Search

Endocrine disrupting chemicals, or EDCs, are some of the most prevalent toxic chemicals found in the environment because of human activity and they have a variety of adverse effects on both humans and wildlife. A proposed mechanism through which EDCs can negatively affect an organism is via an epigenetic mechanism known as DNA methylation, which can affect the development of the organism with negative outcomes later in life. The aim of this project was to investigate the effect of a prenatal exposure to mixture of EDCs, called Mixture N1, and its adverse effects. Mixture N1 has in a previous study been detected in the first semester of mothers, and linked to language delay in the offspring in the SELMA cohort study. We investigated relationships with DNA methylation pattern changes in key genes with exposure, gene expression and behaviour in the adult brains of the exposed mice. Our results showed correlative as well as linear relationships between methylation and different behavioural outcomes for target genes. One gene in particular - Nr3c1 - stood out among the results, having links to both stress and sociability. Specifically, DNA methylation of this gene correlates to active stress coping behaviours as well as sociability, but with no mediation component in these relationships. These results are promising for the use of methylation analysis as a biomarker of EDC mixture exposure, but more so as a predictor of negative behavioural outcomes later in life. More research could strengthen this use, and uncover the mechanism through which methylation alone might affect changes in behaviour.

Sammanställningar baserade på kritisk genomgång och värdering av de veten-skapliga fakta, vilka är relevanta som underlag för fastställande av hygieniskt gränsvärde. Volymen omfattar de underlag som avgivits från Kriteriegruppen för hygieniska gränsvärden vid Arbetsmiljöverket under perioden januari 2015 till och med juni 2016. AFA Försäkring

Humans are continuously exposed to chemicals in the environment. Some chemicals can be found in human adipose tissue and milk, exposing embryos, fetuses and neonates via the mother. During early development, the organs, the brain and the spinal cord are formed, which at certain critical periods are extra susceptible to xenobiotics. A critical period for the brain is the so-called “brain growth spurt” (BGS), which for humans start during the third trimester and continues for the first two years of life, peaking around birth. In mice the process is neonatal, continuing for the first 3-4 weeks of life, peaking at postnatal day (PND) 10. During BGS the brain grows in size to its adult structure, and there is a high development and proliferation rate of glial cells, neurite outgrowth, dendritic arborization, synaptogenesis and myelination. In the present study, male neonatal mice were given a single oral dose of insecticides (organic pollutants) 10.0 mg/kg BW chlorpyrifos, 0.5 mg/kg BW cypermethrin, or the combination exposure 10.0 mg/kg BW chlorpyrifos + 0.5 mg/kg BW cypermethrin at PND10, in order to investigate if the neonatal exposure would alter the levels of six neuroproteins in the neonatal brain, in the adult brain, and if the combined exposure would cause an interaction. 24 hours or 4 months after exposure the mice were sacrificed, and the neuroprotein levels were analyzed in cerebral cortex and hippocampus. Results showed a significant increase (p ≤ 0.05) in five out of six neuroproteins in the neonatal cerebral cortex (CaMKII, GAP43, GluR1, PSD-95 and tau), and in three out of six neuroproteins in the adult cerebral cortex (GluR1, synaptophysin and tau). Certain effects were transient, probably due to the brain’s own coping mechanisms, while others were permanent and possibly too severe to recover from. Some effects were heightened in the adult compared to the neonate, suggesting that a fluctuation in the protein levels was not picked up. For two proteins there might have been a trend towards an interaction. The conclusion of this study is that a single oral exposure to chlorpyrifos, cypermethrin or the combination of the two, during the peak of BGS, can cause developmental neurotoxic effects, manifested as altered levels of certain neuroproteins important for normal brain development and cognition, both in neonates and in adulthood. Both insecticides have previously been tested separately and caused changed neuroprotein levels, as well as behavior and cognitive impairments in adulthood. It is likely to believe that the mice in this study also would have shown the same signs of behavioral anomalies. Lastly, significant neuroprotein level changes, and behavioral impairments have been seen in many previous studies for several persistent organic pollutants (POPs), when mice have been exposed during the same period in early development. This shows that the BGS is a highly susceptible period in brain development, and thus an important period to study. Människor exponeras ständigt för kemikalier i miljön, varav vissa kan återfinnas i fettvävnader och mjölk, vilket utsätter embryon, foster och nyfödda barn via modern. Under den tidiga utvecklingen bildas organen, hjärnan och ryggmärgen, och vid vissa kritiska perioder är de extra känsliga mot xenobiotika. En kritisk period för hjärnan är den så kallade “brain growth spurt” (BGS), en tillväxtspurt som för människor börjar under den tredje tremånadsperioden under graviditeten och fortsätter under de första två åren i livet, med sin snabbaste tillväxt runt födseln. Hos möss tar hela processen plats under nyföddhetsperioden, och fortsätter under de första 3-4 veckorna i livet, med sin snabbaste tillväxt omkring 10 dagar efter födseln. Under BGS växer hjärnan i storlek till sin vuxna struktur, och har en hög tillväxt och förökning av glialceller, neuritutväxt, dendritförgrening, synaptogenes och myelinering. I den här studien fick nyfödda hanmöss en oral engångsdos av insekticiderna 10.0 mg/kg BW chlorpyrifos, 0.5 mg/kg BW cypermethrin eller en kombinerad exponering 10.0 mg/kg BW chlorpyrifos + 0.5 mg/kg BW cypermethrin 10 dagar efter födseln, för att undersöka om en exponering under nyföddhetsperioden påverkade nivåerna av sex neuroproteiner i den nyfödda hjärnan, i den vuxna hjärnan och om den kombinerade exponeringen gav en interaktionseffekt. 24 timmar eller 4 månader efter exponeringen avlivades mössen, och neuroproteinnivåerna analyserades i hjärnbarken och i hippocampus. Resultaten visade en signifikant ökning (p ≤ 0.05) hos fem av sex neuroproteiner i den nyfödda hjärnans hjärnbark (CaMKII, GAP43, GluR1, PSD-95 and tau) och hos tre av fem neuroproteiner i den vuxna hjärnans hjärnbark (GluR1, synaptophysin and tau). Vissa effekter var övergående, troligtvis p.g.a. hjärnans egna försvarsmekanismer, medan andra effekter var permanenta och troligtvis för allvarliga för hjärnan att reparera. Vissa effekter blev förhöjda hos de vuxna djuren i förhållande till de nyfödda, vilket tyder på att en fluktuation i proteinnivåerna inte registrerades. Hos två proteiner kan det ha funnits en trend mot en interaktionseffekt. Slutsatsen för den här studien är att en oral engångsdos av insekticiderna chlorpyrifos, cypermethrin eller kombinationen av de två under perioden för hjärnans snabbaste tillväxt, kan ge utvecklingsskador i hjärnan, vilket uppvisas genom förändrade nivåer för vissa proteiner som är viktiga för hjärnans normala utveckling och kognition, både hos nyfödda och vuxna möss. Båda insekticiderna har tidigare testats separat och även då förändrat proteinnivåer, såväl som skadat beteende och kognition hos vuxna djur. Det är därför troligt att även mössen i denna studie också skulle uppvisat liknande tecken på beteendeavvikelser. Slutligen har signifikanta nivåförändringar för neuroproteiner och beteendeavvikelser setts i många tidigare studier för flera andra persistenta organiska ämnen (POPs) när möss har exponerats under samma period i den tidiga utvecklingen. Det visar på att BGS är en väldigt känslig period i hjärnans utveckling och därför en viktig period att studera. EU research project FP7:282957, DENAMIC

Maize, a commonly cultivated plant today, was already grown ten thousand years ago in South America, and it orginates from teosinte, a plant that is native to Mexico. A lot of different maize hybrids have been cross-pollinated since the beginning of the twentieth century, to obtain cultivars that give higher yields. In order to increase efficacy, maize plants have been made herbicide tolerant. Genetic engineering has made it is possible to transform maize cells with a gene for glyphosate tolerance, resulting in entire maize plants with tolerance to the herbicide Roundup®. A gene gun was used when maize was transformed with a gene casette containing two copies of the gene that encodes glyphosate tolerance, EPSPS, thus creating the GM-maize called NK603. The gene-casette in NK603 enables the maize plant to synthesize aromatic acids even when it exposed to glyphosate, thus enabling the plant to synthesize proteins and continue to live on. The EPSPS trans gene in NK603 originates from a bacterium. Trials carried out by experts with connection to Monsanto show that the GM-crop is as nutritious as conventional maize. These experiments also demonstrated that the consumption of food or animal feed produced by NK603 does not pose a health risk. A french research team without connection to Monsanto and under the direction of Dr. Séralini carried out a two-year feeding trial, in which rats were fed NK603. During the course of the trial, the animals developed cancer tumors, and obtained permanent damage to liver and kidneys. It could not be ruled out that these toxicological observations on animal organs could have been caused by the feed, which contained three different dosages of NK603. The European Food and Feed Safety Authority (EFSA) directed massive criticisms towards the two-year feeding trial that had been carried out by Séralini´s research team, and concluded that the report had great flaws and the conclusions drawn lacked scientific basis. Séralini and he´s coauthors responded to the criticism and argued that the two-year experiment was unique in it´s kind. The GMO-panel of EFSA maintained that the scientific standards were to poor to warrant a change in opinion; thus it approved of NK603 for use in food and feed. EFSA completely based its risk analysis on trials that had been performed by researchers with some connection to Monsanto. An evaluation of the two-year experiment that had been made by EU-member states was taken into account in the final EFSA review. At this point, the so called GRACE-project was initiated by the European Commission, whose goal was to investigate possible health risks associated with the consumption of genetically modified crops. Scientists within the GRACE-project analyzed the feeding trials that had been carried out with NK603 (Hammond et al. 2004, Spiroux de Vendömois et al. 2009, and Séralini et al. 2012), and concluded that all these reports had inferior scientific quality, ie. flaws. They argued further that it could be questioned why the GMO-panel of EFSA did not criticize earlier feeding trials that had been carried out with a similar method as sharply as they had criticized the two-year experiment. The purpose with this literature study is to assemble, contrast and critically analyze the existing knowledge basis, to assess whether the collective literature can detect risks to health that would be associated with using NK603 as food and feed. The literature study cannot establish whether GM-maize NK603 is a greater health hazard than other maize, because of a too limited number of trials and studies. It is of importance that researchers without financial or other connection to Monsanto or interest groups conduct further trials, for example by scientists in government-financed laboratories or at universities to further examine whether the consumption of NK603 could pose health risks in the long term. The feeding trials should have a longer duration than the three -months feeding trials that are customary today. Majs är en modern kulturväxt, som redan odlades för tio tusen år sedan, i Sydamerika och grödan härrör från teosinte, som har sitt ursprung i Mexico. Olika majshybrider har korsats med varandra för att ta fram sorter som ger en allt högre avkastning och detta har pågått sedan början av 1900-talet. För att göra odlingen effektivare så har majsplantor gjorts toleranta mot ogräsbekämpningsmedel. Gentekniken har gjort det möjligt att överföra en resistensgen mot glyfosat till majsceller och på detta vis tillverkas hela majsplantor med tolerans mot ogräsmedlet Roundup®. En genkanon användes när majs transformerades med en genkasett innehållande två kopior av genen som kodar för glyfosat-tolerans, EPSPS, och på så vis framställdes GM-majssorten NK603. Genkasetten i NK603 gör så att majsplantan kan bygga aromatiska aminosyror även när den utsätts för glyfosat, så att växten kan fortsätta bygga proteiner och leva vidare. EPSPS-transgenen i NK603 kommer ursprungligen från en bakterie. Försök som har gjorts av experter med koppling till Monsanto visar att GM-grödan NK603 är lika näringsrik som konventionell majs. Dessa experiment visade också att det inte innebär någon hälsorisk att konsumera livsmedel eller djurfoder som framställts av NK603. Ett franskt forskarteam utan koppling till Monsanto och under ledning av Séralini utförde ett två-årigt matningsförsök där råttor matades med NK603. Under detta experiment utvecklade djuren cancertumörer och fick bestående skador på njurar och lever. Det kunde inte uteslutas att de toxikologiska observationerna på djurens organ och vävnader berodde på fodret, som innehöll tre dosnivåer av NK603. Europeiska livsmedelssäkerhetsmyndigheten (EFSA) riktade massiv kritik mot det två-åriga experimentet som utfördes av Séralinis forskargrupp, och ansåg att det fanns stora brister i rapporten och att de slutsatser som drogs saknade vetenskaplig grund. Séralini och medförfattare svarade på kritiken och menade att det två-åriga försöket var unikt i sitt slag. EFSA:s GMO-panel ansåg fortfarande att den vetenskapliga standarden var för bristfällig för att de skulle ändra ståndpunkt, och därför godkände NK603 som mat och foder. EFSA baserade helt sin riskutvärdering på analys av försök som utförts av forskargrupper med anknytning till Monsanto. EU-medlemsländernas utvärdering av det två-åriga experimentet utgjorde ett underlag för denna slutgiltiga bedömning. Därefter startades det s.k. GRACE-projektet på uppdrag av den Europeiska Kommissionen, vars mål var att utreda möjliga hälsorisker vid konsumtion av genetiskt modifierade grödor. Forskare inom GRACE-projektet analyserade de matningsförsök som utförts med NK603 (Hammond et al. 2004, Spiroux de Vendömois et al. 2009, och Séralini et al. 2012), och ansåg att samtliga publikationer hade brister. De menade också att det kunde ifrågasättas varför EFSA:s GMO-panel inte kritiserade tidigare matningsförsök som gjorts med en liknande metod som det två-åriga experimentet lika skarpt. Syftet med denna litteraturstudie är att sammanställa, kontrastera och kritiskt granska den kunskapsbas som finns idag för att fastställa om den samlade litteraturen kan påvisa hälsorisker med användning av NK603 som föda eller foder. Litteraturstudien kommer inte fram till om GM-majs NK603 är mer hälsofarligt än annan majs på grund av ett alltför begränsat antal försök och studier. Det är av vikt att ytterligare studier genomförs av forskare utan ekonomisk anknytning till Monsanto eller intresseorganisationer, t ex forskare från statligt finansierade laboratorier eller universitet, för att vidare undersöka huruvida konsumtion av NK603 skulle kunna utgöra en hälsorisk på lång sikt. Matningsstudierna bör vara längre än de tre-månaders försök som har varit praxis fram till idag.

