étaient fiables. L'utilisation de spike-in -transcrits artificiels dont on connaît la quantification- nous a permis de montrer que, parmi les différents protocoles testés, les quantifications obtenues avec le protocole RNA direct sont les plus fiables. De plus, contrairement à ce à quoi l'on s'attendait, les lectures ne couvrent pas systématiquement des transcrits complets. Ensuite, je me suis intéressée à la modélisation des évènements d'épissage alternatif complexes chez les espèces non modèles. L'assembleur local de transcriptome, KisSplice, développé dans l'équipe, compare deux à deux les transcrits, même lorsqu'il y a plus de deux transcrits localement. Je propose ici une nouvelle échelle d'étude de l'épissage qui permet de considérer toutes les variations d'épissages observées entre deux exons constitutifs à tous les transcrits d'un gène.

Les cytochromes P450 (CYP450) sont des hémoprotéines intervenant généralement dans la détoxication de l’organisme sous forme de biodégradation de molécules xénobiotiques et participent à la décomposition de certains médicaments. Cependant, les gènes codant pour les protéines CYP450 sont souvent sous-analysés dans les études génomiques à grande échelle en raison de leur difficulté d’analyse due à un haut taux de polymorphisme. Deux sous-familles seront étudiées plus en profondeur: les sous-familles CYP3A et CYP4F. La sous-famille CYP3A métabolise environ 50% des médicaments alors que les enzymes CYP4F, quant à eux, sont impliquées dans le métabolisme de composés endogènes, de nutriments et de médicaments. Les gènes de ces sous-familles sont fortement polymorphes et ce, à travers les populations humaines. Ainsi, la variabilité entre les différentes populations peut affecter la réponse aux médicaments et autres fonctions métaboliques. Dans ce projet, deux grands jeux de données, l’un en génétique des populations (le Projet des 1000 Génomes) et l’autre en transcriptomique (GTEx) seront utilisés afin d’identifier des signatures de sélection naturelle dans les gènes CYP3A et CYP4F, ainsi que leur impact sur l’expression génique de ces gènes. Nous avons détecté différentes forces de sélection (positive et balancée) dans les deux sous-familles. Certains polymorphismes identifiés comme étant sous pression sélective sont associés à une expression différentielle des gènes des deux sous-familles. Ce projet permet de mieux comprendre l’impact des mutations sous pression sélective se situant dans les gènes des sous-familles CYP3A et CYP4F. Cette caractérisation génétique permettra d’obtenir des prédictions plus fiables en pharmacogénomique et en génomique humaine, en raison de l’influence de ces gènes sur la réponse aux médicaments., Cytochromes P450 (CYP450) are hemoproteins generally involved in the detoxification of the body of xenobiotic molecules and participate in the metabolism of many drugs. Genetic polymorphisms have been found to impact drugs responses and metabolic functions. However, genes encoding CYP450 proteins are often under-analyzed in large-scale genomic studies because the difficulty of analysis due to of their high rate of polymorphism. In this study, we investigate the genetic diversity for CYP450 genes. We found that two clusters, CYP3A and CYP4F, are notably differentiated across human populations with evidence for selective pressures acting on both clusters. The CYP3A subfamily metabolizes approximately 50\% of drugs while CYP4F enzymes are involved in the metabolism of endogenous compounds, nutrients and drugs. Indeed, we found signals of recent positive selection in CYP3A and CYP4F genes and signals of balancing selection in CYP4F genes. Futhermore, unusual linkage disequilibrium is detected in both cluster, suggesting co-evolution. eQTLs were also found in both clusters which indicate co-regulation and epistasis.

The first hematopoietic stem cells (HSCs) emerge in the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) region in the vertebrate embryo. This process takes place during a short developmental period, between days 10.5 and 12.5 in the mouse embryo. More specifically, HSCs arise from so-called hemogenic aortic endothelial cells in the ventral region of the dorsal aorta. In order to better characterize the hematopoietic microenvironment of the AGM, we explored the molecular signature of the tissues surrounding the dorsal aorta by combining approaches of laser microdissection, DNA chips and bioinformatics analyses. This study showed that the Ntrk2 and Ntrk3 genes, encoding two neurotrophin receptors (the TRKB and TRKC proteins), are preferentially expressed in the cells underlying the dorsal aorta. The main objective of my project is to comprehensively map the neurotrophin-mediated pathway in AGM using single-cell molecular biology, imaging and transcriptomic approaches. My results suggest that 1) TRKB and TRKC receptor expression is dynamic along the anteroposterior axis of the mouse embryo, 2) TRKB+ and TRKC+ populations exhibit phenotypic and molecular differences, and 3) the Expression of genes encoding neurotrophins (Bdnf, Ntf3 and Ntf5) is heterogeneous and associated with neural (Bdnf), mesenchymal (Bdnf, Ntf3 and Ntf5) and smooth muscle (Bdnf) cells. My results also support the existence of a population of neuro-mesenchymal cells in the subaortic region. Functional approaches are now being considered to study the functional role of the neurotrophin-mediated pathway in aortic hematopoiesis., Les premières cellules souches hématopoïétiques (CSH) émergent dans la région Aorte-Gonades-Mésonéphros (AGM) chez l’embryon de vertébrés. Ce processus se déroule au cours d’une courte période développementale, entre les jours 10,5 et 12,5 chez l’embryon de souris. Plus précisément, les CSH naissent à partir de cellules endothéliales aortiques dites hémogéniques dans la région ventrale de l’aorte dorsale. Afin de mieux caractériser le microenvironnement hématopoïétique de l’AGM, nous avons exploré la signature moléculaire des tissus entourant l’aorte dorsale en combinant des approches de microdissection laser, de puces à ADN et d’analyses bioinformatiques. Cette étude a montré que les gènes Ntrk2 et Ntrk3, codant deux récepteurs aux neurotrophines (les protéines TRKB et TRKC), sont préférentiellement exprimés dans les cellules sous-jacentes à l’aorte dorsale. Mon projet a pour objectif principal de cartographier de façon approfondie la voie médiée par les neurotrophines dans l’AGM à l’aide d’approches de biologie moléculaire, d’imagerie et de transcriptomique à l’échelle cellule unique. Mes résultats suggèrent que 1) l’expression des récepteurs TRKB et TRKC est dynamique le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon de souris, 2) les populations TRKB+ et TRKC+ présentent des différences phénotypiques et moléculaires et 3) l’expression des gènes codant les neurotrophines (Bdnf, Ntf3 et Ntf5) est hétérogène et associée à des cellules neurales (Bdnf), mésenchymateuses (Bdnf, Ntf3 et Ntf5) et musculaires lisses (Bdnf). Mes résultats renforcent également l’existence d’une population de cellules neuro-mésenchymateuses dans la région sous-aortique. Des approches fonctionnelles sont maintenant envisagées pour étudier le rôle fonctionnel de la voie médiée par les neurotrophines dans l’hématopoïèse aortique.

