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Methanothermobacter diente als Modellobjekt, an dem man die Biochemie der Methanbildung aufklären konnte. An ihm wurde gefunden, dass es neben den Bakterien eine gleichberechtigte zweite Gruppe von Prokaryonten gibt, die zunächst so benannten Archaebakterien. Diese Erkenntnis führte zur Einteilung der Lebewesen in die drei Domänen Bacteria, Archaea und Eukarya. Die Domäne der Eukarya ist eine Schwestergruppe der Archaea. Nickel als Bioelement, Kohlenmonoxid als Zellbaustein, neue Coenzyme, ein neuer Weg der autotrophen CO2-Fixierung und neue Wege der energetischen Kopplung wurden entdeckt. Die Beschäftigung mit der Mikrobe des Jahres 2021 hat in den 50 Jahren seit ihrer Entdeckung also wesentliche Erkenntnisse erbracht [1, 2]., Methanothermobacter served as a model organism for the elucidation of the pathway of ethanogenesis. It was the reason for developing the concept of Archaea as an independent phylum next to Bacteria. This concept finally resulted in the theory of the three domains of life, Bacteria, Archaea, Eukarya, the latter being a sister group of Archaea. The studies with Methanothermobacter led to important discoveries: nickel as bioelement, new coenzymes, carbon monoxide as natural cell building block, a new autotrophic carbon dioxide fixation pathway, and new mechanisms of energetic coupling. Studying the microbe of the year hence has resulted in many new essential findings in only 50 years since its discovery [1, 2].

Proizvodnja zelenih kemikalija iz lignoceluloznih sirovina istražuje se kao alternativa proizvodnji kemikalija iz naftnih derivata. Mliječna kiselina pripada skupini zelenih kemikalija te je zbog svojih brojnih primjena važan biotehnološki proizvod. Mliječnu kiselinu sintetizira i bakterija Bacillus smithii DSM 460 koja je služila kao proizvodni mikroorganizam u ovom istraživanju. Provedena su istraživanja u kojima je ova bakterija uzgojena na kemijski definiranim podlogama različitih sastava (glukoza i/ili ksiloza) pri različitim temperaturama (40, 50 i 60 °C). Osim toga proveden je i uzgoj na detoksiciranom hidrolizatu otpadnog pivskog tropa u bioreaktoru, koji je rezultirao niskim procesnim parametrima te uzgoji s dodatkom mravlje i octene kiseline kao inhibitora. Optimalna temperatura za uzgoj B. smithii DSM 460 i proizvodnju mliječne kiseline bila je 50 °C pri kojoj je postignut prinos mliječne kiseline 7,593 g Lˉ¹ te produktivnost 0,262 g Lˉ¹ hˉ¹. Pri 60 °C dobivene su nešto niže vrijednosti procesnih parametara, a pri 40 °C su prinosi i produktivnost bili vrlo niski. Dodatak mravlje i octene kiseline u nižim koncentracijama nije utjecao na rast B. smithii DSM 460 te na sintezu mliječne kiseline, no pri višim koncentracijama je došlo do potpune inhibicije. Production of green chemicals from lignocellulosic biomass is being investigated as an alternative to the production of chemicals from petroleum derivates. Lactic acid belongs to the group of green chemicals and is an important biotechnological product due to its numerous applications. One of the producers of lactic acid is Bacillus smithii DSM 460, which was used for this study. This bacterium was grown on chemically defined media of various composition (glucose and/or xylose) at different temperatures (40, 50 and 60 °C). In addition, cultivation was carried out on detoxified hydrolyzate of waste beer wort in bioreactor with stirrer, which resulted in low process parameters, and cultivation with addition of formic and acetic acid as inhibitors. Optimal temperature for the cultivation of B. smithii DSM 460 and the production of lactic acid was 50 °C. At that temperature yield of lactic acid was stated at 7.593 g Lˉ¹ and productivity at 0.262 g Lˉ¹ hˉ¹. Slightly lower values of process parameters were obtained at 60 °C while yields and productivity at 40 °C were very low. Addition of formic and acetic acid at lower concentrations to the media did not affect the growth of B. smithii DSM 460 and the production of lactic acid, while higher concentrations resulted in complete inhibition.