This study has examined how cooking affects the levels of the toxicantsaflatoxin, arsenic, lead, dioxins, cadmium, mercury, perfluorinatedcompounds and polybrominated diphenyl ethers in rice, potatoes and fish.Not every toxicant was examined for all three types of food, they were onlyexamined for those types of food where current levels of the toxicant in thattype of food are relevant from a risk assessment perspective. To determineif there is a danger of negative effects due to the exposure of thesetoxicants from food, articles from the Swedish National Food Agency andother scientific articles have been compiled. A minor experimentalsubstudy was also performed where rice bought in Uppsala was rinsed andboiled in different ways to see if that affected the residue levels of arsenic.The results of this study indicate that the levels of some toxic substancescan be lowered on a dry weight basis by cooking, and that this reduction isdependent on the cooking method used, the properties of the food andtoxin. The levels of cadmium and mercury were generally unchanged bycooking whereas the results for lead and perfluorinated compounds wereconflicting. Cooking can lover the levels of aflatoxin, arsenic, dioxins andpolybrominated diphenyl ethers on a dry weight basis. The effects ofcooking on toxicant levels should be considered when performing riskassessments, but further studies are needed to achieve a better basis for decision-making.

Montelius J (ed). Vetenskapligt underlag för hygieniska gränsvärden. 29. Arbete och Hälsa 2009;43(1):1-73. Göteborgs Universitet. Sammanställningar baserade på kritisk genomgång och värdering av de vetenskapliga fakta, vilka är relevanta som underlag för fastställande av hygieniskt gränsvärde. Volymen omfattar de underlag som avgivits från Kriteriegruppen för hygieniska gränsvärden under perioden oktober 2007 – juni 2008. An English version "Scientific Basis for Swedish Occupational Standards XXIX" will be published in Arbete och Hälsa 2009.

Aquatic sediments are of major importance for the cycling of environmental pollutants, acting as both sinks and secondary sources of contaminants to the ecosystem. Sediment-living organisms can affect the fate and transport of contaminants through activities like feeding and burrowing, collectively called bioturbation. Apart from high contaminant levels, the Baltic benthic ecosystem is affected by stressors such as eutrophication-induced anoxic conditions and invading alien species. The main objectives of this thesis were to determine the effects of bioturbation on contaminant fluxes in Baltic Sea sediments and to increase the understanding of how these other stressors act together upon contaminant fate in the benthic ecosystem. Bioturbation affected contaminants in a species-specific way. The native species Monoporeia affinis and Macoma balthica increased the incorporation of BDE-99 and Cd deposited on the sediment surface, enhancing their retention in the sediment. The invasive polychaete Marenzelleria sp. did not contribute to the incorporation of surface-deposited contaminants, however, significantly increased the release of contaminants back to the water column. Reoxygenation of anoxic laminated sediments and bioturbation by Marenzelleria increased the sediment-to-water flux of dissolved organic contaminants. When the bioturbation-driven release of PCB was compared to the release caused by physical sediment resuspension, results indicated that the continuous activities of benthic infauna can be just as, or even more, important than physical disturbance for the remobilization of sediment-bound contaminants. Bioaccumulation was significantly higher when contaminants were deposited associated to phytoplankton compared to lignin or sediment, suggesting that there are likely seasonal differences in the mobilization of contaminants in the benthic ecosystem. In summary, bioturbation is an important process influencing contaminant fate in Baltic Sea sediments, and the risk of remobilization of historically buried contaminants may increase with improved benthic redox conditions and the invasion of new deeper-digging species, such as Marenzelleria.

Ett pelagialprogram har tagits fram för övervakning i relativt opåverkade referensområden i kustvattentyperna 16 t.o.m.19 i Bottemhavet. Programmet bör kunna ligga till grund för uppföljning av internationella, nationella och regionala miljömål samt följa upp ekologisk status. Den rumsliga variationen samt mellanårsvariationen hos pelagiala variabler i Bottenhavsområdet har använts som utgångspunkt för att beräkna provtagningsbehovet. Det föreslagna programmet innebär att mellan 48 och 60 provtagningar årsperiod, varefter ekologisk status kan bedömas. Designen gör det möjligt att med 80 % säkerhet bedöma ekologisk status med mätdata som ligger minst 20 % från klassgränserna. Mätprogrammet är designat för provtagningar -årsperiod. Stationer har slumpats ut i de olika typerna, och förslag på årliga provtagningslokaler anges i rapporten. Eftersom djupet vid de olika stationerna varierar, bör de flesta pelagiala variablerna provtas vid ett diskret djup i övre delen av vattenmassan, t.ex. 1 m djup. Av vetenskapliga och ekonomiska skäl är det viktigt att pelagialprogrammet samordnas för hela Bottenhavet. För mjukbottenfauna bedöms det befintliga integrerade programmet för trendanalys i Bottenhavet kunna tillgodose Vattendirektivets behov för kontrollerande övervakning i distriktet. Detta under förutsättning att Sundsvallsbuktens program fortsätter och att de nya nationella och regionala provtagningsområdena i södra Bottenhavet (Gräsö) etableras och drivs. Dimensioneringen av nuvarande nationellt och regionalt bottenfaunaprogram och områdesövervakning men har även visat sig vara väl anpassat för bedömningar inom ramen för Vattendirektivet. Enligt bedömningsgrunden bör minst 5 stationer användas för klassning av ekologisk status. Dessa stationer måste dock inte ligga inom samma vattenförekomst, utan kan vara lokaliserade i angränsande vattenförekomster. Den ekologiska statusen för mjukbottenfauna i enskilda vattenförekomster klassas genom extrapolering med hjälp av data från närbelägna områden med liknande bottenmiljö och påverkansgrad. Befintlig fiskebeståndsövervakning föreslås fortlöpa för att möjliggöra uppföljning av förändringar. En utökning av antalet övervakningsområden föreslås dock för att upprätta minst ett referensområde per inre och yttre kustvattentyp. En kombination av stratifierad och slumpmässig övervakning av fiskebestånden enligt nuvarande strategi föreslås, där djupintervallen stratifieras medan stationerna slumpas ut i respektive djupintervall. Provfiske och provtagning för miljögiftsanalys av fisk bör samordnas till samma provtagningstillfälle. Vidare bör den modell för samfinansiering och samordning som idag tillämpas av kustlänen i Bottniska viken för övervakning av fiskbestånd, samt och miljögiftsövervakning av fisk, fortlöpa även framöver. De ämnen som ingår i det pågående nationella programmet för miljögifter i fisk bör mätas även i de nya föreslagna områdena. När EU:s dotterdirektiv för prioriterade ämnen är beslutat och Vattenmyndigheterna fastställt miljökvalitetsnormer för särskilda förorenande ämnen, bör en översyn göras och ytterligare ämnen som är aktuella för Bottenhavet införlivas i övervakningsprogrammet. Miljögiftsövervakning i fisk bedöms kunna mätas med ett maximalt avstånd på 75 km mellan stationsområdena. Bedömning och extrapolera mätvärdena. För samtliga delprogram har en grova uppskattningar av kostnader för genomförandet gjorts. Projektet är ett samarbete mellan Länsstyrelserna i Norrbotten, Västerbotten, Västernorrland och Gävleborg och Umeå Marina Forskningscentrum och finansieras av Naturvårdsverket.