The development of high-throughput DNA sequencing revolutionized the study of complex bacterial communities called “microbiomes'', in diverse environments, from the central oceans to the human intestine. The research aim of this thesis is to develop new sequencing-based technologies and apply them to provide further insights into changes to the composition and activities of microbiomes. Specifically, Chapter One presents RIMS-seq (Rapid Identification of Methylase Specificity), a method to simultaneously obtain the DNA sequence and 5-methylcytosine (m5C) profile of bacterial genomes. Modification by m5C has been described in the genomes of many bacterial species to modulate gene expression and protect from viral infection. Chapter Two introduces ONT-cappable-seq and Loop-Cappable-seq, two new techniques to reveal operon architecture through full-length transcript sequencing, using Nanopore and LoopSeq sequencing, respectively. In Chapter Three, we applied a multiomics approach using some of the tools developed in the previous chapters tostudy the dynamics of the response of a model human intestinal microbiome after treatment with ciprofloxacin, a widely used broad-spectrum antibiotic. Antibiotics are critical treatments to prevent pathogenic infections, but they also kill commensal species that promote health, enhance the spread of resistant strains, and may degrade the protective effect of microbiota against invasion by pathogens. Therefore, it is crucial to be able to characterize both the composition but also the functional response of a microbial community to antibiotic treatment. We examined both the short and long-term transcriptional and genomic responses of the synthetic community and explored how the immediate transcriptomic response correlates and potentially predicts the later changes of the microbiome composition. The goal is to try to identify a marker appearing a few minutes/hours after the treatment that could be used to potentially predict the outcome of an antibiotic treatment, opening up the path to a more personalized medicine.; Le développement du séquençage à haut débit a révolutionné l'étude des communautés microbiennes complexes, appelées "microbiomes", dans divers environnements, des océans centraux à l'intestin humain. L'objectif de la recherche menée dans le cadre de cette thèse est de développer de nouvelles technologies basées sur le séquençage haut débit et de les appliquer à l'étude des changements de compositions et d'activités des microbiomes. Le Chapitre Un présente RIMS-seq (Rapid Identification of Methylase Specificity), une méthode permettant d'obtenir simultanément la séquence ADN ainsi que le profil de méthylation 5-methylcytosine (m5C) des génomes bactériens. Le Chapitre Deux introduit ONT-cappable-seq et Loop-Cappable-seq, deux nouvelles techniques révélant la structure opéronique des transcrits via le séquençage de transcrits pleine longueur, en utilisant le séquençage Nanopore et LoopSeq, respectivement. Dans le Chapitre Trois nous avons utilisé une approche multiomique en appliquant certains des outils que nous avons développés dans les précédents chapitres, afin d'étudier la dynamique de réponse d'un microbiome synthétique représentatif d'un intestin humain après traitement avec la ciprofloxacine,un antibiotique à large spectre très largement utilisé. Les antibiotiques sont indispensables pour traiter les infections par des bactéries pathogènes mais ils éliminent également des bactéries commensales qui ont un rôle important pour la santé, entraînant le développement de souches résistantes et réduisant l'effet protecteur du microbiote contre l'invasion par des pathogènes. Il est donc crucial de pouvoir caractériser l'impact des traitements antibiotiques sur le microbiote, à la fois sur le plan compositionnel mais aussi sur le plan fonctionnel. Nous avons examiné à la fois la réponse au niveau transcriptomique et génomique, à court et à long terme, de la communauté synthétique. Nous avons exploré comment la réponse transcriptomique immédiate peut corréler et potentiellement prédire les changements de composition du microbiote, généralement observés bien plus tard après le traitement antibiotique. Le but est d'essayer d'identifier un marqueur apparaissant après quelques minutes/heures de traitement et qui pourrait être utilisé pour potentiellement prédire l'impact de ce traitement antibiotique afin de se diriger vers une médecine plus personnalisée.

