Search

L’objectif de cette thèse était de mettre au point une analyse critique de vecteurs polymères utilisés pour la thérapie photodynamique (PDT) et de faire le lien avec l’efficacité thérapeutique observée. Pour cela, une analyse complète des vecteurs a été réalisée par des techniques classiques comme la diffusion dynamique de la lumière ou la microscopie électronique, mais aussi grâce au fractionnement flux-force, technique peu utilisée jusqu’à présent dans le domaine des auto-assemblages polymères. Dans un deuxième temps, les auto-assemblages ont été utilisés comme vecteurs d’un photosensibilisateur, le Phéophorbide a, et l’efficacité thérapeutique évaluée en travaillant sur culture cellulaire 2D et 3D de lignées HCT116 (cancer du colon) ou FaDu (cancer tête et cou). Différents vecteurs polymères simples ont tout d’abord été examinés, à savoir des micelles ou des polymersomes à base de copolymères diblocs amphiphiles comme le poly(oxyde d’éthylène-b--caprolactone), le poly(oxyde d’éthylène-b-lactide) ou le poly(oxyde d’éthylène-b-styrène). Ceci a permis d’obtenir des vecteurs présentant des tailles et des morphologies variables. Les résultats en PDT ont montré des comportements différents et une meilleure efficacité en 3D pour les systèmes à base de PEO-PDLLA. La technique de fractionnement flux-force asymétrique (AsFlFFF) a particulièrement été utilisée pour ces vecteurs afin de démontrer la pureté des auto-assemblages. Les connaissances acquises dans cette première partie ont permis de caractériser des vecteurs faits à base de mélanges d’auto-assemblages micelles/vésicules. Ceux-ci ont révélé des phénomènes d’antagonisme ou de synergie dans l’efficacité en PDT, démontrant l’existence de processus complexes au niveau de la réponse cellulaire.Des auto-assemblages figés par réticulation ont aussi été développés, caractérisés et examinés en PDT. Ils se sont avérés extrêmement intéressants pour la PDT sur les cultures cellulaires en 3D, démontrant une efficacité accrue comparée aux systèmes simples. La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus en culture 2D pour les mêmes objets a de plus permis de mettre en évidence la différence entre ces deux modèles biologiques. Enfin, des auto-assemblages à base de complexes poly-ioniques ont aussi été formés et caractérisés. Le fractionnement flux-force s’est là encore avéré efficace, mais a nécessité l’utilisation d’une injection spéciale par Frit-inlet. Leur efficacité en PDT s’est avérée faible.

Photodynamic therapy (PDT) is a clinically used technique for treating skin diseases, age-relatedmacular degeneration but mainly some types of cancer. PDT involves three components: a photosensitive molecule named photosensitizer (PS), light and oxygen. After administration of the PS, this one will be located more or less selectively in tumoral regions where it is activated by light irradiation at appropriate wavelength and power. This leads to the formation of highly reactive and cytotoxic reactive oxygen species (ROS), especially singlet oxygen, resulting in the destruction of the tumor by necrosis or apoptosis. To improve the treatment selectivity, different strategies are being exploited, one of which is the development of "photodynamic molecular beacons" (PMB). In PMB the photosensitizer is linked via a peptide to an inhibitor of 1O2 (quencher). This quencher inhibits the formation of 1O2 as long as the compound has not reached its target, namely cancer cells. In order to inhibit the toxicity of the PS in non-target cells and restore toxicity only close to the biological target, it is necessary to find an adequate PS/quencher couple. This remains a challenge for PDT. Carotenoids are interesting candidates due to their specific photophysical properties and ability to inhibit 1O2, which makes them potential quenchers for building PMBs. In plants, carotenoids (carotenes and xanthophylls) are pigments involved