Exposure to xenoestrogens during development has been shown to impair sexual differentiation in various species. The major aim of this thesis was to elucidate the respective roles of the two estrogen receptors ERα and ERβ in normal and disrupted differentiation of sex organs and copulatory behavior in the Japanese quail (Coturnix japonica). The expression of ERα mRNA was much stronger than that of ERβ mRNA in the gonads and Müllerian ducts (embryonic oviducts) in early embryos. By contrast, ERβ seemed to be predominantly expressed in regions of the embryonic brain that are associated with male sexual behavior. Embryos were exposed to the selective ERα agonists propyl-pyrazole-triol (PPT) and 16α-lactone-estradiol (16α-LE2). The estrogens 17β-estradiol (E2) and 17α-ethynylestradiol (EE2), which activate both ERα and ERβ, were used as positive controls. All substances impaired reproductive organ differentiation. The effects observed included oviductal malformations in females and partial development of oviducts in males. All substances also induced testis feminization (ovotestis) in male embryos. The male copulatory behavior was severely impaired by the positive controls but was unaffected by PPT and 16α-LE2 at doses that disrupted sex organ differentiation. A higher dose of 16α-LE2 significantly suppressed the behavior. However, it is possible that this effect was caused by cross-activation of ERβ. The substances also induced hepatic expression of mRNA encoding the egg-yolk proteins vitellogenin II and very low-density apolipoprotein II, which are commonly used as indicators of estrogen exposure. In conclusion, the results suggest that ERα is important for female reproductive organ differentiation. Excess activation of ERα by xenoestrogens impairs differentiation in both females and males and induces hepatic expression of egg-yolk proteins. The results also indicate that ERα alone cannot mediate demasculinization of male copulatory behavior in quail, although further studies are needed to test this hypothesis.

Chicken and Japanese quail are commonly used models in developmental and sex specific neuroendocrine research. There is relatively little known about the mechanisms behind their sex specific brain development, especially regarding the impact of the sex chromosomes (male: ZZ, female ZW) in relation to gonadal hormones. This thesis explores several aspects of these processes. Gene expression analysis with cDNA and Affymetrix arrays on brain tissue from both pre-gonadal embryos and embryos with differentiated gonads indicate a strong sex chromosomal presence in sexual dimorphic somatic tissue development in both chicken and Japanese quail. This sex chromosome pattern seems to remain in adult brain tissue. The data demonstrates that chicken males exhibit a significant level of Z-gene dosage compared to females in both somatic and germ line derived embryonic tissues. Several avian sex determination gene candidates (MHM non-coding RNA, DMRT1, HINTW, and HINTZ) were analyzed by real-time PCR. DMRT1 is dosage compensated in male brain tissue, in contrast to its reported gene dosage in male gonads. Early embryonic ethinylestradiol (EE2) exposure did not affect male or female neural gene expression patterns during later development. A peptidomics analysis on quail embryonic day 12 (ed12) and ed17 diencephalon by LC-MS identified over 60 endogenous peptides and analyzed the expression patterns for 38 of them with regard to age, sex and early EE2 exposure. There was a general upregulation between ed12 and ed17, but no clear sex effects were detected. Multivariate analysis indicates that EE2 exposed individuals differ from control individuals in a gender independent manner, and that Gonadotropin-inhibiting hormone related peptide 2 (GnIH-RP2) is a candidate for EE2 induced peptidomic alterations in male embryonic brain.

Förslag på ett samordnat miljöövervakningsprogram i Bottenvikens distrikt redovisas översiktligt i tabell 1a och 1b. Förslaget behandlar den kontrollerande övervakningen enligt ramdirektivet för vatten (Europaparlamentet och rådets direktiv 2000/60EG). Samordningen syftar till att kunna tillgodose nationella miljömålsrapporteringar och vattendirektivets rapporteringskrav med samma mätprogram. Det förutsätts att trendstationer i kustvatten finns i varje vattendistrikt. Vattentyp, huvudmynningsområde (HMYO) och vattenförekomst har utgjort rumsliga enheter som skall övervakas. Som precisionskrav för mätkvalitet har antagits att kunna upptäcka en skillnad på 2+ % mellan ett tillståndsvärde och klassgräns enligt bedömningsgrunderna. I praktiken har dock detta inte kunnat uppfyllas för samtliga ingående variabler. Kostnaden för ett års mätningar enligt föreslagen design i Bottenvikens vattendistrikt beräknas till 2 420 000 kr per år. Miljögifter står för 480 000 kr, mjukbottenfauna för 600 000 kr, kustbestånd för 440 000 kr och vattenmassa för 900 000 kr. Kostnader för dagens trendstationer inom vattenmassans övervakningsprogram ingår inte i dessa beräkningar. Detta program kostar idgag uppskattningsvis 2 miljoner. Den vetenskapliga grunden för förslaget redovisas i denna rapport. En blandning av stratifiering och slumpning av mätningar över det område som skall övervakas har visats vara den mest kostnadseffektiva strategin med god mätprecision. Den har tillämpats för vattenmassans variabler där provtagning kan ske över större delen av alla vattenförekomster i en vattentyp. För delprogrammen miljögifter i fisk, mjukbottenfauna och kustfisk gör kravet på lämpliga habitat för provtagning att avvikelser från strategin blir nödvändiga. Slumpning vid första provtagningstillfälle och återbesök har här istället tillämpats. Dimensionering av vattenmassans variabler baseras på en mätning av olika variablers variation inom Bottenvikens inre kustvatten. En erfarenhetsbaserad modifiering av beräknad provtagningsdimensionering har sedan gjorts, baserat på praktisk genomförbarhet och kostnadseffektivitet. Behovet av mätningar för vattenmassans variabler varierar relativt mycket, men har harmoniserats till mellan 48 och 96 mätningar per vattentyp under 3 år för inre kustvatten. För yttre kustvatten har antagits att variationen är hälften av den i inre. Programmets upplägg ger möjlighet till bättre skattning av mätinsats vartefter mätdata insamlas. Mjukbottenfauna behåller befintligt trendprogram då återkommande slumpning av stationer skulle kräva upprättande av nya lämpliga lokaler, vilket är kostsamt. Nuvarande stationsområden bedöms tillräckligt väl utgöra underlag för klassning av de inre vattentyperna i distriktet. Enskilda vattenförekomster klassas genom extrapolering från närmaste områden med mätdata och liknande bottenmiljö. En liknande bedömning och strategi har valts för övervakning av kustfiskbestånd. I projektet har miljögifter behandlats som en grupp utan åtskillnad av prioriterade ämnen och andra förorenande ämnen. Miljögifter som mäts i fisk bedöms kunna mätas på stationer med maximalt 75 km avstånd mellan varandra. Tillståndsbedömning görs för en hel vattentyp utifrån dessa mätningar genom inter- och extrapolering av erhållna mätvärden. Programförslag har inte kunnat göras för vattenväxter eftersom metod och bedömningsgrunder för detta inte är tillämpbara i Bottenviken. Detta pågår istället i ett separat projekt med Gävleborgs län som ansvarig. Morfologi har heller inte utretts i denna undersökning. Ämnesexperterna har gett förslag på design av program för bottenfauna, fiskbestånd och miljögifter omfattande hela distriktet, och samtliga fyra vattentyper. För pelagialvariabler har vi inom projektet gjort en särskild utredning av den rumsliga variationen som endast omfattar vattentypen Bottenvikens inre kustvatten. Upplägg av pelagialt program i Bottenvikens yttre kustvatten samt i Kvarkens inre och yttre kustvatten har gjorts genom expertbedömning utifrån erfarenheterna från Bottenvikens inre kustvatten.

The DDT metabolite 3-methylsulphonyl-DDE (3-MeSO2-DDE) induces cell death specifically in the adrenal cortex of mice after a cytochrome P45011B1 (CYP11B1)-catalysed bioactivation. This substance is not only an environmental pollutant, but also a suggested lead compound for an improved chemotherapy of adrenocortical carcinoma (ACC). The aim of the thesis was to further investigate this compound in terms of kinetics, cell death mechanisms and species differences. The pharmacokinetics of 3-MeSO2-DDE and the current drug for ACC, o,p’-DDD, was studied during 6 months following a single dose in minipigs. The elimination was slower for 3-MeSO2-DDE than for o,p’-DDD, indicated by a lower clearance and longer t½ in plasma and subcutaneous fat. Both substances remained in fat tissue during the whole study period. Unlike o,p’-DDD, 3-MeSO2-DDE was retained also in liver. The adequacy of the murine adrenocortical cell line Y-1 was evaluated for studies of adrenotoxic compounds. The Y-1 cells proved to be an appropriate test system for future mechanism studies, since CYP-catalysed irreversible binding, inhibited corticosterone production induced by 3-MeSO2-DDE and o,p’-DDD were successfully demonstrated. Cell death of 3-MeSO2-DDE in the mouse adrenal cortex was implied to be necrotic. Early apoptotic signalling (i.e. up-regulation of caspase-9) was observed, although it seemed to be interrupted by ATP-depletion and anti-apoptotic actions by heat shock protein 70, resulting in lack of activation of caspase-3. Using cultured adrenal tissue slices, two not previously studied species were examined ex vivo regarding adrenal binding of 3-MeSO2-[14C]DDE. Binding was found in the hamster adrenal cortex and in assumed cortical cells in the medulla, while the guinea pig adrenal was devoid of binding. This emphasises the species specificity in bioactivation of 3-MeSO2-DDE. The thesis forms a basis for further investigations in the human adrenocortical cell line H295R and provides new knowledge of importance for toxicological risk assessment of 3-MeSO2-DDE.