The development of high-throughput DNA sequencing revolutionized the study of complex bacterial communities called “microbiomes'', in diverse environments, from the central oceans to the human intestine. The research aim of this thesis is to develop new sequencing-based technologies and apply them to provide further insights into changes to the composition and activities of microbiomes. Specifically, Chapter One presents RIMS-seq (Rapid Identification of Methylase Specificity), a method to simultaneously obtain the DNA sequence and 5-methylcytosine (m5C) profile of bacterial genomes. Modification by m5C has been described in the genomes of many bacterial species to modulate gene expression and protect from viral infection. Chapter Two introduces ONT-cappable-seq and Loop-Cappable-seq, two new techniques to reveal operon architecture through full-length transcript sequencing, using Nanopore and LoopSeq sequencing, respectively. In Chapter Three, we applied a multiomics approach using some of the tools developed in the previous chapters tostudy the dynamics of the response of a model human intestinal microbiome after treatment with ciprofloxacin, a widely used broad-spectrum antibiotic. Antibiotics are critical treatments to prevent pathogenic infections, but they also kill commensal species that promote health, enhance the spread of resistant strains, and may degrade the protective effect of microbiota against invasion by pathogens. Therefore, it is crucial to be able to characterize both the composition but also the functional response of a microbial community to antibiotic treatment. We examined both the short and long-term transcriptional and genomic responses of the synthetic community and explored how the immediate transcriptomic response correlates and potentially predicts the later changes of the microbiome composition. The goal is to try to identify a marker appearing a few minutes/hours after the treatment that could be used to potentially predict the outcome of an antibiotic treatment, opening up the path to a more personalized medicine., Le développement du séquençage à haut débit a révolutionné l'étude des communautés microbiennes complexes, appelées "microbiomes", dans divers environnements, des océans centraux à l'intestin humain. L'objectif de la recherche menée dans le cadre de cette thèse est de développer de nouvelles technologies basées sur le séquençage haut débit et de les appliquer à l'étude des changements de compositions et d'activités des microbiomes. Le Chapitre Un présente RIMS-seq (Rapid Identification of Methylase Specificity), une méthode permettant d'obtenir simultanément la séquence ADN ainsi que le profil de méthylation 5-methylcytosine (m5C) des génomes bactériens. Le Chapitre Deux introduit ONT-cappable-seq et Loop-Cappable-seq, deux nouvelles techniques révélant la structure opéronique des transcrits via le séquençage de transcrits pleine longueur, en utilisant le séquençage Nanopore et LoopSeq, respectivement. Dans le Chapitre Trois nous avons utilisé une approche multiomique en appliquant certains des outils que nous avons développés dans les précédents chapitres, afin d'étudier la dynamique de réponse d'un microbiome synthétique représentatif d'un intestin humain après traitement avec la ciprofloxacine,un antibiotique à large spectre très largement utilisé. Les antibiotiques sont indispensables pour traiter les infections par des bactéries pathogènes mais ils éliminent également des bactéries commensales qui ont un rôle important pour la santé, entraînant le développement de souches résistantes et réduisant l'effet protecteur du microbiote contre l'invasion par des pathogènes. Il est donc crucial de pouvoir caractériser l'impact des traitements antibiotiques sur le microbiote, à la fois sur le plan compositionnel mais aussi sur le plan fonctionnel. Nous avons examiné à la fois la réponse au niveau transcriptomique et génomique, à court et à long terme, de la communauté synthétique. Nous avons exploré comment la réponse transcriptomique immédiate peut corréler et potentiellement prédire les changements de composition du microbiote, généralement observés bien plus tard après le traitement antibiotique. Le but est d'essayer d'identifier un marqueur apparaissant après quelques minutes/heures de traitement et qui pourrait être utilisé pour potentiellement prédire l'impact de ce traitement antibiotique afin de se diriger vers une médecine plus personnalisée.

Microalgae, including diatoms, have a high biotechnological potential as efficient producers of high value-added molecules. However, the scientific knowledge of biological processes remains too scarce to make the microalgae-based biotechnology a viable alternative to traditional sources and more research must be carried on to fulfil this insufficiency, especially on the regulation of the stress-triggered carbon reallocation to lipids. In order to bring new elements to the understanding of these mechanisms, a multidisciplinary approach coupling physiological, biochemical and transcriptomic analyses was applied on a highly controlled photobioreactor Phaeodactylum tricornutum culture, shifted from N-replete to N-starvation condition. A special attention to the cell responses was given during the transition between these two nitrogen conditions. The collected information allowed to complement what was already reported in literature in which the two different N conditions are usually compared. The performed experiments showed that the intracellular nitrogen availability acts as a switch-like inducer of metabolic and physiological responses during the transition between a N-repleted and N-starvation equilibria. A major gene expression change is observed when the decreased extracellular N availability forces cells to utilize the intracellular N pools. A reorientation of the cellular metabolism toward an energy storage mode is observed. The central carbon metabolism is overactivated acting as a metabolic flywheel maintaining the energetic equilibrium of the cell. N-requiring activities, including cell division and photosynthetic activity, are affected and gradually reduced. Plastids are partially dismantled but their energetic status is kept in a stand-by mode maintaining the capability of a fast recover after the reintroduction of a nitrogen source.The whole cellular responses are regulated by cellular sensing and signalling mechanisms in which transcription factors