in the photosynthesis, in which they play two main roles: a light collecting role and a protecting role by preserving the photosynthetic systems against photoxydative damages induced by a too intense light exposure. This protection can for instance occur via the well-known xanthophylls cycle. This capacity to catch energy presents a potential interest that should not be neglected in the framework of the design of PMBs usable in photodynamic therapy. Within the framework as part of this PhD thesis in Cotutelle with the Faculty of Sciences of Bizerte, we focused on carotenoids from three fruits produced in Tunisia: persimmon (Diospyros kaki L.), apricot (Prunus armeniaca L.) and peache (Prunus persica L.), known for their global richness in these natural pigments. Three extraction processes were investigated: (i) the Soxhlet extraction based on the use of organic solvent at atmospheric pressure and used as reference, (ii) the accelerated solvent extraction (ASE) using organic solvent under high pressure, and (iii) the supercritical fluid extraction (SFE) using supercritical CO2 and ethanol as cosolvent. For these two last processes, a design of experiments (Surface Response Design) was used to identify the key factors and optimal extraction conditions of various carotenoids (pressure, temperature, flow, % cosolvent, time, number of cycles). Then, HPLC-PDA coupled with mass spectrometry (MS) enabled the identification and quantification of carotenoids from the extracts. Thus it was possible to compare the profiles in carotenoids content from each fruit as well as the performances of each extraction process. This study showed that the carotenoidic profile in the persimmon was the most interesting as compared to the profiles in the two other fruits. Extraction and purification of the carotenoids from persimmon by preparative high pressure liquid chromatography were then performed in order to have a sufficient amount of each carotenoid and sometimes of their conformational isomers. We finally performed a study of their photophysical properties (absorption, fluorescence emission, 1O2 inhibition) in order to evaluate their potential as 1O2 quencher in molecular construction such as a PMB, La thérapie photodynamique (PDT) est une technique utilisée cliniquement pour traiter certaines maladies de la peau, la dégénérescence maculaire liée à l’âge et certains types de cancer. Elle fait intervenir trois composants : une molécule photosensible ou photosensibilisateur (PS), la lumière et l’oxygène. Après administration du PS, celui-ci va se localiser plus ou moins sélectivement dans les zones tumorales où il est alors activé par irradiation lumineuse à une longueur d’onde et une puissance données. Ceci engendre la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) très réactives, dont l'oxygène singulet1 O2, qui entraînent la destruction des tissus tumoraux par nécrose ou apoptose. Afin d’améliorer la sélectivité du traitement, différentes pistes sont actuellement exploitées dont l’élaboration de « photodynamic molecular beacons » (PMB). Dans un PMB, le photosensibilisateur (PS) est associé via un peptide à un inhibiteur 1O2, appelé quencher. Ce quencher inhibe la formation d’1O2 tant que le composé n’a pas atteint sa cible. Une fois la zone cancéreuse atteinte, des enzymes spécifiques clivent le peptide, libérant ainsi le PS qui retrouve alors sa capacité à former de l’1O2. Trouver un couple PS/quencher adéquat reste un challenge en PDT. Les propriétés photophysiques particulières des caroténoïdes et leur aptitude à inhiber la production d’1O2 font de ces derniers des quenchers potentiellement utilisables pour l’élaboration de PMBs. Chez les plantes, les caroténoïdes (carotènes et xanthophylles) sont des pigments associés à la photosynthèse, qui ont deux rôles principaux : un rôle de collecteur de lumière et un rôle photoprotecteur en protégeant le(s) système(s) photosynthétique(s) contre