It is frequently argued that cannabinoids exert part of their analgesic and anti-inflammatory effects via activation of the cannabinoid CB1 receptor located on TRPV1-expressing primary sensory nerve fibres in peripheral tissues. However, we find no evidence of CB1 receptor immunoreactivity on nerve fibres in rat or mouse hindpaw skin and mesenteric artery. The CB1 receptor agonists anandamide and HU210 also fail to inhibit TRPV1-mediated calcitonin gene-related peptide (CGRP) release from primary sensory neurons in rat hindpaw skin and mesenteric artery. Therefore, this study do not support the general view that the analgesic and anti-inflammatory effects of CB1 receptor agonists are due to direct inhibition of TRPV1-expressing primary sensory nerve terminals in the periphery. Garlic contains a number of organosulphur compounds, including allicin and diallyl disulfide (DADS), some of which may contribute to its pungent and vasodilator properties. Our results show that raw garlic extract, allicin and DADS activate TRPA1 ion channels on primary sensory neurons in culture and nerve fibres in the vascular system. These findings highlight TRPA1 as a novel ion channel in the vascular system and provide novel pharmacological tools for investigating the role of this ion channel. Whether activation of TRPA1 in the vascular system explains the beneficial antihypertensive effect observed by garlic treatment remains to be shown. This study also expands our understanding of how TRPA1 is regulated on a molecular basis, which is of importance for development of novel drug therapies for pain, inflammation and vascular disease. The skin is a major sensory organ that contains a large number of nerves. The TRP ion channels TRPV2 and TRPM8 are expressed in the somatosensory nervous system in animals and are therefore likely to be expressed in humans as well. Fluorescence immunohistochemistry was used to identify these channels and compare their expression and distribution patterns with known neuronal markers of the sensory nervous system in skin from healthy volunteers and from individuals with a mutation in the gene encoding nerve growth factor beta (NGF?) that causes Norrbottnian congenital insensitivity to pain. This study shows for the first time the presence of TRPV2 and TRPM8 in sensory nerves in the human skin. TRPV2 and TRPM8 as well as TRPV1 immunoreactive nerve fibres are present in unmyelinated nerve fibres in epidermis and papillary dermis, in nerve bundles, and around blood vessels and hair follicles. In contrast to TRPV1, TRPV2 and TRPM8 are found mainly in the papillary dermis and seem to be restricted to peptidergic nerve fibres, of which the majority contains the sensory neuropeptides CGRP or SP. There is a substantial loss of nerve fibres containing TRPV1, TRPV2 and TRPM8 in skin from individuals with Norrbottnian congenital insensitivity to pain. Insight into the role of TRPV2 and TRPM8 in human skin may open new avenues for treatment of neuropathic pain and inflammatory skin diseases. Vad hade vi varit utan våra sinnen? Föreställ dig en värld utan att kunna se, höra, lukta, smaka och känna. Det är med hjälp av våra sinnen som kroppen kan känna vad som händer i vår omgivning. Ett av våra sinnen är smärtsinnet, som har till uppgift att varna oss för inre och yttre faror. Trots att smärta är den i särklass vanligaste orsaken till mänskligt lidande, så är kunskapen om de molekylära mekanismerna bakom dess uppkomst mycket bristfällig. Den vanligaste formen av smärta är nociceptiv och uppstår när olika typer av proteiner (jonkanaler) på smärtnerver (nociceptorer) ute i vävnaderna utsätts för kemisk, termisk eller mekanisk stimulering. En viktig sådan jonkanal är TRPV1 som förutom att aktiveras av pepparämnet kapsaicin också aktiveras av värme och sur miljö, tillstånd som bland annat kan ses vid inflammation. Andra potentiella angreppspunkter för läkemedelsbehandling är TRPA1 (senapsreceptorn), TRPM8 (mentolreceptorn) och TRPV2 (värmekänslig), som tillsammans med TRPV1 tillhör familjen TRP-kanaler. Dessa kanaler finns på primära sensoriska nerver (A?- och C-fibrer), som förutom att förmedla en signal till hjärnan om hotande vävnadsskada också deltar i regleringen av perifera organ, t.ex. genom att frisätta kärldilaterande substanser lokalt i vävnaden, och i olika reflexbågar av betydelse för funktionen i våra inre organ. Miktionsreflexen och hostreflexen är sådana viktiga reflexer. Det har föreslagits att den smärtstillande och antiinflammatoriska effekten av ?9-tetrahydrocannabinol från växten Cannabis sativa och liknande substanser delvis kan förklaras av att dessa ämnen via sin receptor (CB1) hämmar smärtnerver och deras frisättning av sensoriska neuropeptider lokalt ute i vävnaden. Hittills har inga immunohistokemiska studier övertygande visat att CB1 receptorn finns på primärsensoriska nerver, som också uttrycker TRPV1. I det första arbetet har vi därför använt immunohistokemi och funktionella metoder för att studera en tänkbar interaktion mellan dessa två receptorsystem i perifera sensoriska nerver. En viktig slutsats är att de antikroppar som har använts för att studera CB1 receptorn inte är tillförlitliga för att studera denna receptor i periferin. Arbetet visar också vikten av att konfirmera specifik antikroppsinbindning genom användandet av möss som saknar CB1 receptorn. De immunohistokemiska och funktionella resultaten ifrågasätter den allmänna uppfattningen att CB1 receptoragonister utövar sin perifera smärtstillande effekt genom att hämma TRPV1 i de primärsensoriska nerverna. I arbete två har vi visat att TRPA1 är den jonkanal som aktiveras av irriterande svavelhaltiga substanser från vitlök på de primärsensoriska nerverna. Dessa substanser utgör tillsammans med tidigare beskrivna TRPA1 agonister (isotiocyanater och kanelaldehyd) viktiga farmakologiska redskap för att förstå hur TRPA1 på molekylär nivå aktiveras av kemiskt irriterande substanser. Med immunohistokemisk analys av primärsensoriska nervcellskroppar i dorsalrotsgangliet finner vi att TRPA1 uttrycks i ungefär 22 % av alla nervceller. Vi visar också för första gången att TRPA1 finns uttryckt i kärlsystemet och att dess aktivering leder till frisättning av CGRP från primärsensoriska nerver i kärlväggen, vilket i sin tur leder till kärldilatation. Både immunohistokemi och funktionella studier på blodkärl tyder på att TRPA1 endast finns på en subpopulation av TRPV1-innehållande primärsensoriska nerver. Om denna grupp av nerver är inblandade i inflammatorisk smärta så kan TRPA1 vara en intressant angreppspunkt för nya smärtstillande läkemedel. Huden är kroppens största sensoriska organ. I huden finns rikligt med primärsensoriska nerver, som kan registrera beröring och den omgivande temperaturen. Huden skyddar oss mot yttre våld och fungerar också som en barriär för skadliga främmande ämnen. I det tredje arbetet har vi studerat TRP-kanaler i hud från människa. Vi visar för första gången att TRPM8 och TRPV2 finns lokaliserat till primärsensoriska nerver runt blodkärl och hårfolliklar samt i det yttersta hudlagret (överhuden). I detta arbete undersöker vi också hudprover från individer med en medfödd okänslighet för smärta på grund av en mutation i en viktig tillväxtfaktor för nerver. Nerver som uttrycker TRPM8, TRPV2 och TRPV1 saknas i huden hos dessa individer. Arbetet väcker intressanta frågor angående vilken roll som de mindre väl karakteriserade TRP-kanalerna TRPV2 och TRPM8 spelar vid inflammatoriska tillstånd i huden.

Developmental toxicology is an important part of preclinical drug toxicology as well as environmental toxicology. Assessing reproductive and developmental toxicity is especially expensive and time demanding, since at least two generations of animals are needed in the tests. In light of this there is a great need for alternative test methods in many areas of developmental toxicity testing. The complete set of RNA transcripts in any given organism is called the transcriptome. Proteomics refers to the study of the proteins in a given organism or cell population. The work of this thesis has focused on the use of high throughput screening methods in transcriptomics and proteomics to search for molecular markers of developmental toxicity. We have studied the global gene expression effects of the developmentally toxic substance valproic acid (VPA) using microarray technology. Several genes were found that display the same gene expression pattern in vivo using mouse embryos as the pattern seen in vitro using the embryocarcinoma cell line P19. Based on these observations, the gene Gja1 was suggested as one potential molecular marker of VPA induced developmental toxicity and potential marker of histone deacetylase (HDAC) inhibition in vitro. Using 2D-DIGE technology, which measures relative protein abundances, the effect of neonatal exposure to the flame retardant PBDE-99 was studied in mouse brain (cortex, hippocampus and striatum) 24 hr after exposure. Differentially expressed proteins in the cortex and the striatum indicate that PBDE-99 may alter neurite outgrowth. Finally, we have suggested several improvements in the use of the 2D-DIGE technology. Novel methods for normalizing data were presented, with several advantages compared to existing methods. We have presented a method named DEPPS that makes use of all identified proteins in a dataset to make comprehensive remarks about biological processes affected.

It is frequently argued that cannabinoids exert part of their analgesic and anti-inflammatory effects via activation of the cannabinoid CB1 receptor located on TRPV1-expressing primary sensory nerve fibres in peripheral tissues. However, we find no evidence of CB1 receptor immunoreactivity on nerve fibres in rat or mouse hindpaw skin and mesenteric artery. The CB1 receptor agonists anandamide and HU210 also fail to inhibit TRPV1-mediated calcitonin gene-related peptide (CGRP) release from primary sensory neurons in rat hindpaw skin and mesenteric artery. Therefore, this study do not support the general view that the analgesic and anti-inflammatory effects of CB1 receptor agonists are due to direct inhibition of TRPV1-expressing primary sensory nerve terminals in the periphery. Garlic contains a number of organosulphur compounds, including allicin and diallyl disulfide (DADS), some of which may contribute to its pungent and vasodilator properties. Our results show that raw garlic extract, allicin and DADS activate TRPA1 ion channels on primary sensory neurons in culture and nerve fibres in the vascular system. These findings highlight TRPA1 as a novel ion channel in the vascular system and provide novel pharmacological tools for investigating the role of this ion channel. Whether activation of TRPA1 in the vascular system explains the beneficial antihypertensive effect observed by garlic treatment remains to be shown. This study also expands our understanding of how TRPA1 is regulated on a molecular basis, which is of importance for development of novel drug therapies for pain, inflammation and vascular disease. The skin is a major sensory organ that contains a large number of nerves. The TRP ion channels TRPV2 and TRPM8 are expressed in the somatosensory nervous system in animals and are therefore likely to be expressed in humans as well. Fluorescence immunohistochemistry was used to identify these channels and compare their expression and distribution patterns with known neuronal markers of the sensory nervous system in skin from healthy volunteers and from individuals with a mutation in the gene encoding nerve growth factor beta (NGF?) that causes Norrbottnian congenital insensitivity to pain. This study shows for the first time the presence of TRPV2 and TRPM8 in sensory nerves in the human skin. TRPV2 and TRPM8 as well as TRPV1 immunoreactive nerve fibres are present in unmyelinated nerve fibres in epidermis and papillary dermis, in nerve bundles, and around blood vessels and hair follicles. In contrast to TRPV1, TRPV2 and TRPM8 are found mainly in the papillary dermis and seem to be restricted to peptidergic nerve fibres, of which the majority contains the sensory neuropeptides CGRP or SP. There is a substantial loss of nerve fibres containing TRPV1, TRPV2 and TRPM8 in skin from individuals with Norrbottnian congenital insensitivity to pain. Insight into the role of TRPV2 and TRPM8 in human skin may open new avenues for treatment of neuropathic pain and inflammatory skin diseases.