play important roles. Differential gene expression is observed in several transcription factors encoding genes. For this reason, transcription factors candidates have been selected for the generation of overexpressing, silencing and/or knock out mutant lines. A large number of transformant lines were generated requiring an efficient large scale screening method. In this frame, a vibrational spectroscopy-based technique was set up, allowing a fast biochemical characterization and replacing time consuming and tedious conventional biochemical analyses. Additionally, a microtiter-plate-based cultivation protocol was set up allowing the management of a large number of small volume culture. To optimize small volume culturing, a self-built device was designed, assembled and tested showing a potential for microalgal cultivation in microtiter plates.To summarize, this PhD work contributes to the comprehension of the cellular processes involved in the response to nitrogen limitation and on the control mechanisms in diatoms. It provides new insights on the potential application and optimization of microalgae as competitive source of bio-commodities.; Les microalgues, dont les diatomées, ont un potentiel biotechnologique élevé en tant que productrices efficaces de molécules à haute valeur ajoutée, généralement en condition de stress. Cependant, la connaissance scientifique des processus biologiques reste trop limitée pour faire de biotechnologies à base de microalgues une alternative viable aux sources traditionnelles. Un travail de recherche doit être mené pour combler cette insuffisance, notamment sur la régulation de la réallocation du carbone déclenchée par le stress vers les lipides. Afin d'apporter de nouveaux éléments à la compréhension de ces mécanismes, une approche multidisciplinaire couplant des analyses physiologiques, biochimiques et transcriptomiques a été utilisée sur une culture de Phaeodactylum tricornutum soumise à une carence en azote progressive. Cette expérience a été effectuée en conditions de culture très contrôlées dans un photobioréacteur. Une attention particulière a été portée aux réponses cellulaires mise en place lors de la transition entre les deux conditions azotées. Les informations recueillies ont permis de compléter le connaissances actuelles, établies par comparaison de différentes conditions de disponibilité en azote. Les résultats montrent que la disponibilité de l'azote intracellulaire agit comme un interrupteur de réponses métaboliques et physiologiques au cours de la transition entre deux conditions d’équilibre : la présence d’une quantité suffisant d’azote et son absence. Un changement majeur d'expression génique est observé lorsque la réduction de disponibilité en azote extracellulaire force les cellules à utiliser les réserves d’azote intracellulaires. Une réorientation du métabolisme cellulaire vers un stockage d'énergie est observée. Le métabolisme central du carbone est suractivé, maintenant l'équilibre énergétique de la cellule. Les activités cellulaires qui nécessitent de l’azote, y compris la division cellulaire et l'activité photosynthétique, sont affectées et progressivement réduites. Les plastes sont partiellement démantelés mais leur état énergétique est maintenu en mode veille qui permet une récupération rapide après la réintroduction d'une source d'azote. Les réponses cellulaires entières sont régulées par des mécanismes de détection et de signalisation cellulaires dans lesquels les facteurs de transcription jouent un rôle très important. L'expression différentielle des gènes est observée sur plusieurs gènes codants des facteurs de transcription. Des facteurs de transcription candidats ont ainsi été sélectionnés afin de générer des lignées mutantes sur-exprimant, sous-exprimant ou éliminant le gène codant. Un grand nombre de lignées transformantes ont été générées, nécessitant une méthode de criblage à grande échelle efficace. Dans ce cadre, une technique basée sur la spectroscopie vibrationnelle a été mise en place, permettant une caractérisation biochimique rapide et remplaçant les analyses biochimiques conventionnelles longues et fastidieuses. De plus, un protocole de culture en microplaques a été mis en place permettant la gestion d'un grand nombre de culture en petit volume. Pour optimiser ces cultures, un dispositif a été conçu, assemblé et testé. En résumé, ce travail de thèse contribue à la compréhension des processus cellulaires impliqués dans la réponse à la limitation azotée et sur les mécanismes de contrôle chez les diatomées. Il fournit de nouvelles informations sur l'application potentielle et l'optimisation des microalgues en tant que source compétitive de produits d’origine naturelle.

La cardiopathie ischémique incluant l’insuffisance cardiaque est la deuxième cause de mortalité annuelle au Canada. Bien que de nombreuses stratégies préventives et des thérapies pharmacologiques retardent la progression de la maladie, il n’existe aucune solution qui module directement aux les remaniements pathologiques et la perte de cardiomyocytes. Au cours des 25 dernières années, de multiples progrès dans les domaines de la médecine régénérative et de la thérapie cellulaire ont annoncé des résultats prometteurs, mais les résultats d’études cliniques contemporaines demeurent plutôt mitigés. COMPARE-AMI, une étude randomisée-contrôlée de phase II, a évalué l’effet d’injections intracoronariennes de cellules souches hématopoïétiques CD133+ chez des patients souffrant d’infarctus aigu. IMPACT-CABG, une ÉRC de phase II a également évalué l’effet d’injections intramyocardiques de cellules CD133+ chez les patients souffrant de cardiomyopathie ischémique chronique nécessitant une revascularisation chirurgicale. Nous avons émis l’hypothèse que les cellules CD133+ utilisées dans des études cliniques de cardiomyopathies ischémiques aiguës et chroniques des patients répondant à la thérapie cellulaire exhibent des signatures transcriptomiques communes responsables de leur effet thérapeutique. En classant les patients en tant que répondants et non-répondants selon leur fonction cardiaque, nous avons évalué, a posteriori, ces patrons d’expression. Les cellules CD133+ autologues de patients jugés répondants expriment des signatures qui sont hautement conservées entre elles (incluant l’angiogénèse, la régulation de la réponse au stress et la survie cellulaire) et uniques d’un modèle à l’autre et qui pourraient, en