les dommages photooxydatifs liés à une exposition trop intense à la lumière. Ceci s’opère, entre autre, via le cycle des xanthophylles. Cette aptitude à capter de l’énergie présente un intérêt potentiel à ne pas négliger dans la perspective de la conception de PMB utilisables en thérapie photodynamique. Dans le cadre de cette thèse en co-tutelle avec la Faculté des Sciences de Bizerte nous avons ciblé les caroténoïdes présents dans trois fruits produits en Tunisie à savoir les kakis (Diospyros kaki L.), les abricots (Prunus armeniaca L.) et les pêches (Prunus persica L.) connus pour leur richesse globale en ces pigments. Divers procédés d’extractions ont été étudiés : (i) L’extraction de type Soxhlet par solvants organiques à pression atmosphérique, utilisée comme référence, (ii) l'extraction accélérée par solvant organique (ASE : Accelerated solvent Extraction) effectuée sous pression, enfin (iii) l'extraction par CO2 supercritique avec l’éthanol comme cosolvant. Pour ces deux derniers procédés, une approche par plan d’expériences (surfaces de réponses) a été utilisée pour identifier les facteurs clé et les conditions optimales d’extractions de divers caroténoïdes (pression, température, débit, % de cosolvant, temps, nombre de cycles). L'analyse par chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection UV-Visible et à la spectrométrie de masse a ensuite permis l'identification et la quantification des caroténoïdes présents dans les extraits obtenus, permettant ainsi de comparer les profils caroténoïdiques propres à chaque fruit et les performances de chaque procédé d’extraction. Cette étude ayant révélé un profil caroténoïdique particulièrement intéressant chez le kaki par rapport aux autres fruits, une extraction et une purification des caroténoïdes de ce fruit par chromatographie liquide haute pression préparative a ensuite été effectuée afin de disposer d’une quantité suffisante de chaque caroténoïde, et parfois de leurs isomères conformationnels, en vue de l’étude de leurs propriétés photophysiques (absorption, émission de fluorescence, inhibition d’1O2) et de l’évaluation de leur intérêt potentiel en tant que quencher d’1O2 dans un édifice de type PMB

The photodynamic therapy, more exactly named dynamic photochemotherapy, is a new approach based on the combined action of a photoactive drug or photosensitizer, light and oxygen. These compounds are non toxic without appropriated light exposure but produce, after irradiation, reactive species in presence of molecular oxygen, leading to target tissue destruction. This article describes first the photosensitization molecular mechanisms, then the photophysical and chemical properties requested to obtain a « good » photosensitizer. In order to propose photosensitizers really adapted to therapeutic applications, more efficient and selective new photoactive compounds are elaborated. At last, the main application fields of photodynamic therapy, the limits and the future of this treatment are developed., La thérapie photodynamique est une nouvelle approche, basée sur l'action sélective par la lumière de médicaments, dits photosensibilisateurs. Ces molécules, non toxiques en absence d'une lumière de longueur d'onde appropriée, génèrent, après irradiation lumineuse et en présence d'oxygène, des espèces très réactives entraînant la destruction du tissu cible. Cet article décrit tout d'abord les mécanismes moléculaires de photosensibilisation, puis les propriétés chimiques et photophysiques d'un « bon » photosensibilisateur. Une conception rationnelle de photosensibilisateurs adaptés aux applications thérapeutiques passe nécessairement par un effort d'élaboration de nouveaux composés photo-activables plus efficaces, donc plus sélectifs. Enfin, les principaux domaines d'application, notamment en cancérologie, ainsi que les freins et les perspectives de la thérapie photodynamique sont développés.