There is currently no clinically available drug with neuroprotective properties to limit the evolving cell death following e.g. stroke or traumatic brain injury. The mitochondrial permeability transition (mPT) is a potential pathological mechanism causing cell death in the CNS. As the name implies, the mPT is defined by a sudden increase in permeability of the inner mitochondrial membrane, whose normal impermeable state is fundamental for the bioenergetic function of mitochondria. The objective of the present studies was to characterize the mPT phenomenon in isolated rodent brain mitochondria. Mitochondria serve an important role in cellular calcium homeostasis and buffer transient increases in calcium, but mitochondrial calcium overload is also the prime trigger for mPT. In the present studies, we found that brain mitochondria readily undergo changes attributable to mPT induction such as swelling, loss of membrane potential, uncoupling of oxidative phosphorylation and respiratory inhibition. The mitochondrial generation of reactive oxygen species (ROS) was also increased following mPT, and mitochondria became permeable to NAD(H). Cyclosporin A (CsA) binds to the mitochondrial protein cyclophilin D (CypD) and can thereby inhibit mPT, an effect that is unrelated to its immunosuppressive action, and mPT in brain mitochondria was found to be highly sensitive to CsA inhibition. CsA has demonstrated prominent neuroprotective properties in several different animal models of neurological disease, and recent experiments subjecting mice lacking CypD to ischemia support the conclusion that the effect of CsA at least in this model is mediated by mPT inhibition. A library of CsA analogs was evaluated for mPT-inhibiting and ROS-reducing properties, and two newly developed non-immunosuppressive CsA analogs were found to be potent inhibitors of mPT already at nanomolar concentrations. Mitochondria take up free calcium ions but retain them as inactive calcium phosphate complexes in order to prevent mPT. We find that increasing the conductance of potassium increases the pH of the matrix and this enhances the mitochondrial buffering of calcium, probably by increasing the complexation of calcium. Drugs that inhibit mPT or indirectly prevent mPT by enhancing the mitochondrial complexation of calcium and thereby their resistance to calcium overload may therefore prove to be successful strategies in limiting accidental cell death in the CNS. Hjärnan är ett energikrävande organ och förbrukar ca 20% av blodets syre trots att den bara utgör 1-2% av kroppsvikten. Mitokondrien är den del av cellen där syre och näringsämnen förbränns till koldioxid och vatten, och mitokondrien kallas ofta för cellens kraftstation. Denna process, den så kallade cellandningen, är kopplad till produktion av den energirika molekylen ATP som sedan används till energikrävande processer i cellen. Mitokondriens inre delar (dess matrix) omsluts av ett inre veckat lipidmembran. Detta omsluts i sin tur av ett yttre lipidmembran (Fig 1.). Det yttre membranet innehåller många porer som släpper igenom små molekyler, medan innermembranet är helt tätt, eller impermeabelt, för vattenlösliga molekyler. Cellandningen, eller respirationen, i mitokondrien är en komplicerad process och den kräver just ett impermeabelt innermembran för att fungera. Näringsämnen bryts successivt ned i cellen till mindre beståndsdelar och i mitokondrien används den energi som finns lagrad i näringsämnena till att pumpa ut vätejoner (protoner) från mitokondriens matrix till utrymmet mellan inner- och yttermembranet. Eftersom innermembranet inte släpper igenom protoner leder detta till en skillnad i protonkoncentration (pH) över innermembranet, men också till en spänningsskillnad på grund av att protoner är laddade partiklar. Sammantaget utgör pH-skillnaden och spänningen en protondrivande kraft. Utpumpningen av protoner kan liknas vid en generator som alstrar kraft till en elektrisk krets. Den elektriska kraften i en krets kan användas för olika ändamål, t.ex. till att driva en motor. I mitokondrien används den protondrivande kraften främst för att omvandla molekylen ADP till ATP. Hjärnans celler kräver mycket ATP för att kunna fungera. En störning av mitokondriernas normala funktioner kan därför leda till att cellerna de finns i skadas eller dör. En allvarlig störning som kan leda till celldöd är mitokondriens permeabilitets-transition (mPT). Liksom namnet antyder innebär mPT en övergång, eller transition, från mitokondriens normala impermeabilitet till en plötslig permeabilitet, d.v.s. flera molekyler som normalt inte kan passera över mitokondriens innermembran kan plötsligt flöda fritt, däribland protoner. Liksom en kortslutning av en elektrisk krets, innebär mPT att den protondrivande kraften och därmed ATP-bildningen helt upphör. Eftersom mitokondriens matrix innehåller väldigt mycket proteiner leder också mPT till att vatten flödar in osmotiskt och att mitokondrien svullnar. Mitokondrien har också en viktig funktion i att buffra kalcium (Ca2+). Kalciumkoncentrationen inne i cellen är normalt väldigt låg, ca 10000 gånger lägre än koncentrationen utanför cellen, och tillfälliga höjningar kan aktivera flera olika processer. Kalcium är därför en viktig signalmolekyl som kan styra olika funktioner i cellen. För höga eller långvariga kalciumökningar kan dock vara mycket farligt för cellen, och då spelar mitokondriens förmåga att ta upp och lagra kalcium en viktig roll. I normala fall har mitokondrien stor kapacitet att lagra kalcium, men under situationer då t.ex. cellens energistatus är försämrat sjunker mitokondriens kapacitet att lagra kalcium och kalcium kan då istället orsaka att mitokondrien genomgår mPT. Medicinen cyclosporin A (CsA) förhindrar mPT genom att binda till proteinet cyclophilin D (CypD) i mitokondrien. CypD katalyserar en omvandling i mitokondriens innermembran som leder till mPT, och genom att hämma CypD kan CsA motverka att mitokondrien genomgår mPT. CsA har flera effekter i människokroppen och används idag för ett helt annat ändamål, nämligen immunförsvarshämning så att det t.ex. är möjligt att transplantera in främmande organ utan att de stöts bort. Om CsA kommer in i hjärnan är det kraftigt skyddande mot flera typer av hjärnskador. I djurförsök minskar t.ex. CsA den skada som orsakas efter att blodtillförseln tillfälligt stoppas till hela eller delar av hjärnan (så som sker vid stroke) eller efter de tryck och krosskador som sker vid en traumatisk hjärnskada. CsA har också visats förlänga överlevnaden i möss som har en neurodegenerativ sjukdom liknande ALS (amyotrofisk lateral skleros). Mycket av arbetet i denna avhandling bygger på hypotesen att den skyddande effekten av CsA vid olika hjärnskador delvis eller helt beror på förhindrandet av mPT. En del tidigare arbete har dock ifrågasatt att mPT verkligen finns eller har relevans i hjärnans mitokondrier eller att CsA har någon skyddande effekt. I de två första delarbetena undersökte vi om framrenade mitokondrier från hjärnvävnad genomgår mPT när de blir exponerade för kalcium. Vi undersökte dels mitokondrier vars cellandning var avstängd och där kalcium har en relativt direkt effekt på de molekylära strukturer som ligger bakom mPT, och dels respirerande mitokondrier som gavs näringsämnen och aktivt tog upp och buffrade kalcium. Under båda situationerna svullnade mitokondrierna till följd av kalcium vilket tyder på att de genomgick mPT. Svullnaden var beroende av dosen av kalcium, men då mitokondrierna svullnade var responsen genomgående d.v.s. det tycktes inte finnas några olika undergrupper av mitokondrier som svarade fundamentalt olika på kalcium. I respirerande mitokondrier kunde svullnaden avbrytas genom att binda upp givet kalcium, och mitokondrierna återfick då till stor del sitt tidigare utseende och sin spänning över innermembranet. CsA var kraftfullt skyddande mot mPT i mitokondrier vars cellandning var avstängd, och hade en liknande effekt i respirerande mitokondrier om ADP var närvarande. Om ADP inte tillsattes hade CsA en mindre effekt mot kalciuminducerad svullnad, men hade desto större effekt på att förbättra återhämtningen hos mitokondrier där kalcium bands upp. Slutsatserna från de första arbetena var att hjärnmitokondrier generellt kan genomgå mPT och att CsA utövar en skyddande verkan mot mPT. För att bättre kunna utvärdera om effekten av CsA i djurförsök beror på förhindrandet av mPT eller inte vore det önskvärt med mer specifika mPT-hämmare. För behandling av människor mot hjärnskador kan den immunförsvarshämmande effekten av CsA anses vara en biverkan. I det tredje delarbetet utvärderade vi två cyclosporinvarianter, NIM811 och UNIL025 (eller Debio-025), med hjälp av de metoder vi använde i de två första studierna. Både NIM811 och UNIL025 saknar immunförsvarshämmande verkan men är i övrigt strukturellt lika CsA. Vi fann att båda molekylerna förhindrade mPT på liknande sätt som CsA. Båda, men framför allt UNIL025, var också mer potenta än CsA, d.v.s. de förhindrade mPT vid lägre doser än CsA. Slutsatsen från det tredje delarbetet var att dessa molekyler är lovande farmaka både experimentellt för att bättre kunna undersöka mPT i celldödsprocesser men också förhoppningsvis som mer specifika läkemedel med mindre biverkningar hos människor. Upphörd energiproduktion från mitokondrier kan uppenbarligen skada en cell om den blir omfattande. En ytterligare orsak till att mitokondrien kan orsaka cellskada och celldöd tros vara genom produktion av reaktiva syreprodukter (begreppet fria radikaler används ofta som synonym). Eftersom syrgasomvandlingen sker i mitokondrien kan också reaktiva syreprodukter bildas här. Mitokondrien har dock också kraftfulla avgiftningssystem, och om mitokondrien under normala förhållanden verkligen producerar en större mängd reaktiva syreprodukter som kan skada cellen är omtvistat. Det har dock föreslagits att kalcium kan orsaka ökad produktion av reaktiva syreprodukter. I det fjärde delarbetet visade vi att mitokondrien genererar mer reaktiva syreprodukter efter att den genomgått mPT. Kalcium i sig utan att mitokondrien genomgick mPT hade dock ingen ökande effekt. Eftersom den protondrivande kraften upphör när mitokondrien genomgår mPT försvinner också mycket av drivkraften för att generera reaktiva syreprodukter. Å andra sidan försvinner också en viktig del av avgiftningssystemet eftersom detta också är beroende av den protondrivande kraften. Slutresultatet blir att nettoproduktionen av reaktiva syreprodukter ökar och detta kan i sin tur leda till ytterligare skada i cellen. I arbetet testade vi också ett tjugotal cyclosporin-analoger och fann att deras förmåga att förhindra kalciuminducerad svullnad korrelerade med förmågan att förhindra kalciuminducerad produktion av reaktiva syreprodukter. Mitokondrier isolerade från mänsklig levervävnad uppvisade också liknade resultat som mitokondrier från råttlever och hjärna. Slutsatsen från fjärde delarbetet var att mPT är en situation då mitokondrier kan generera patologiska nivåer av reaktiva syreprodukter. I de tidigare arbetena gav vi kalcium som en enstaka stor dos för att se om mitokondrierna genomgick mPT. I femte delarbetet gav vi istället kalcium som en långsam infusion. Därmed kunde vi noggrannare följa hur mitokondrierna klarade av att buffra kalcium. Genom att vid infusion av kalcium dels titta på hur mitokondrierna behåller kalcium och dels se hur de förbrukar syrgas kunde vi se att det som begränsar mitokondriens förmåga att buffra kalcium verkligen är mPT. En viktig observation var dock att det som reglerar mPT inte nödvändigtvis behöver ha en motsvarande effekt i hur mycket kalcium mitokondrien klarar av att buffra. Det som aktiverar mPT är fritt kalcium inne i mitokondrien, men när mitokondrien aktivt tar upp kalcium binder den upp det mesta i komplex med fosfat och det blir därmed inaktivt. Det som ligger bakom att mitokondrien kan binda upp kalcium är dess basiska miljö (högt pH). Detta står i motsats till regleringen av mPT i sig. I studier av hur mPT aktiveras när kalciumupptag är avstängt har en sur miljö (lågt pH) visat sig vara skyddande. Det som troligtvis är viktigast i kroppen är kombinationen av dessa effekter och då finner vi att betydelsen av komplexbildningen av kalcium överväger. I det femte delarbetet finner vi nämligen att ett basiskt matrix är väsentligt för att hjärnmitokondrier ska kunna binda upp kalcium och undvika mPT. Mitokondriens innermembran är också i normala fall impermeabelt för kalium (K+) som finns i hög koncentration inne i cellen. Det har dock föreslagits att en typ av kaliumkanaler (mitoKATP) finns i mitokondrien och att de kan öppnas vid kortvariga blodflödesrubbningar. Dessa kanaler ger ett läckage av kalium in till mitokondriens matrix och det tros kunna skydda mitokondrierna vid nya episoder av blodflödesbrist, även om mekanismen för den skyddande effekten är okänd. Vi finner att om vi ökar läckaget av kalium med hjälp av en kemikalie som transporterar kalium ökar hjärnmitokondriers förmåga att buffra kalcium (Ca2+). Detta tror vi beror på att matrix blir ytterligare basiskt p.g.a. en kompensationsmekanism för kaliumläckaget. Genom att göra matrix mer basiskt hålls nivån av fritt kalcium lågt och därmed minskas också risken att mPT aktiveras. Mitokondrien har även en viktig roll i de celldödsprocesser som är nödvändiga under t.ex. utvecklingen av hjärnan eller i organ där celler byts ut. Denna typ av celldöd innebär en ordnad sorti som sker utan att orsaka störningar kring den döende cellen. Denna process brukar kallas för programmerad celldöd eller apoptos. Mellan mitokondriens membran finns flera celldödsaktiverande proteiner. När de finns i mitokondrien är de antingen inaktiva eller har en annan funktion. Om de däremot läcker ut i resten av cellen, aktiverar de celldödsprogram som successivt bryter ned cellen. Vid aktivering av mPT och den svullnad som följer kan mitokondriens yttermembran spricka och dessa celldödsproteiner läcka ut. Men det finns andra mekanismer som kan orsaka att dessa proteiner läcker ut, och det har varit mycket omdebatterat vilken roll mPT kan ha i programmerad celldöd. Eftersom denna typ av celldöd är aktiv och kräver en bevarad energiproduktion kan inte alla mitokondrier genomgå mPT. Då blir följden istället att cellen förlorar sin intakta struktur och miljö, med följd att dess innehåll läcker ut och orsakar inflammation. Denna celldöd kallas för nekros. I celldödsprocesser som utvecklas efter akuta hjärnskador ser celldöden varken ut som nekros eller apoptos. Man kan tänka sig att en tillfällig mPT och svullnad av mitokondrien, så som den vi visar i andra delarbetet, eller mPT begränsat till en liten del av cellens mitokondrier kan starta långsammare celldödsprocesser som har inslag av energibrist, ökad produktion av reaktiva syreprodukter men även utsläpp av dödsproteiner. Dock tycks inte den rena formen av programmerad celldöd involvera mPT. Studier med läkemedel såsom CsA tyder på att mPT kan spela en viktig roll för hur celldöden utvecklas efter flera typer av akuta hjärnskador men även en del kroniska. Skadan kan därmed begränsas om man ger läkemedel som hämmar aktiveringen av mPT. Med hjälp av genetiskt modifierade djur som saknar CypD har man också kunnat bekräfta att mPT är ansvarig för mycket av den hjärnskada som utvecklas i en djurmodell som efterliknar stroke hos människor. Användning av CsA eller dess mer specifika analoger begränsas dock för närvarande av att de inte på ett enkelt sätt passerar in i hjärnan. Vid traumatisk hjärnskada är dock den barriär som håller CsA utanför hjärnvävnaden skadad och kliniska prövningar i människor har påbörjats för att undersöka om CsA kan hjälpa dessa patienter. Även vid den neurodegenerativa sjukdomen ALS planeras CsA att ges direkt in till centrala nervsystemet i hopp om att minska sjukdomstakten.