partie, exprimer les issus cliniques des patients. Afin de maximiser les effets de la thérapie cellulaire aux cellules souches, nous avons par la suite tenté de reproduire ces phénotypes par stimulation pharmacologique avec des inhibiteurs d’HSP90 pour leurs effets qui semblent reproduire ces signatures. Ainsi, nous avons démontré qu’une stimulation de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) au Célastrol (inhibiteur HSP90) pouvait répliquer certains de ces phénotypes. Notamment, des CSMh conditionnées activent des voies de signalisation de type ‘RISK’ et augmentent leur sécrétion de protéines en lien avec la réponse au stress ainsi que d’exosomes contenant des molécules impliquées dans la communication intercellulaire sans être liées à un changement de type cellulaire. De plus, les CSMh traitées semblent améliorer la guérison de plaie par activité paracrine et sont plus résistante à la sénescence oxydative. Ces résultats encourageants nous permettent d’envisager des stratégies plus poussées de pré-conditionnement cellulaire ex vivo de cellules CD133+ avant leur implantation. À terme, cela pourrait mener à une optimisation de la thérapie cellulaire afin d’en maximiser les bénéfices cliniques et d’en exploiter leur plein potentiel., Ischemic cardiomyopathy and heart failure are the second annual cause of mortality in Canada. Despite rigorous prevention strategies and drug regimens preventing progression, no therapeutic modality can currently reverse the pathologic modifications of the disease. In the last quarter century, numerous advances in the field of regenerative medicine and cell therapy have demonstrated promising effects. COMPARE-AMI, a phase II randomized controlled trial (RCT), evaluated the effect of intracoronary injection of CD133+ cells in acute myocardial infarction following percutaneous intervention. IMPACTCABG, also a phase II RCT, evaluated the effect of intramyocardial injection of CD133+ hematopoietic stem cells in chronic ischemic cardiomyopathy at the time of surgical revascularization. That being said, we believe that the CD133+ cells used in therapy have shared transcriptomic signatures that are responsible for their clinical effects. By classifying patients into responders and non-responders according to an improvement in ejection fraction, we evaluated, a posteriori, those expression patterns. Autologous CD133+ cells of patients classified as responders expressed highly conserved transcriptomic signatures that could be responsible for the clinical outcomes of patients. Notably, these signatures were related to cardioprotective mechanisms including angiogenesis, stress response regulation and cell survival. In order to harness the full potential of stem cell therapy, we attempted to reproduce the identified phenotypes by pharmacological intervention with HSP90 inhibitors which are known to mimic some of these effets. Conditioned human mesenchymal stem cells (hMSC) activated ‘RISK’-type signaling pathways and augmented exosome and protein secretion relating to the response to cellular stress; this activation was unrelated to a switch of cell type. Furthermore, treated hMSC seemed to favour improved wound healing by paracrine activity and were more resistant to oxidative senescence. These encouraging results allow us to develop novel, more advance, strategies of ex vivo cell preconditioning before implantation, including of CD133+ cells. Ultimately, we hope that optimisation of cells through this mechanism and others will allow us to unleash the full potential of stem cell therapy.

Les contractions rythmiques résultent de l’activité stimulatrice du nœud sinusal dans le cœur et des cellules interstitielles de Cajal (CICs) dans les intestins. Nous avons découvert un nouveau syndrome résultant d’une combinaison de la maladie du nœud sinusal (MNS) et de la pseudo-obstruction intestinale chronique (POIC). Ce syndrome, que nous avons nommé Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia (CAID), résulte d’une mutation récessive du gène SGO1 (K23E). Cependant, les rôles connus de SGO1 n'expliquent pas l'apparition postnatale du syndrome ni la pathologie spécifique, suggérant que des rôles non canoniques de SGO1 conduisent aux manifestations cliniques observées. Cette hypothèse est supportée par la comparaison de CAID avec les autres cohésinopathies qui présentent principalement des phénotypes développementaux sans ou avec des défauts légers du cycle cellulaire. Ce projet visait à une découverte non biaisée des mécanismes non canoniques expliquant le syndrome CAID en utilisant le dogme de la biologie moléculaire (ADN→ARNm→protéine) comme ligne directrice. Pour ce faire, nous avons effectué des criblages multi-omiques sur des fibroblastes de peau de patients CAID et de contrôles sains. Les résultats des criblages ont été validés par électrophysiologie, étude des voies de signalisation pertinentes, immunohistochimie, pyroséquençage des rétrotransposons LINE-1 et quantification des marques d’histones. Nos études multi-omiques ont confirmé des changements dans la régulation du cycle cellulaire, mais aussi dans la conduction cardiaque et la fonction des muscles lisses. Plus spécifiquement, plusieurs canaux potassiques étaient sous-régulés. L’électrophysiologie a confirmé une diminution du courant potassique rectifiant entrant (IK1). L'immunohistochimie des coupes intestinales de patients CAID a confirmé l’augmentation de l’expression de SGO1 et BUB1, un régulateur de la voie de signalisation TGF-β. De plus, la voie canonique de TGF-β est augmentée et est découplée de la voie non canonique. Au niveau épigénétique, une signature unique d’hyperméthylation et de fermeture de la chromatine a été observée. Ce qui est soutenu par l’augmentation de la méthylation de H3K9me3 et de H3K27me3. En conclusion, le syndrome CAID est associé à plusieurs changements ayant possiblement un effet cumulatif plutôt que d’une seule voie de signalisation dérégulée. Nos résultats désignent la perturbation du courant IK1, la dérégulation de la signalisation TGF-β, l’hyperméthylation de l’ADN et la compaction de la chromatine comme éléments conducteurs potentiels des manifestations cliniques observées. La voie TGF-β et les changements épigénétiques peuvent être ciblées par des médicaments existants, constituant ainsi des cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement du syndrome CAID., Rhythmic contractions are driven by the