Photodynamic therapy (PDT) can be used to cause vascular collapse and blood flow stasis of the irradiated pathological neovascularisation appearing in several diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and cancer. We hypothesized that this PDT-related interruption of vessel integrity may lead to an increased transvascular passage of drugs that could be used as a drug delivery pathway. Thus, preceding the occlusion of the pathological vasculature, PDT could be used for instance as a local drug delivery pathway to administrate an anti-angiogenic drug in the case of AMD or chemotherapy in the case of cancer, potentially improving combination therapies. In the case of chorioneovessels (CNV) due to AMD, the recurrence of the exudative AMD component of the weeks/months after PDT, due to the re-opening and/or re-growth of neovessels might be avoided by adding an anti-angiogenic factor such as anti-VEGF or anti-inflammatory drug before, during or shortly after PDT. In the case of cancer, the starvation of tumour cells induced by the PDT occlusion of blood vessels feeding the tumour might be combined with a chemotherapeutic agent for the direct kill of the cancer cells themselves. It has been reported that following the light application in PDT, a physiological cascade of responses on the one hand leads to vascular occlusion but may also induce a vascular permeability enhancement. The aim of this thesis is to find conditions where this increase in leakage due to PDT can be observed, to characterize it and to take advantage of this phenomenon to develop the basis of a novel combination therapy approach. Hence in this thesis, pre-clinical experiments were performed in the vasculature of the chorioallantoic membrane model (CAM) of the chicken embryo and in the dorsal skinfold optical chamber of nude mice observed by intravital microscopy (IVM). In the CAM, no PDT-induced leakage of a fluorescent dye (FITC-dextran) was observed unless an anti-aggregating factor, such as aspirin was added. In the chicken embryo model, delaying the blood clot appears to be an essential process to allow effective potential drug delivery. In the dorsal skinfold of the nude mouse, the inflammatory response after PDT was observed and quantified. This revealed that PDT induces a time dependent acute inflammatory response as shown by increased number of leukocytes "rolling" along the vessel wall after treatment. This was observed over a 2 hour period following PDT. The quantification of the microvascular leakage showed a continuous FITC-dextran leakage from the vasculature treated by PDT to the interstitial space. This local leakage was clearly increased by the inflammatory status of the tissue (observed by quantifying the rolling leukocytes and by histology). This concept has the potential to improve the drug delivery of anti-angiogenic drugs in the eyes of patients treated for AMD and could also be applied to improve the uptake of cytostatic drugs in tumours.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Photodynamic therapy (PDT) has been developed as a treatment modality for a number of malignant and non-malignant disorders. PDT treatment is based on the presence of a drug with photosensitising and tumour localizing properties combined with visible light and oxygen. Accurate dosimetry is necessary to ensure complete treatment and to allow for consistent and reproducible patient outcomes. One of the key element which needs to be considered in dosimetry is photobleaching since it decrease the photosensitiser concentration during the treatment. It seems therefore important to understand the photobleaching mechanisms to adapt the photodynamic dose and receive the optimal treatment.The photobleaching quantum yield in solution supplemented with proteins is 5.7 x 10-4, the aggregated forms of the photosensitiser bleach slower than the monomerised forms. Under light exposure the m-THPBC is transformed in m-THPC, the phototransformation yield is influenced by the aggregation state of the molecule. Some other photoproducts such as dihydroxy m-THPBC, di-hydroxy m-THPC, dipyrin derivatives were observed. Singlet oxygen was found to be responsible of the photobleaching of both m-THPBC and m-THPC. In vitro, the m-THPBC LD50 is 0.7 J cm-2, and the photobleaching 3 to 5 times faster than m-THPC. Fluorescence microscopy study exhibits a discrepancy in the photosensitisers localisation, m-THPC is localised is the endoplasmic reticulum and m-THPBC accumulates in mitochondria. In vivo m-THPBC photobleaching is 4 to 10 times faster than m-THPC, with a good tumour accumulation. Taking as a whole these observations are particularly attractive in terms of therapeutic ratio and selectivity of the treatment and skin photosensitivity., La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées accessibles à la lumière. Son principe repose sur l'action conjuguée d'un photosensibilisant, de la lumière et de l'oxygène.Une dosimétrie correcte est nécessaire pour assurer le traitement complet et des résultats reproductibles. Un élément clé de la dosimétrie à prendre en compte est le photoblanchiment, étant donné qu'il diminue la concentration du photosensibilisant au cours du traitement. Il est donc indispensable d'appréhender les mécanismes du photoblanchiment pour maîtriser au mieux le traitement.Le rendement quantique de photoblanchiment de la m-THPBC en solution avec des protéines est de 5.7 x 10-4, les formes agrégées de photosensibilisants photoblanchissent plus lentement que les formes monomérisées. La m-THPBC se transforme sous l'effet de la lumière en m-THPC, ce rendement de phototransformation est influencé par l'état d'agrégation de la molécule. D'autres photoproduits tels que la m-THPBC di-hydroxylée et la m-THPC dihydroxylée ainsi que des dérivés dipyrines ont été observés. L'espèce responsable du photoblanchiment a été identifiée comme étant l'oxygène singulet. In vitro, la LD50 de la m-THPBC est 0.7 J cm-2. Le photoblanchiment est 3 à 5 fois plus sensible que celui de la m-THPC. L'étude de la localisation intra-cellulaire des photosensibilisants a montré une différence, la m-THPC s'accumulant dans le réticulum endoplasmique alors que la m-THPBC se localise dans les mitochondries. In vivo, la m-THPBC possède un photoblanchiment 4 à 10 fois plus élevé que la m-THPC, ainsi qu'une bonne accumulation tumorale. Ces résultats in vitro et in vivo sont particulièrement intéressants en terme de ratio thérapeutique, de sélectivité du traitement et de photosensibilité cutanée.