Objective: To explore the long-term course and to study factors of potential relevance for the treatment and rehabilitation process of patients with schizophrenia and schizophrenia-like disorders. Specific issues concerned cognitive reduction, tardive dyskinesia (TD), prolactin-induced side effects, remission and lack of insight. Method: A naturalistic multicenter study of 225 patients, diagnosed with schizophrenia or schizophrenia-related psychotic disorders and treated with risperidone at study entry, of whom 166 participated in a 5 year longitudinal extension of the original study. Patients were assessed annually with respect to relevant background and clinical factors. Specific to the study is the extended use of parallel patient and clinician ratings. Results: The setting of the main study seem to have resulted in an extremely low attrition rate and high objective drug treatment adherence. Patients were much more apt at self-rating symptoms, global illness and side-effects than expected. Having had many previous acute episodes was associated with more pronounced cognitive reduction. TD was not common, associated with an extra magnitude of cognitive slowing and appeared to be only partly drug related. High levels of prolactin could not be linked to any side effects. Remission was not attained by 40% of the patients. Remission reflected clinicians? but not patients? ratings of symptoms and was linked to social outcome but not to cognition. One third of the patients had a clinically significant lack of insight, which was associated with low premorbid IQ and with executive problems. Conclusions: The extended use of parallel ratings by clinicians and patients, and the focus on optimizing drug treatment appear to have fostered an unusual degree of patient involvement in their own treatment and thereby excellent treatment adherence. These features can be implemented in routine clinical management as a ?small steps in the right direction? strategy. To attain cure we need a grand break-through in our understanding of the disease. Schizofreni är en kronisk och handikappande sjukdom som karakteriseras av allvarliga men fluktuerande symtom, med återkommande akuta episoder. Sjukdomen är förknippad med reducerad kognitiv och social funktionsförmåga. Patienterna vilka i regel insjuknar i unga år, bibehåller vanligtvis kvarstående restsymtom och därmed associerade stigma fram till ålderdomen. Det övergripande målet för behandlingen av schizofreni och schizofreni-liknande sjukdomstillstånd bör vara att försöka förbättra den sociala och den kognitiva funktionen, och därvid sträva efter att patienten kan fungera i arbete eller annan meningsfull sysselsättning och upprätthålla sociala kontakter. Med nuvarande standardbehandling är behandlingsresultaten tyvärr nedslående, vilket är tragiskt då det finns vetenskaplig evidens för effektiv behandling som avsevärt förbättrar behandlingsutfallet. Behandling med dopaminhämmande läkemedel är den självklara hörnstenen i terapin av denna svåra sjukdom, under såväl akuta som mer stillsamma skeden i sjukdomsförloppet. Akuta återfallsepisoder varar som regel bara några veckor, men andra symtom och sjukdomstecken kvarstår oftast i åtskilliga decennier. Framförallt gäller detta de s.k. ?negativa symtomen? som främst manifesterar sig som tillbakadragenhet, passivitet och känslomässig avtrubbning med åtföljande bristande social funktionsförmåga, samt den nedsatta kognitiva förmågan. Läkemedelsbehandling har vanligtvis god effekt på de s.k. ?positiva symtomen? (tankestörningar, hallucinationer, vanföreställningar) som är framträdande ffa under de akuta faserna och som typiskt förknippas med psykossjukdomar. Den gängse behandlingen med antipsykotika är emellertid betydligt mindre effektiv mot de negativa och kognitiva symtom som dominerar under de ?icke-akuta? ibland decennielånga perioderna mellan de akuta episoderna. Icke desto mindre finns det massivt vetenskapligt stöd för att en fortsatt antipsykotisk behandling behövs även under dessa perioder för att undvika återfall och i någon mån påverka kvarstående symtom. Eftersom dessa läkemedel har många biverkningar, både oangenäma och ibland plågsamma, så är behandlingsföljsamheten förståeligt nog dålig och återfall mer regel än undantag. I patientens perspektiv är motståndet mot att ta läkemedel naturligt under de faser då symtomen är mer ?vilande? och särskilt i ljuset av att behandlingsfokus traditionellt är riktat mot de symtom som karakteriserar det akuta skedet, vilka ju också är tydliga och ibland mycket störande för andra människor. Med syftet att undersöka långtidsförloppet av schizofreni och liknande psykossjukdomar och lära mer om vilka faktorer som kan tänkas vara relevanta för behandlingen och rehabiliteringen så startade vi en 5-årig uppföljningsstudie av 166 patienter som initialt alla var behandlade med risperidon, ett av de allra första bland de som ibland kallas den nya generationen antipsykosläkemedel. Av dessa patienter kunde hela två tredjedelar följas under hela 5-årsperioden vilket är exceptionellt många i vetenskapliga studier av patienter med denna typ av sjukdomar. Patienterna undersöktes och skattades avseende relevanta bakgrundsfaktorer, sjukdomsgrad, symtom, läkemedelsbiverkningar & behandlingsföljsamhet och två av tre patienter genomgick en omfattande datoriserad kognitiv testning minst en gång. Vad som också är specifikt för denna studie är det konsekventa användandet av ?parallella? skattningsinstrument (utförda av både behandlande klinikern och patienten) för bedömning av viktiga kliniska variabler. Detta gör det möjligt att utvärdera i vilken grad deras uppfattningar skiljer sig åt men är också ett sätt att göra patienten mer delaktig i behandlingsplaneringen. Att schizofrenipatienter är kognitivt försämrade noterades av Kraepelin vid förra sekelskiftet, men har sedan förbisetts under största delen av 1900-talet och inte ansetts viktigt förrän på 1990-talet. I tidigare studier som vår forskargrupp har genomfört har vi noterat att vissa kognitiva domäner påverkas mer än andra hos patienter med schizofreni och att graden av försämring tycks ha mer att göra med hur många akuta sjukdomsepisoder patienten haft än med någon annan klinisk variabel. För att undersöka detta närmare utförde vi den förstudie som är redovisad i Artikel I i denna avhandling. I den studien ingick 35 av de patienter som genomgick en komplett kognitiv testning. Vi använde oss av skolbetygen från grundskolan för att få ett mått på patienternas kognitiva förmåga innan de blev sjuka. Därefter gick vi igenom deras sjukhistoria och registrerade hur många sjukdomsepisoder de hade haft sedan de insjuknade första gången. Vi jämförde deras nuvarande test-prestation med den beräknade premorbida nivån för att få ett mått på graden av kognitiv försämring, och fann i linje med vår hypotes att patienterna som haft många akuta episoder var de som hade försämrats mest jämfört med sina utgångsvärden. Detta syntes tydligast i tester där det är viktigt att ha en hög beredskap att svara på stimuli, bl.a. olika reaktionstidstester. Tänkbart är att de akuta episoderna vid en psykossjukdom har någon form av toxisk effekt på nervsystemet. Allmänt kan sägas att detta är ett kontroversiellt fynd, om än i linje med vad många inom den psykiatriska vården tycker sig ha observerat., och med vad som har skrivits i psykiatriläroböcker, utan att för den skull ha några referenser till vetenskapliga studier. Avhandlingens huvuddel handlar om faktorer av vikt för det kliniska patient-omhändertagandet: två typer av läkemedelsbiverkningar: (tardiv dyskinesi och förhöjd nivå av könshormonet prolaktin), remission som delmål för behandlingsarbetet och den brist på insikt som är ett vanligt fenomen vid psykossjukdomar och som ofta leder till dålig behandlingsföljsamhet? Tardiv dyskinesi (TD) brukar ses som en fruktad och handikappande biverkan till behandling med antipsykotiska läkemedel som eventuellt är irreversibel. Men orsakerna är fortfarande oklara, och det rapporteras att TD existerade även innan de antipsykotiska läkemedlen kom på 1950-talet. Den långa uppföljningstiden i vår studie har erbjudit en unik möjlighet att studera förekomsten av dessa ofrivilliga rörelser över tid och vår analys ifrågasätter den gängse bilden så tillvida att förloppet är betydligt mer fluktuerande snarare än irreversibelt, och ej så tydligt kopplat till läkemedel som man har antagit. TD kan ibland vara ett motoriskt symtom som ingår i schizofrenisjukdomen. Dessutom fann vi TD vara kopplat till nedsatta kognitiva prestationer av samma slag som vi iakttog hos de patienter som haft många akuta psykosepisoder (subkortikal demens). Detta är i linje med hypotesen att TD beror på läkemedelsbetingade eller sjukdomsutlösta skador på dopaminsystemet i hjärnans basala ganglier. Någon korrelation mellan en förhöjd serumnivå av Prolaktin (inducerad av dopaminhämmande läkemedel) och sexuella eller andra biverkningar kunde vi inte finna i denna patientkohort trots att plasmanivåerna vid studiestart var mångfalt över normvärdena hos både män och kvinnor. Efter några års behandling tenderade nivåerna att minska ner mot normalområdet. Remission är ett begrepp som utvecklats inom somatisk medicin. Avsikten är att specificera att ett delmål i behandlingen uppnåtts, vilket är en förutsättning för planeringen av den fortsatta behandlingen. Inom psykiatrin har detta begrepp definierats helt nyligen av en internationell expertgrupp. Det finns därför anledning att undersöka hur denna definition fungerar under långtidsbehandling. Definitionen omfattar ett symtomkriterium (förbättring så att man inte har högre symtomnivå än ?lindrig?, skalvärde 3, på åtta av delskalorna i skattningsinstrumentet PANSS) och ett förloppskriterium (förbättringen är stabil under minst sex månader). Av de åtta delskalorna avser tre av dem positiva symtom, två avser desorganisationsssymtom och tre avser negativa symtom. Symtomatisk remission, som inte väger in tidskriteriet, kallas i engelsk text ofta resolution. Vi fann att 40% av schizofrenipatienterna befann sig i resolution vid ingång i studien och att denna andel ökade till 60% under de tre sista åren av uppföljningen, inklusive stabilitet i den symtomatiska remissionen under 12 månader. Den genomsnittliga sjukdomstiden före ingång i studien var drygt tio år ? omhändertagandet under studiens gång, inklusive användningen av atypiska antipsykosläkemedel, tycks alltså ha ökat andelen patienter i remission. Dock var det åtskilliga patienter som hade ett flukterande förlopp, ömsom i remission, ömsom med ökad symtomnivå mätt med de åtta PANSS-subskalorna. Även i ett patientmaterial med i huvudsak kroniska sjukdomsbilder fluktuerar sjukdomen ? man kan inte slå sig till ro med att ha uppnått ett delmål för behandlingen. Patienterna behöver långa uppföljningstider och så täta kontakter att försämringar kan identifieras tidigt och åtgärder vidtas. Bristande sjukdomsinsikt karakteriserade 60% av patienterna med typisk schizofreni vid ingång i studien. Bristande sjukdomsinsikt var mindre vanlig bland patienter med schizofreniliknande syndrom. Under studiens gång ökade andelen schizofrena patienter med tillfredsställande insikt till 60%, i linje med att många andra mått på behandlingsutfall förbättrades (t.ex. remission) och trots att symtomnivå och allmän funktionsförmåga var konstant. Patienter med bristande insikt hade också större svårigheter att bedöma sig själva och sitt eget tillstånd i vissa men inte alla avseenden. Detta skulle man kunna använda för att objektivera bedömningar av bristande insikt och därmed nedsatt autonomi (alternativet är annars att acceptera en klinisk global bedömning av insikt så som detta operationaliseras i PANSS-skalan). En ökad säkerhet i bedömningen av nedsatt autonomi är önskvärd för att motivera tvångsåtgärder av det slag som definieras i den kommande lagen om öppenvård med särskilda villkor. Vi fann att bristande insikt var kopplad dels med en premorbid riskfaktor, låg allmänbegåvning, och dels med sjukdomsframkallade specifika kognitiva svårigheter (exekutiva problem). För patienter med låg premorbid IQ bör problemet med bristande insikt kunna reduceras genom bättre pedagogik i förhållande till patient och nätverk i samband med sjukdomsdebuten. De exekutiva problemen kan vi inte behandla direkt men det finns metoder utvecklade inom hjärnskaderehabilitering och barnhabilitering, såväl som ADHD-behandling som fungerar. Det är på många sätt märkligt att sådana metoder inte alls används i behandlingen av patienter med schizofreni. Behandlingsföljsamheten till läkemedlet risperidon kunde mätas i vår studie genom årliga blodprover, en mycket säkrare metod än de indirekta metoder som vanligen används. Följsamheten var extremt hög under alla år, klart över 90%. Vi tolkar detta som en konsekvens av studiens allmänna uppläggning (som man kan se som i många avseenden bättre än ?standardbehandling?, bl.a. genom att deltagande kliniker var engagerade (annars hade de inte deltagit) och kunniga i psykofarmakologi (samma argument), och att patienterna på ett tydligt sätt inbjöds att delta i bedömningarna a sitt eget tillstånd, bl.a. symtom och biverkningar. Detta bör ha ökat känslan av faktisk delaktighet i behandlingsplaneringen och kanske är en delförklaring till den förbättring i insikt som vi kunde registrera under studiens gång. En allmän sammanfattande slutsats av detta projekt är att alltmedan vi väntar på en vetenskapligt genombrott i paritet med när Arvid Carlsson upptäckte dopaminet, så finns det många små steg vi kan ta i riktning mot att förbättra möjligheterna för människor med psykossjukdomar att få ett bättre liv. Det handlar om fortsatt klinisk forskning, men lika viktigt är att i större utsträckning tillämpa de relativt enkla metoder som sannolikt skulle förbättra behandlingsresultaten avsevärt, om de bara hade använts...