The microorganisms involved in the bioleaching of sulphidic mineral ores are acidophilic. Generally, a pH in the range of pH 1–2.5 is applied for optimal growth in these systems. In operating heaps, perturbation of conditions could result in changes in the pH outside this “safe” window, so an understanding of the effect of changes in pH on growth and activity of bioleaching microbes is needed. Previous work has shown that some microorganisms e.g. Acidithiobacillus thiooxidans, Leptospirillum ferriphilum and Leptospirillum ferrooxidans are able to adapt to low pH environments (∼pH 0.9). However, most studies on the response of micro-organisms implicated in mineral bioleaching to pH have been conducted under submerged, aerated culture conditions, with limited performance-based studies conducted under conditions mimicking a heap environment. In this study, the effect of acid stress on the persistence of the thermophilic micro-organisms in the ore bed inoculated at mesophilic conditions and their subsequent growth on reaching thermophilic conditions is considered. Following inoculation, five columns loaded with a low grade chalcopyrite ore were irrigated at a feed pH of 1.7 at 25 °C. After a few days, the temperature was sequentially increased from 25 °C through 37 °C to 50 °C, resulting in an Eh above 850 mV across all columns. The irrigation feed pH was then varied across the range pH 1.0 to 1.7 at 50 °C. Eh values greater than 800 mV could be attained in the columns with feed pH values between pH 1.2 and pH 1.7 at 50 °C. The Eh of the column receiving feed solution at a pH of 1.0 at 50 °C dropped to below 700 mV and did not recover. The temperature was then increased gradually to 60 °C. All the columns with feed pH of 1.2 and higher achieved Eh values above 800 mV. Quantitative analyses of the microbial community on selected PLS and ore samples indicated that lower pH affected the persistence of the thermophilic micro-organisms in the ore bed and their subsequent growth on reaching thermophilic conditions. The microbial population detached from the ore sample after 120 days decreased by a factor of 5–15 and 25–100 fold on decreasing the operating pH from 1.5–1.7 to 1.4 and 1.2 respectively. Poor microbial activity was found at pH 1.0, suggesting ineffective growth or persistence of the archaea., http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0892687513002331

Bakteriophagen führen in Molkereien häufig zu Säuerungsproblemen, indem sie die bakterielle Starterkultur befallen und lysieren. In dieser Arbeit wurden im Rahmen des AiF-Projekts 1433N die Thermostabilität von Phagen verschiedener mesophiler und thermophiler Milchsäurebakterien überprüft. Um den aktuellen Phagenstatus in deutschen Molkereine zu erfassen, wurden Phagen aus insgesamt 130 Proben (Milch, Molke, Frischkäse, Käse, Joghurt, Salzbad, Reinigungslösungen) von 19 Molkereibetrieben und 2 Kulturenherstellern isoliert und elektronenmikroskopisch sowie molekularbiologisch charakterisiert. Insbesondere in den Proben von KMU wurden Phagen der Species 936, c2 und P335 gefunden. Das Screening der Phagenisolate ergab eine hohe Variabilität der Thermoresistenz der L. lactis Phagen: Vertreter der 949-Species und P335-Phagen des BK5-T-Typs wurden schon bei niedriger Temperatur (1 min, 60 65 °C) inaktiviert. Die Mehrzahl der L. lactis Phagen wurde bei 75 80 °C inaktiviert. Diese Temperaturspanne reichte auch zur Inaktivierung der Phagen der thermophilen Kulturen (S. thermophilus, Lb. delbrueckii). Die isolierten L. lactis-Phagen mit hoher Thermoresistenz, die noch 90 – 95 °C überstanden, wurden eindeutig der 936-Species zugeordnet und zeigten eine hohe genetische Verwandtschaft zu den Typphagen dieser Species. Die Auswirkung von äußeren Stressfaktoren auf die Hitzeresistenz von Bakteriophagen wurde bei verschiedenen L. lactis Phagen untersucht. Eine mehrmonatige Lagerung von Phagen bei Raumtemperatur in Salzlake hatte keine Veränderung der Hitzestabilität zur Folge. Allerdings wiesen die Phagen in Salzbädern eine ausgeprägte Langzeitstabilität auf. Eine wiederholte Eintrocknung von Phagen/Magermilch-Suspensionen führte zu einer Genomdeletion des Phagen BK5-T (P335-Species) und dieser wies eine erhöhte Hitzeresistenz auf. Der Phage P001 (c2-Species) wurde in 10 aufeinander folgenden Zyklen erhitzt und anschließend wieder vermehrt. Dieser Phage wies nach den 10 Hitzestress-Zyklen eine erhöhte Thermoresistenz auf. Der Einfluss des Suspensionsmediums für die thermische Inaktivierung wurde für die L. lactis Phagen P008 und P680 elektronenmikroskopisch untersucht. Bei beiden Phagen hatte die Erhitzung eine deutliche Schädigung der Phagenpartikel zur Folge, wobei der Phage P680 sich als deutlich stabiler erwies.