Photodynamic therapy (PDT) has been developed as a treatment modality for a number of malignant and non-malignant disorders. PDT treatment is based on the presence of a drug with photosensitising and tumour localizing properties combined with visible light and oxygen. Accurate dosimetry is necessary to ensure complete treatment and to allow for consistent and reproducible patient outcomes. One of the key element which needs to be considered in dosimetry is photobleaching since it decrease the photosensitiser concentration during the treatment. It seems therefore important to understand the photobleaching mechanisms to adapt the photodynamic dose and receive the optimal treatment.The photobleaching quantum yield in solution supplemented with proteins is 5.7 x 10-4, the aggregated forms of the photosensitiser bleach slower than the monomerised forms. Under light exposure the m-THPBC is transformed in m-THPC, the phototransformation yield is influenced by the aggregation state of the molecule. Some other photoproducts such as dihydroxy m-THPBC, di-hydroxy m-THPC, dipyrin derivatives were observed. Singlet oxygen was found to be responsible of the photobleaching of both m-THPBC and m-THPC. In vitro, the m-THPBC LD50 is 0.7 J cm-2, and the photobleaching 3 to 5 times faster than m-THPC. Fluorescence microscopy study exhibits a discrepancy in the photosensitisers localisation, m-THPC is localised is the endoplasmic reticulum and m-THPBC accumulates in mitochondria. In vivo m-THPBC photobleaching is 4 to 10 times faster than m-THPC, with a good tumour accumulation. Taking as a whole these observations are particularly attractive in terms of therapeutic ratio and selectivity of the treatment and skin photosensitivity.; La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées accessibles à la lumière. Son principe repose sur l'action conjuguée d'un photosensibilisant, de la lumière et de l'oxygène.Une dosimétrie correcte est nécessaire pour assurer le traitement complet et des résultats reproductibles. Un élément clé de la dosimétrie à prendre en compte est le photoblanchiment, étant donné qu'il diminue la concentration du photosensibilisant au cours du traitement. Il est donc indispensable d'appréhender les mécanismes du photoblanchiment pour maîtriser au mieux le traitement.Le rendement quantique de photoblanchiment de la m-THPBC en solution avec des protéines est de 5.7 x 10-4, les formes agrégées de photosensibilisants photoblanchissent plus lentement que les formes monomérisées. La m-THPBC se transforme sous l'effet de la lumière en m-THPC, ce rendement de phototransformation est influencé par l'état d'agrégation de la molécule. D'autres photoproduits tels que la m-THPBC di-hydroxylée et la m-THPC dihydroxylée ainsi que des dérivés dipyrines ont été observés. L'espèce responsable du photoblanchiment a été identifiée comme étant l'oxygène singulet. In vitro, la LD50 de la m-THPBC est 0.7 J cm-2. Le photoblanchiment est 3 à 5 fois plus sensible que celui de la m-THPC. L'étude de la localisation intra-cellulaire des photosensibilisants a montré une différence, la m-THPC s'accumulant dans le réticulum endoplasmique alors que la m-THPBC se localise dans les mitochondries. In vivo, la m-THPBC possède un photoblanchiment 4 à 10 fois plus élevé que la m-THPC, ainsi qu'une bonne accumulation tumorale. Ces résultats in vitro et in vivo sont particulièrement intéressants en terme de ratio thérapeutique, de sélectivité du traitement et de photosensibilité cutanée.