Generation of DNA damage is regarded to be an important initial event in the development cancer. Consequently, a battery of tests have been developed to detect different types of genotoxic effects in order to be able to predict the potential genotoxicity and mutagenicity of chemicals, including both pharmaceutical drugs and various types of environmental and occupational agents, as well as dietary factors. The aim of this thesis was to evaluate whether the combination of the comet assay and the extended-term cultures of human lymphocytes (ETC) can be used as an alternative in vitro system to more commonly used transformed mammalian cell lines, and primary cell cultures from humans, when testing the potential genotoxicity of chemicals. Using the comet assay, a panel of reference compounds showed that the ETC were found to detect the DNA-damaging effects with no remarkable difference to what has been reported in other cell types. Moreover, in comparison with a well-established rodent cell line, the mouse lymphoma L5178Y cells, the ETC showed similar sensitivity to the DNA damaging effects of the genotoxic agents hydrogen peroxide and catechol. Although there was an interindividual variation in induced DNA damage and the subsequent repair when using ETC from different blood donors, it did not seem to be of crucial importance for the identification of DNA-damaging agents. The demonstrated difference in sensitivity to catechol-induced DNA damage between freshly isolated peripheral lymphocytes and ETC may very well be due to their different proliferative status but despite this difference, both in vitro systems were able to identify catechol as a DNA-damaging agent at the same concentration. Based on these results, it is proposed that the ETC and the comet assay are a useful combination when testing for the potential DNA damaging effects of chemicals. Representing easily cultivated cells possessing the normal human karyotype, where one blood sample can be used for numerous experiments performed over a long time, extended-term cultures appear to be a useful alternative, both to transformed mammalian cell lines, and primary cell cultures from humans. In fact, the extended-term lymphocytes, with or without S9 and/or lesion specific DNA repair enzymes, should be used more frequently when screening for the potential genotoxicity of chemicals.

Endothelin is a vasoactive peptide that exerts its effect through two receptors; the endothelin type A (ETA) and type B (ETB) receptor. The contractile ETA receptor is localized on smooth muscle cells in the vascular wall, while the ETB receptors are mainly situated on endothelial cells, mediating vasodilatation. The endothelin system is involved in several pathophysiological conditions, such as atherosclerosis and ischemic stroke. Previous studies have shown an upregulation of contractile ETB receptors in the ipsilateral middle cerebral artery (MCA) after experimental focal ischemia and a similar upregulation is also seen after organ culture of MCA. Furthermore, studies have shown an involvement of protein kinase C (PKC) and extracellular signal-regulated kinases (ERK) 1/2 in ischemia. The aim of this thesis was to further elucidate the mechanisms underlying this receptor upregulation process, both in experimental ischemia and in organ culture of rat MCA. The results from the organ culture studies (paper I-III) show that the ETB receptor upregulation is time-dependent, reaching a maximum after 24 hours of organ culture. By adding inhibitors of PKC and ERK1/2 pathways to the culture medium, the ETB receptor upregulation was attenuated. In the experimental model of ischemia (paper IV-V), we administered PKC and ERK1/2 inhibitors to the rats in conjuction with the ischemic insult. Both inhibitors diminished the ETB receptor responses, as well as decreasing brain damage and improving neurological function. In conclusion, the results of this thesis may provide a new perspective on possible mechanisms of actions of PKC and ERK in cerebral ischemia.

The nasal passages are constantly exposed to both air- and bloodborne foreign compounds. In particular, the olfactory mucosa is demonstrated to be susceptible to a variety of drugs and chemicals. In this thesis, mechanisms involved in tissue-selective toxicity in the olfactory mucosa of rodents have been investigated using the olfactory toxicant 2,6-dichlorophenyl methylsulphone (2,6-diClPh-MeSO2) as a model compound. Comparative studies were performed with the non-toxic 2,5-dichlorophenyl methylsulphone (2,5-diClPh-MeSO2) and the reasons for the strikingly different toxicity were investigated. A strong bioactivation and protein adduction of 2,6-diClPh-MeSO2 in olfactory microsomes and S9-fractions of rodents was demonstrated. In contrast, no significant metabolic activation of 2,5-diClPh-MeSO2 was observed and the bioactivation in the liver for both chlorinated isomers was negligible. In vitro studies with recombinant yeast cell microsomes expressing mouse cytochrome P450 2A5 (CYP2A5) demonstrated a metabolic activation of 2,6-diClPh-MeSO2. The 2,6-diClPh-MeSO2-induced lesions and CYP2A5 expression preferentially occurred in Bowman’s glands and sustentacular cells of the olfactory mucosa. A significant depletion of glutathione (GSH) in the olfactory mucosa was demonstrated in vivo, while no changes were observed in the liver. There was a rapid induction of the endoplasmic reticulum (ER)-specific chaperone Grp78, activation of the ER-specific caspase-12 and the downstream caspase-3 in the Bowman’s glands. Electron microscopy revealed swelling of ER and mitochondria and a lost integrity of the Bowman’s glands. Based on these results, the proposed mechanism for 2,6-diClPh-MeSO2-induced toxicity in the olfactory mucosa is bioactivation by CYP2A5 into a reactive intermediate causing protein adduction and GSH-depletion. This is initiating a sequence of downstream events of ER-stress, changes in ion homeostasis, ultrastructural organelle disruption and apoptotic signalling. In spite of the initial apoptotic signals, the terminal phase of apoptosis seemed to be blocked and necrotic features occurred. The predominant expression of CYP2A5 in the olfactory mucosa is proposed to play a key role for the tissue- and cell-specific toxicity induced by 2,6-diClPh-MeSO2.