pacemaker activity of the cardiac sinus node and the intestinal interstitial cells of Cajal (ICC). We have discovered a new syndrome resulting from a combination of sick sinus syndrome (SSS) and chronic intestinal pseudo-obstruction (CIPO). This syndrome, which we have named Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia (CAID), results from a recessive mutation in the SGO1 gene (K23E). However, the known roles of SGO1 do not explain the postnatal onset of the syndrome nor the specific pathology, suggesting that non-canonical roles of SGO1 lead to the clinical manifestations observed. This hypothesis is supported by the comparison of CAID with other cohesinopathies which mainly exhibit developmental phenotypes without or with mild cell cycle defects. This project aimed towards an unbiased discovery of noncanonical mechanisms explaining CAID using the molecular biology dogma (DNA→mRNA→protein) as a guideline. We performed multi-omic screens on skin fibroblasts from CAID patients and healthy controls. Screening results were validated by electrophysiology, study of relevant signaling pathways, immunohistochemistry, LINE-1 retrotransposon pyrosequencing, and histone marks quantification. Our multiomics analyses confirmed changes in cell cycle regulation, but also in cardiac conduction and smooth muscle function. More specifically, several potassium channels were downregulated. Electrophysiology studies confirmed a decrease in the inward rectifier potassium current (IK1). Immunohistochemistry in CAID patient’s intestinal sections confirmed overexpression of SGO1 and BUB1, a regulator of TGF-β signaling pathway. Additionally, the canonical TGF-β signaling was increased and decoupled from noncanonical signaling. At the epigenetic level, CAID patient fibroblasts have a unique signature of hypermethylation and chromatin closure. This is supported by the increased methylation of H3K9me3 and H3K27me3. In conclusion, CAID syndrome is associated with several changes that, may have a cumulative effect rather than a single deregulated signaling pathway. Our results reveal the disturbance of the IK1 current, the deregulation of TGF-β signaling, DNA hypermethylation and chromatin accessibility changes as potential conductors of intestinal and cardiac manifestations of CAID syndrome. In particular, the TGF-β pathway and epigenetic changes, may be targeted by existing drugs, thus constituting promising therapeutic targets for the treatment of CAID syndrome.

L'efficacité de l'alimentation est un caractère économiquement important dans l'industrie porcine puisque le coût des aliments représente plus de 2/3 des coûts de production totaux. Parmi les mesures disponibles pour l'évaluation de l'efficacité alimentaire, la consommation moyenne journalière résiduelle (CMJR) reflète la différence entre la consommation observée et la consommation théorique estimée afin de répondre aux besoins de production et d'entretien. A INRAE depuis plus de 20 ans, une sélection divergente pour une meilleure (CMJR-) et une moindre efficacité alimentaire (CMJR+) a été effectuée sur des porcs Large-White (LW) pendant dix générations. En utilisant ces lignées sélectionnées, l'objectif principal de cette thèse était d'approfondir nos connaissances sur les bases génétiques et biologiques de la CMJR chez les porcs. Dans une première étude, nous avons recherché les régions génomiques affectant la CMJR et des caractères de production corrélés à la CMJR via une analyse d'association. Les données de génotypage ont été acquises à l'aide de puces de SNP de moyenne densité (MD) pour l'ensemble des individus reproducteurs des deux lignées divergentes et 32 individus fondateurs ont été génotypés à l'aide d'une puce haute densité (HD). Grace à des analyses d'imputation nous avons pu reconstruire les génotypes de 570 447 marqueurs de la puce HD pour l'ensemble des reproducteurs. Ces génotypes ont alors été utilisés pour attribuer un génotype moyen à l'ensemble des portées de descendants phénotypés pour les caractères d'intérêt (dont le CMJR). Ainsi des analyses GWAS ont été réalisées à partir d'un dispositif de 2 426 porcs phénotypés pour 24 caractères et disposant après prédiction des génotypes reconstruits à l'aide des informations généalogiques. Ces études ont été réalisées dans chaque lignée indépendamment ou en incluant les deux lignées. Au total, 186 régions QTL ont été identifiées dont 54 régions chromosomiques via l’approche globale, et 37 et 61 régions respectivement détectées à partir de la lignée CMJR- seule et la lignée CMJR+ seule. Parmi celles-ci, seules 15 régions sont partagées entre au moins deux analyses, et une seule est commune aux trois approches GWAS mais présentent des effets pour des caractères différents selon l'analyse. Parmi les 12 régions QTL détectées pour la CMJR, 3 avaient été d'ores et déjà identifiées et publiées dans d'autres études et 9 nouvelles régions génomiques ont été identifiées contenant des gènes candidats potentiels impliquées dans la prolifération cellulaire et les processus de différenciation des tissus gastro-intestinaux ou des voies de signalisation liées au métabolisme des lipides. La détection de régions QTL différentes entre les deux lignées pourrait être dû aux changements de fréquences alléliques au cours de la sélection des lignées. Afin d'affiner la caractérisation des régions QTL dans une seconde étude nous avons exploité un jeu de de données transcriptomiques disponible sur 4 tissus pour un lot d’individus issus de la 8ème génération de sélection. Des études d'enrichissement successives ont été réalisées à l'aide de l'outils GSEA, (1) en confrontant uniquement la liste des gènes différentiellement exprimés (DEG) à la base de données « Molecular Signatures Database » (MSigDB), (2) en recherchant dans cette même base de données les voies métaboliques enrichies en gènes présents dans les régions QTL et (3) en cherchant à combiner les données génétiques et transcriptomiques. Dans le cadre de cette approche nous avons choisi de porter une attention particulière aux DEG localisés en cluster dans le génome et aux régions présentant de fortes évolutions de fréquence à l'issue de la sélection. A terme l’intégration de données fonctionnelles, les plus riches et complètes possibles, doit ainsi permettre d'affiner la recherche de gènes candidats et d'identifier des processus biologiques sousjacents aux lignées divergentes pour l'efficacité alimentaire.