Zwei Glykosylhydrolasen des acidothermophilen Bakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius konnten charakterisiert werden. Die jeweiligen Gene wurden kloniert und sequenziert. Das intrazelluläre Enzym CelA und das extrazelluläre Enzym CelB könnten zusammen eine tragende Rolle im Abbau von beta-1,4-verknüpften Polysacchariden spielen. Ein Gen, welches für eine beta-1,4-Endoglucanase (CelA) kodiert, wurde kloniert und überexpremiert. Das Enzym wurde gereinigt. Das Protein besitzt eine Immunoglobulin-ähnliche Domäne, jedoch keine Cellulosebindedomäne. Zusammen mit den Sequenzähnlichkeiten der katalytischen Domäne zeigen diese Merkmale, daß das Protein zur Familie 9, Untergruppe E1 der Glykosylhydrolasen gehört. CelA zeigte höchste Aktivität gegenüber beta-1,4-Glucanen, besaß jedoch auch Aktivität gegen Haferspelzenxylan. Das Enzym hatte ein pH optimum von 5.5 und ein Temperaturoptimum von 70 °C. Im Protein waren zwei Zink- und zwei Calcium-Ionen gebunden, die wahrscheinlich wichtig für die Temperaturstabilität sind. Gegenüber p-Nitrophenylglykosiden ergab sich ein überraschendes Hydrolysemuster: Höchste Aktivität wurde auf dem Cellobiosidderivat gefunden, eine niedrigere Aktivität fand sich auf dem Cellotetraosederivat, wohingegen keine Aktivität auf den Glucose- und Cellotriosederivaten gemessen wurden. Das Hydrolysemuster führte zu dem Schluß, daß in CelA die Bindung von beta-1,4-Glucanen entweder auf der nicht reduzierenden Seite der -2 Substratunterbindestelle sterisch verhindert wird, oder alternativ zwei starke Substratunterbindestellen -1 und -2 vorhanden sind. Es wurde kein Signalpeptid zur Markierung des Proteins für die Translokation über die Membran gefunden. Zusammen mit der hohen Aktivität gegenüber Oligosacchariden, dem fast neutralen pH Optimum und der Inaktivierung bei niedrigem pH, deutet dies auf eine Rolle des Proteins als cytoplasmatisches Enzym zum Abbau importierter Oligosaccharide hin. Ein zweites Enzym mit Xylanase- und Cellulaseaktivität wurde zunächst aus A. acidocaldarius Kulturen gereinigt. CelB besaß eine molekulare Masse von 100 kDa und konnte nur mit Hilfe von Detergenz von den Zellen abgelöst werden. Klonierung und Sequenzanalyse des entsprechenden Gens ergaben einen offenen Leserahmen, welches für ein Präprotein kodierte, das ein typisches Sec-abhängiges Signalpeptid besaß. Gereinigtes, rekombinantes CelB und eine verkürzte Variante, der die letzten 203 Aminosäuren fehlten, zeigten Enzymaktivitäten, die dem Wildtypprotein ähnlich waren. Ein niedriges pH-Optimum von 4 wurde bestimmt. Auch die Stabilität war bei niedrigem pH hoch, wobei das Enzym nach Inkubation über nacht bei pH 1.5 bis 7 eine Restaktivität von 80 % aufwies. Das Temperaturoptimum betrug 80 °C. Bei dieser Temperatur war das Enzym auch stabil und zeigte nach 1 h 60 % Restaktivität. CelB hatte die Spezifität eines Endoenzyms, jedoch wurden nach längeren Inkubationszeiten Cellobiose und Xylobiose aus Cellulose bzw. Xylan freigesetzt. Das Enzym gehörte zur Familie 51 der Glykosylhydrolasen, aber es war erst der zweite Eintrag dieser Familie mit typischer Endoglucanaseaktivität. CelB hatte höchste Sequenzähnlichkeit mit der zweiten Endoglucanase, EGF aus Fibrobacter succinogenes, wobei diese beiden Proteine eine markante Gruppe im phylogenetischen Baum dieser Familie bildeten. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der katalytischen Domänen ergab, daß CelB in Übereinstimmung mit der Anpassung an einen niedrigen pH-Wert, weniger geladene Aminosäuren als die neutrophilen Enzyme der gleichen Familie besitzt. Wildtyp-CelB und unverkürztes, rekombinantes CelB waren nur in Anwesenheit von Detergenz löslich. Dagegen war das verkürzte CelB Protein vollständig in Wasser löslich. Daher wird eine Rolle der C-terminalen Region bei der Zellassoziation nahegelegt. Dieser hydrophobe Bereich zeigte lokale Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz mit einer hydrophoben Region einer Amylase aus dem gleichen Organismus., Two glycoside hydrolases from the thermoacidophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius were characterized and the corresponding genes cloned and sequenced. Together the intracellular enzyme CelA and the extracellular enzyme CelB may play a major role in the degradation of beta-1,4-linked polysaccharides. A gene encoding a beta-1,4-endoglucanase (CelA) was cloned and the enzyme overexpressed and purified. The protein contained an immunoglobulin-like domain but lacked a cellulose-binding domain. In conjunction with sequence similarities of the catalytic domain these features demonsrated the protein to be a member of glycoside hydrolase family 9, subgroup E1. CelA was most active