The ß-carbolines norharman and harman structurally resemble the synthetic compound 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) that is known for its ability to damage neuromelanin-containing dopaminergic neurons of the substantia nigra and thereby induce parkinsonism. MPTP is, however, not normally present in the environment whereas the ß-carbolines are present in cooked food and tobacco smoke. In this thesis it was demonstrated that norharman and harman had affinity to melanin and were retained in neuromelanin-containing neurons of frogs up to 30 days post-injection (the longest survival time examined). It was also demonstrated that norharman induced neurodegeneration, activation of glia cells and motor impairment in mice. Furthermore, this compound induced ER stress and cell death in PC12 cells. An in vitro model of dopamine melanin-loaded PC12 cells was developed in order to study the effect of melanin on norharman-induced toxicity. In this model, melanin seemed to attenuate toxicity induced by low concentrations of norharman. After exposure to the highest concentration of norharman, melanin clusters were disaggregated and there was an increased expression of stress proteins and caspases-3, known to be involved in apoptosis. The polycyclic aromatic hydrocarbon, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene was demonstrated to have a CYP1A1-dependent localization in endothelial cells in the choroid plexus, in the veins in the leptomeninges and in the cerebral veins of mice pre-treated with CYP1-inducers. These results demonstrate that the distribution of environmental compounds could be influenced by the presence of neuromelanin and expression of CYP enzymes in the brain and that norharman may induce neurotoxic effects in vivo and in vitro.

Heavy metals polluting our environment cause concern for developing organisms. Among them, cadmium with extremely slow elimination from the body, causes lower birth weight in humans but has not been classify as a human teratogen. Studies in different laboratory animals have shown that cadmium indeed is a potent teratogen. Exposure to cadmium during early mouse embryonic stages (e.g. day 7-8 post-coitus) interferes with the closure of the anterior neural pore producing exencephalic embryos. The underlying mechanisms are not understood, but the heavy accumulation of cadmium in extra- and intraembryonic endoderm and chorioallantoic placenta, however not in the neuroepithelium, suggests that the effects on neural tube closure is due to indirect mechanisms. In this thesis, the disruption in the mouse embryo at the time of neural tube closure of the hierarchies of some signalling pathways and gene regulatory networks that control embryonic development has been studied after cadmium exposure. Cadmium was shown to cause DNA damage as measured by Comet assay, and to activate genes and proteins in the apoptotic pathways (p53, p21, Bcl-2, Bax, and caspase-3), increasing the number of apoptotic cells mostly in areas of physiological cell death, especially in the neuroepithelium. Many of these effects could be reversed by zinc pre-treatment, known to counteract the teratogenic effect of cadmium. Cadmium was also shown to affect Zn-transport and –regulatory proteins in the embryo, but perhaps more importantly in yolk sac placenta, and in the decidua (ZnT-1, MT-I, and ZIP-4). Using gene arrays, cadmium was found to considerably affect gene expression of rather few genes, such as those of metallothioneins and stress-related proteins, supporting in principle an extraembryonic site of action of cadmium. In addition, a number of genes expressed in the anterior visceral endoderm (Hesx1, HNF3β, Cerl, Otx2 and Sox2) where cadmium accumulates, and known to signal to the anterior neuroepithelium, was affected by cadmium. This finding may suggest a new principle for chemical teratogenesis.

The present thesis aimed to examine how ischemic stroke affects the vascular endothelin and angiotensin systems in cerebral arteries. To study vascular receptor changes in ischemic stroke transient focal ischemia was induced in rats. In addition, rat cerebral arteries and arterial smooth muscle cells were cultured for further analysis of cerebrovascular receptor regulation. For functional studies of cerebral arteries, sensitive myographs were used. mRNA levels were quantitatively measured by real time PCR and protein density was studied by immunohistochemistry. Main results: 1. Ischemic stroke in rat induces a contractile endothelin ET(B) receptor mediated response in the ipsilateral middle cerebral artery (MCA), which is accompanied by an increased expression of ET(B) receptors. 2. Organ culture of rat MCAs induces a time-dependent upregulation of contractile ET(B) receptors. The phenomenon is due to de novo transcription of the receptors and is partly dependent on PKC. 3. bFGF increases the ET(A) and ET(B) receptor mRNA expression in rat cerebral smooth muscle cells. 4. TNF-alpha and EGF can potentiate the ET(B) receptor mediated contraction in the rat MCA, whereas bFGF enhances the maximal ET(A) receptor mediated contraction and increases the mRNA and protein levels for the ET(B) receptors. 5. Ischemic stroke in rat enhances the contractile response to angiotensin II in the ipsilateral MCA. This contraction is mediated by angiotensin AT1 receptors. In addition the mRNA levels for angiotensin converting enzyme were increased, which may suggest an enhanced production of angiotensin II. 6. A low dose of the AT1 receptor blocker candesartan (0.05 mg/kg and day) in the acute phase of ischemic stroke can decrease the size of brain damage significantly. Our hypothesis suggests that ischemic stroke can activate contractile mediators in cerebral arteries, and that this phenomenon may be detrimental if it implies a decreased perfusion of the already ischemic hemisphere. The present thesis confirms that there is indeed an increased ET(B) and AT1 receptor mediated contraction in the ipsilateral MCA after ischemic stroke. Stroke är en vanlig och mycket allvarlig form av hjärt-kärlsjukdom som uppkommer på grund av försämrat blodflöde i en del av hjärnan. Eftersom hjärnan är extremt beroende av kontinuerlig tillförsel av syre och näringsämnen leder tillståndet snabbt till hjärnskada. Det finns tre typer av stroke; hjärninfarkt, hjärnblödning och subaraknoidalblödning (blödning under en hjärnhinna), varav hjärninfarkt står för omkring 88 % av fallen. Trots intensiv forskning finns det ännu mycket få behandlingsalternativ som fungerar på människor, varför ämnet är angeläget. Avhandlingen du håller i din hand fokuserar på hjärninfarkt, och hur sjukdomen påverkar hjärnans blodkärl. Vår hypotes är att hjärninfarkt ökar blodkärlens förmåga att dra ihop sig (kontrahera) och att detta kan orsaka en större hjärnskada om det innebär ett försämrat blodflöde i den redan strokedrabbade hjärnan. Vi har koncentrerat de inkluderade studierna till två cirkulerande ämnen, endotelin och angiotensin, som båda kan orsaka kraftig kontraktion av blodkärl då de binder till speciella receptorer i blodkärlsväggarna. För att studera blodkärlsförändringar vid hjärninfarkt har vi valt att inducera stroke på råtta, och vi har även odlat hjärnblodkärl och blodkärlsceller från råtta vid 37° C som modeller för att mer ingående kunna studera receptorförändringar i hjärnans blodkärl. 8.1. Endotelinreceptor-reglering Två olika sorters endotelinreceptorer förmedlar de huvudsakliga effekterna av endotelin; ETA och ETB. När endotelin binder till ETA-receptorer i blodkärl hos friska djur och människor kontraherar kärlen, medan kärlen utvidgar sig när endotelin binder till ETB-receptorer. Det har dock visat sig att olika sjukdomstillstånd kan orsaka en uppkomst av kontraktila ETB-receptorer. I avhandlingens första studie demonstrerar vi att detta är fallet även vid experimentell hjärninfarkt. Vi observerade en uppkomst av kontraktila ETB-receptorer i hjärnans högra mediaartär 48 timmar efter att hjärninfarkt inducerats i höger hjärnhalva, ett fenomen som inte förekom i den vänstra hjärnhalvans mediaartär eller i basilarisartären ? ett hjärnkärl längre bort från skadan. Fenomenet var alltså relativt lokalt. ETA-receptorernas funktion var inte påverkad vid tidpunkten i fråga. I en följande endotelinstudie visade vi att en uppkomst av kontraktila ETB-receptorer, liknande den vid hjärninfarkt, sker då råttans mediaartär odlas vid 37° C i minst 12 timmar. Denna uppkomst har sitt ursprung redan på gen-nivå i artärens celler, och en molekyl inuti cellen som heter proteinkinas C verkar vara involverad i ?igångsättningen? av skeendet. Mekanismen kan därför vara intressant ur terapeutisk synpunkt vid hjärninfarkt. Två andra studier i avhandlingen visar att proteiner involverade i kärltillväxt och inflammation också kan påverka endotelinreceptorerna i råttans mediaartär. Detta är av intresse eftersom både kärltillväxt och inflammation ingår i sjukdomsbilden vid stroke. Även här har vi alltså möjliga mål för nya läkemedel. 8.2. Angiotensinreceptor-reglering Liksom endotelin binder angiotensin huvudsakligen till två receptortyper, AT1 och AT2. De två receptortyperna utövar i stort sett motsatta effekter; Till exempel kontraherar AT1-receptorerna blodkärl, orsakar celltillväxt och stimulerar törst, medan AT2-receptorerna orsakar en utvidgning av blodkärl, inducerar celldöd och motverkar törst. AT1-receptorblockad vid hjärninfarkt har diskuterats livligt de senaste åren och studier både på djur och människa har visat att en sådan blockad kan ha gynnsamma effekter. Vid de flesta av dessa studier har dock AT1-receptorinhibitorer givits preventivt under lång tid före hjärninfarkten. Studier angående effekten av akut behandling med AT1-inhibitorer vid hjärninfarkt har däremot varit motsägande. Likaså diskuteras det flitigt vad som är orsaken till att AT1-inhibitorer fungerar skyddande. En möjlig mekanism presenterar vi i denna avhandling. Vi upptäckte att hjärninfarkt i råtta orsakar en ökad kontraktion mot angiotensin i den högra, drabbade mediaartären. Den här kontraktionen förmedlades just av AT1-receptorer, och detta skulle enligt vår hypotes kunna orsaka ett sämre blodflöde i den redan påverkade hjärnhalvan. Här har vi alltså en möjlig förklaring till varför AT1-receptorinhibitorer kan skydda vid hjärninfarkt. Dessutom visade det sig att genuttrycket av angiotensin converting enzyme, ett protein som producerar angiotensin, ökar i den högra mediaartären efter hjärninfarkt, vilket kan innebära att hjärninfarkt orsakar en ökad produktion av angiotensin. Slutligen lyckades vi, i den sista inkluderade studien, bekräfta att blockad av AT1-receptorer (i en låg dos) är gynnsamt vid hjärninfarkt i råtta. Hjärnskadan i de behandlade råttorna var betydligt mindre än i de obehandlade 48 timmar efter operationen, och dessutom visade de behandlade råttorna en tendens till färre neurologiska symptom.

Naturvårdsverket arbetar med att implementera Ramdirektivet för vatten i Sverige. Som ett led i detta arbete har Naturvårdsverket givit EnviroPlanning i uppdrag att ta fram information kring vissa av de prioriterade ämnen som listas i Europaparlamentets och rådets beslut nr 2455/2001/EG, bilaga 10 till ramdirektivet för vatten. EnviroPlanning har för de av Naturvårdsverket utvalda ämnena eftersökt och ställt samman information om toxikologiska och ekotoxikologiska data, användning, förekomst i människa och miljö samt spridning och omvandling i naturen. Informationen finns sammanställd i denna rapport, tillsammans med en diskussion kring ämnenas/ämnesgruppernas fortsatta förekomst i vår omgivningsmiljö. Utifrån insamlad information har en bedömning gjorts av respektive ämne med indelning i tre grupper; grupp 1: ämnen som behöver övervakas och utredas vidare, grupp2: svårbedömda ämnen – vidare utredning behövs i brist på kunskap, grupp 3: ämnen som tillsvidare bedöms vara ett litet problem i Sverige.