International audience; The development of new high-throughput technologies in genomics and then in transcriptomics has modified clinical approach in nephrology. At the interface between high-throughput technologies (microarray, new generation sequencing «NGS») and few mRNA analysis (reverse transcriptase quantitative PCR [RT-qPCR]), the nCounter® of NanoString® offers a new and complementary approach. Capable of analyzing formalin-fixed paraffin-embedded samples, this technology is a credible candidate for implanting transcriptomics in clinical routine.; L’essor des nouvelles technologies à haut-débit en génomique puis en transcriptomique a modifié l’approche clinique en néphrologie. À l’interface entre le très haut-débit (puces à ADN [microarray], séquençage de nouvelle génération « NGS ») et l’analyse de quelques ARN messagers (PCR quantitative de rétrotranscription [RT-qPCR]), le nCounter® de NanoString® offre une approche nouvelle et complémentaire. Suffisamment sensible pour analyser des échantillons de tissu fixé et inclus en paraffine, cette technologie s’inscrit comme un candidat crédible pour implanter la transcriptomique dans la routine clinique.

Leptosphaeria maculans is a pathogenic fungus responsible for the stem canker disease of oilseed rape. Its life cycle is long and complex and is composed of a succession of asymptomatic and necrotic colonisation stages of the host tissues, from the hemibiotrophic colonisation of leaves in autumn to the stem canker development in spring. After these infectious stages on living plant tissue, L. maculans survives as a saprophyte within crop residues. So far, the study of the molecular determinants of L. maculans pathogenesis was focused on a specific class of genes, encoding "effector" proteins, and focused on the early infection on leaves. At present there is no global view of the genes involved in the pathogenesis during the entire infection cycle. In addition, the life cycle of L. maculans is closely related to that of Leptosphaeria biglobosa, a closely related, less pathogenic species. L. biglobosa co-infects the oilseed rape plants along with L. maculans throughout the fungal life cycles, but its impact on L. maculans is poorly understood. Recently, 420 biological samples, collected during all stages of the life cycle of L. maculans, have been sequenced by RNA-Seq, including in vitro and in planta conditions, both in controlled environments (whether or not co-infected with L. biglobosa) or under natural infection. The objectives of my thesis were: (i) to identify as exhaustively as possible, using tanscriptomic approaches, the genes induced in L. maculans during its entire infectious cycle and, (ii) to determine the impact of the biotic interaction with L. biglobosa. I first showed that 9% of the predicted genes in L. maculans are induced specifically during infection. These are clustered into eight waves of expression, outlining the cycle as described in the literature and revealing, for some stages, a more complex transcriptomic subdivision, depending on the organ infected or on the lifestyle adopted by the fungus. I also demonstrate the importance of epigenetic regulation since all the waves of expression are enriched with genes located in a heterochromatin environment. When the third partner, L. biglobosa, coinfects the leaves at the beginning of the cycle, the gene expression in L. maculans stagnates and the plant colonisation by L. maculans is inhibited. However, this inhibitory effect is conditioned by strict conditions of co-inoculations, rarely observed during natural infections. My thesis project thus constitutes a first transcriptomic description of the life cycle of L. maculans in its entirety and in interaction with its biotic environment.; Leptosphaeria maculans est un champignon pathogène responsable de la nécrose du collet chez le colza. Son cycle de vie est long et complexe car composé d’une succession d’étapes de colonisation asymptomatiques puis nécrotiques des différents tissus de l’hôte, depuis la colonisation hémibiotrophe des feuilles à l’automne à la nécrose du collet au printemps. Après ces phases infectieuses dans des tissus végétaux vivants, L. maculans vit en tant que saprophyte dans les résidus de culture. Jusqu’ici, l’étude des déterminants moléculaires de la pathogénie chez L. maculans s’est concentrée sur l’analyse d’une classe spécifique de gènes, codant pour des « effecteurs », et cela durant une seule partie du cycle : l’infection précoce des feuilles. A l’heure actuelle il n’y a pas de vue d’ensemble des gènes impliqués dans la pathogénie durant tout le cycle infectieux. Aussi, le cycle de vie de L. maculans est intimement lié à celui de Leptosphaeria biglobosa, une espèce proche mais moins pathogène. L. biglobosa coinfecte le colza avec L. maculans durant tout leur cycle de vie, mais son impact sur L. maculans est mal connu. Récemment, 420 échantillons biologiques, collectés durant toutes les étapes du cycle de vie de L. maculans, ont été séquencés par RNA-Seq. Ils incluent des conditions in vitro et in planta, à la fois dans un environnement contrôlé (en coinfection ou non avec L. biglobosa) et en conditions d’infection naturelle. Les objectifs de ma thèse étaient : (i) d’identifier le plus exhaustivement possible, par des approches transcriptomiques, les gènes induits chez L. maculans durant l’entièreté de son cycle infectieux et (ii) de déterminer l’impact de l’interaction biotique avec L. biglobosa. J’ai d’abord montré que 9 % des gènes prédits chez L. maculans sont induits spécifiquement lors de l’infection. Ils sont répartis en huit vagues d’expression redécoupant le cycle tel que décrit dans la littérature et révèlent, pour certains stades, une décomposition transcriptomique encore plus complexe, qui dépend de l’organe colonisé ou du type trophique adopté par le champignon. Je démontre aussi l’importance de la régulation épigénétique puisque toutes les vagues d’expression sont enrichies en gènes localisés dans un environnement génomique de type hétérochromatinien. Lorsque le troisième partenaire, L. biglobosa, entre en jeu en début de cycle, l'expression des gènes chez L. maculans stagne et est accompagnée de l’arrêt de la colonisation. Cet effet inhibiteur est cependant restreint à des conditions de co-inoculations rarement observées lors des infections naturelles. Mon projet de thèse constitue ainsi une première description transcriptomique du cycle de vie de L. maculans dans son intégralité et en interaction avec son environnement biotique.