against substrates containing beta-1,4-linked glucans, but also exhibited activity against oat spelt xylan. It displayed a pH optimum of 5.5 and a temperature optimum of 70 °C. The protein was found to contain one zinc and two calcium ions, likely to be important for temperature stability. It showed a striking pattern of hydrolysis on p-nitrophenyl glycosides, with highest activity on the cellobioside derivative, some on the cellotetraoside derivative and none on the glucoside and trioside derivatives. The hydrolysis patterns led to the conclusion that CelA contained a steric block for beta-1,4-linked glucans on the non reducing side of subsite -2 or, alternatively, two strong binding sites -1 and -2. No signal peptide for transport of CelA across the membrane was detected. This, together with high activity on oligosaccharides, a near neutral pH optimum, and inactivation at low pH, suggests a role for the protein as a cytoplasmic enzyme for the degradation of imported oligosaccharides. A second enzyme with xylanase and cellulase activity was purified from A. acidocaldarius cultures. CelB displayed a molecular mass of 100 kDa and could only be removed from cells with the help of detergent. Cloning and sequence analysis of the corresponding gene revealed an ORF encoding a preprotein with a typical sec-dependent signal peptide. Purified recombinant CelB and a truncated varient lacking the C-terminal 203 amino acid residues displayed enzymatic properties similar to the wild-type protein. A low pH optimum of 4 was found. Stability was also high at low pH, the enzyme retaining 80 % of activity after incubation over night from pH 1.5 to 7. The temperature optimum was 80 °C, a temperature at which the enzyme was also stable, showing 60 % residual activity after 1 h. CelB displayed an endo mode of action, but release of cellobiose and xylobiose from cellulose and xylan, respectively, was observed after prelonged periods of incubation. CelB belonged to glycoside hydrolase family 51, but it was only the second entry in this family with activity typical of an endoglucanase. Highest sequence similarity was found towards the other endoglucanase, EGF from Fibrobacter succinogenes, the two forming a distinct group in the phylogenetic tree of this family. Analysis of the amino acid composition of the catalytic domains demonstrated that CelB contains fewer charged amino acids than its neutrophilic counterparts, which is in line with adaptation to low pH. Wild-type and full-length recombinant CelB were soluble only in detergent. In contrast, truncated CelB was completely water soluble, suggesting a role of the C-terminal region in cell association. This C-terminal hydrophobic region displayed local sequence similarities to a hydrophobic region of an amylase from the same organism.

The hyperthermophile Archaeon Thermococcus litoralis transports both Disaccharide Trehalose and maltose by the same transportation complex from the medium in the cell inside. This first in the group the Archaea discovered ABC transporters could be characterized in this work nearer. The besides won knowledge was compared to the information already known bacterial bandage protein of dependent ABC transporters. One of the settings of tasks of this work was in addition to the already known information common characteristics and differences of the archaeellen Trehalose/Maltose-bandage protein TMBP with that of its bacterial homolog to lay the table to the maltose / Maltodextrin-Bindeprotein MBP. That's way became on the one hand, that in the membrane anchored bandage protein cleaned. By a staining method specific for Glykoproteine turned out that the TMBP is present as a Glykoprotein. Around a three-dimensional structure of the TMBP became to determine for the X-raying's structural analysis one, after cloning and heterologer expression in E. coli, protein cleaning method establishes itself. The structure of TMBP installs, the already described bandage proteins, homologous folds sample on. In at beginning of this work to confessed malEFG-sequence section nobody could be identified to the Energetisierung of the transportation required ABC domain. Therefore, the central project was the 'search' for the ABC domain. The corresponding gene could take place kloniert and the first characteristic going out from the DNA sequence. From 1119 bp were determined for malK 372 amino acids big protein arise. The comparison of the T. litoralis of MalK protein with ABC domains from other organisms showed that all sequences typical for these proteins exist. After successful heterologer expression in E. Coli was cleaned the protein and a detailed biochemic characteristic was executed.