Leptosphaeria maculans is a pathogenic fungus responsible for the stem canker disease of oilseed rape. Its life cycle is long and complex and is composed of a succession of asymptomatic and necrotic colonisation stages of the host tissues, from the hemibiotrophic colonisation of leaves in autumn to the stem canker development in spring. After these infectious stages on living plant tissue, L. maculans survives as a saprophyte within crop residues. So far, the study of the molecular determinants of L. maculans pathogenesis was focused on a specific class of genes, encoding "effector" proteins, and focused on the early infection on leaves. At present there is no global view of the genes involved in the pathogenesis during the entire infection cycle. In addition, the life cycle of L. maculans is closely related to that of Leptosphaeria biglobosa, a closely related, less pathogenic species. L. biglobosa co-infects the oilseed rape plants along with L. maculans throughout the fungal life cycles, but its impact on L. maculans is poorly understood. Recently, 420 biological samples, collected during all stages of the life cycle of L. maculans, have been sequenced by RNA-Seq, including in vitro and in planta conditions, both in controlled environments (whether or not co-infected with L. biglobosa) or under natural infection. The objectives of my thesis were: (i) to identify as exhaustively as possible, using tanscriptomic approaches, the genes induced in L. maculans during its entire infectious cycle and, (ii) to determine the impact of the biotic interaction with L. biglobosa. I first showed that 9% of the predicted genes in L. maculans are induced specifically during infection. These are clustered into eight waves of expression, outlining the cycle as described in the literature and revealing, for some stages, a more complex transcriptomic subdivision, depending on the organ infected or on the lifestyle adopted by the fungus. I also demonstrate the importance of epigenetic regulation since all the waves of expression are enriched with genes located in a heterochromatin environment. When the third partner, L. biglobosa, coinfects the leaves at the beginning of the cycle, the gene expression in L. maculans stagnates and the plant colonisation by L. maculans is inhibited. However, this inhibitory effect is conditioned by strict conditions of co-inoculations, rarely observed during natural infections. My thesis project thus constitutes a first transcriptomic description of the life cycle of L. maculans in its entirety and in interaction with its biotic environment.; Leptosphaeria maculans est un champignon pathogène responsable de la nécrose du collet chez le colza. Son cycle de vie est long et complexe car composé d’une succession d’étapes de colonisation asymptomatiques puis nécrotiques des différents tissus de l’hôte, depuis la colonisation hémibiotrophe des feuilles à l’automne à la nécrose du collet au printemps. Après ces phases infectieuses dans des tissus végétaux vivants, L. maculans vit en tant que saprophyte dans les résidus de culture. Jusqu’ici, l’étude des déterminants moléculaires de la pathogénie chez L. maculans s’est concentrée sur l’analyse d’une classe spécifique de gènes, codant pour des « effecteurs », et cela durant une seule partie du cycle : l’infection précoce des feuilles. A l’heure actuelle il n’y a pas de vue d’ensemble des gènes impliqués dans la pathogénie durant tout le cycle infectieux. Aussi, le cycle de vie de L. maculans est intimement lié à celui de Leptosphaeria biglobosa, une espèce proche mais moins pathogène. L. biglobosa coinfecte le colza avec L. maculans durant tout leur cycle de vie, mais son impact sur L. maculans est mal connu. Récemment, 420 échantillons biologiques, collectés durant toutes les étapes du cycle de vie de L. maculans, ont été séquencés par RNA-Seq. Ils incluent des conditions in vitro et in planta, à la fois dans un environnement contrôlé (en coinfection ou non avec L. biglobosa) et en conditions d’infection naturelle. Les objectifs de ma thèse étaient : (i) d’identifier le plus exhaustivement possible, par des approches transcriptomiques, les gènes induits chez L. maculans durant l’entièreté de son cycle infectieux et (ii) de déterminer l’impact de l’interaction biotique avec L. biglobosa. J’ai d’abord montré que 9 % des gènes prédits chez L. maculans sont induits spécifiquement lors de l’infection. Ils sont répartis en huit vagues d’expression redécoupant le cycle tel que décrit dans la littérature et révèlent, pour certains stades, une décomposition transcriptomique encore plus complexe, qui dépend de l’organe colonisé ou du type trophique adopté par le champignon. Je démontre aussi l’importance de la régulation épigénétique puisque toutes les vagues d’expression sont enrichies en gènes localisés dans un environnement génomique de type hétérochromatinien. Lorsque le troisième partenaire, L. biglobosa, entre en jeu en début de cycle, l'expression des gènes chez L. maculans stagne et est accompagnée de l’arrêt de la colonisation. Cet effet inhibiteur est cependant restreint à des conditions de co-inoculations rarement observées lors des infections naturelles. Mon projet de thèse constitue ainsi une première description transcriptomique du cycle de vie de L. maculans dans son intégralité et en interaction avec son environnement biotique.