Derzeit sind bei Mikroorganismen vier verschiedene Stoffwechselwege zur autotrophen CO2-Fixierung bekannt. Dies sind der Calvin-Zyklus, der reduktive Citrat-Zyklus, der reduktive Acetyl-CoA-Weg und der 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Letzterer wurde bisher nur im phototrophen Bakterium Chloroflexus aurantiacus nachgewiesen. In den letzten Jahren wurden zahlreiche thermophile und hyperthermophile Vertreter der Crenarchaeota isoliert, die autotroph wachsen können. Es gibt sehr wenige Unter-suchungen zur autotrophen CO2-Fixierung in dieser großen Organismengruppe. Erste Arbeiten deuten auf einen 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Vertretern der Familie der Sulfolobaceae hin. In dieser Arbeit sollte der 3-Hydroxypropionat-Zyklus sowohl in C. aurantiacus, als auch in Metallosphaera sedula, einem Mitglied der Sulfolobaceae, näher untersucht werden. Außerdem wurde die Art der jeweiligen CO2-Fixierung in verschiedenen Vertretern der Crenarchaeota untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Die Malonyl-CoA-Reduktase, ein charakteristisches Enzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus, wurde aus C. aurantiacus gereinigt und charakterisiert. Das entsprechende Gen wurde kloniert und sequenziert. Die Malonyl-CoA-Reduktase katalysiert die NADPH-abhängige, zweistufige Reduktion von Malonyl-CoA über Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat. Da die Malonyl-CoA-Reduktase in keinem anderen Stoffwechselweg benötigt wird, kann sie als Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus angesehen werden. 2. Es wurden in autotrophen Vertretern aller Familien der Crenarchaeota die Schlüssel-enzymaktivitäten der bekannten CO2-Fixierungswege untersucht. Bei Pyrodictium abyssi und Pyrodictium occultum (Pyrodictiaceae) wurde eine Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Aktivität nachgewiesen. Es wird ein modifizierter Calvin-Zyklus vermutet. In Ignicoccus islandicus und Ignicoccus pacificus (Desulfurococcaceae) konnte nur die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase als Enzym eines bekannten CO2-Fixierungswegs nachgewiesen w., In prokaryotes four different autotrophic pathways for CO2 fixation are known. These are Calvin cycle, reductive TCA cycle, reductive acetyl-CoA pathway and 3-hydroxypropionate cycle. The latter pathway was recently discovered in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus. The 3-hydroxypropionate cycle involves the carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA, which is then reductively converted to propionyl-CoA via 3-hydroxypropionate. In a second carboxylation reaction methyl-malonyl-CoA is formed from propionyl-CoA, followed by the isomerization of methyl-malonyl-CoA to succinyl-CoA. Malyl-CoA is formed from succinyl-CoA and the cleavage of malyl-CoA leads to acetyl-CoA and the CO2 fixation product glyoxylate. During the last years many thermophilic and hyperthermophilic crenarchaeota capable of autotrophic growth have been isolated. However, at present there are only few studies that have investigated their autotrophic CO2 fixation pathways. At the start of this thesis, there were some indications for the operation of the 3-hydroxypropionate cycle in members of the Sulfolobaceae. This thesis aimed at further elucidating the 3-hydroxypropionate cycle in C. aurantiacus as well as in Metallosphaera sedula, a member of the Sulfolobaceae. Furthermore, representative species of Crenarchaeota were examined to determine their autotrophic CO2 fixation pathways. The thesis resulted in the following findings: (1) Malonyl-CoA reductase, a key enzyme of the 3-hydroxypropionate cycle was purified and characterized from cells of C. aurantiacus. The corresponding gene was cloned and sequenced. This enzyme catalyses the NADPH-dependent reduction of malonyl-CoA to 3-hydroxypropionate and is therefore a bifuncional enzyme. (2) Autotrophic members from all families of Crenarchaeota were examined for key enzymes of the known autotrophic CO2 fixation pathways. In Pyrodictium abyssi and Pyrodictium occultum (Pyrodictiaceae) a ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase activity was f.