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Phenolamides are a family of specialized metabolites that accumulate in a wide variety of plant species. They have functions in flower initiation, are involved in plant responses to stress, and they are part of the composition of the walls of pollen grains. In addition, their therapeutic bioactivity has been described as an antioxidant, anti-inflammatory, anti-microbial or anti-cancer molecule. Recent laboratory work has shown that the tomato produces phenolamides, especially when it is attacked by the pest Tuta absoluta. Their role in the defense of plants remains unclear. In this context, a first objective of my thesis was to modulate the composition of phenolamides in tomatoes in order to assess the consequences of this modulation on the functioning of the plant and its ability to defend itself. A second objective was to determine the therapeutic potential of these phenolamides identified in tomatoes, by screening tests for activity. A prerequisite for the generation of plants genetically modified for their capacity to synthesize phenolamides, has been to identify new genes controlling the accumulation of phenolamides in the plant. We have exploited our RNA Seq tomato bank and work in other Solanaceae. We have identified ten candidate genes, two of which code for transcription factors and eight for acyltransferases. The functional characterization of these candidates has so far not led to the identification of any new enzymatic function associated with the phenolamide pathway. This work should be continued by broadening the spectrum of substrate tested on the identified candidates and by targeting other candidate genes. To generate the genetically modified plants, I carried out a methodological work, in the laboratory, to develop transformation and regeneration protocols on the tomato species, and the gene editing technique, (CRISPR / cas9). The techniques developed lead to a high efficiency of transformation, whether in overexpression or in gene editing. We thus generated 94 lines of tomatoes in which the expression of the putrescine hydroxycinnamoyl transferase (PHT) genes responsible for the accumulation of caffeoylputrescine was modified upward or downward, as was the expression of the transcription factor solyc06g083900 .2 likely to be involved in the accumulation of a wider set of phenolamides. The plants obtained are now available for characterization work on their metabolic content and the physiological consequences of the modifications generated. We evaluated the therapeutic potential of some tomato phenolamides induced by the herbivory of T. absoluta. Obtaining pure molecules required the help of chemists. Among the molecules evaluated, caffeoylputrescine and kukoamine A exhibit moderate antibacterial activities against Staphylococcus aureus. The tests revealed the anti-inflammatory property of caffeoylputrescine on macrophage cells. This work confirms the therapeutic potential of phenolamides. They will be prosecuted for the evaluation of their anti-cancer properties., Les phénolamides constituent une famille des métabolites spécialisés qui s’accumulent chez une grande diversité d’espèces végétales. Ils ont des fonctions dans l’initiation florale, interviennent dans les réponses des plantes à des stress, et ils entrent dans la composition des parois de grains de pollen. De plus, leur bioactivité thérapeutique a été décrite en tant que molécule anti-oxydante, anti-inflammatoire, anti-microbienne ou anti-cancéreuse. Des travaux récents du laboratoire ont montré que la tomate produit des phénolamides, notamment lorsqu’elle subit l’herbivorie du ravageur Tuta absoluta. Leur rôle dans la défense des plantes reste à instruire. Dans ce cadre, un premier objectif de ma thèse a été de moduler la composition en phénolamides chez la tomate afin d’évaluer les conséquences de cette modulation sur le fonctionnement de la plante et sa capacité à se défendre. Un second objectif a été de déterminer le potentiel thérapeutique de ces phénolamides identifiés chez la tomate, par des tests de criblage d’activité. Un préalable à la génération de plantes modifié génétiquement pour leur capacité de synthèse de phénolamides, a été d’identifier de nouveaux gènes contrôlant l’accumulation de phénolamides dans la plante. Nous avons exploité notre banque ARN Seq de tomate et des travaux chez d’autres solanacées. Nous avons identifié dix gènes candidats, dont deux codant pour des facteurs de transcription et huit pour des acyltransférases. La caractérisation fonctionnelle de ces candidats n’a, pour le moment, pas mené à l’identification de nouvelle fonction enzymatique associée à la voie des phénolamides. Ce travail devra être poursuivi en élargissant le spectre de substrat testés sur les candidats identifiés et en ciblant d’autres gènes candidats. Pour générer les plantes modifiées génétiquement, j’ai réalisé un travail de développement méthodologique volumineux, ayant nécessité de maitriser au laboratoire des protocoles de transformation et de régénération sur l’espèce tomate, et d’acquérir et maîtriser la technique d’édition de gène (CRISPR/cas9). La technique mise au point conduit à une forte efficacité de transformation, que ce soit en surexpression ou en édition de gène. Nous avons généré ainsi 94 lignées de tomates dont l’expression des gènes de putrescine hydroxycinnamoyl transférase (PHT) responsable de l’accumulation de caféoylputrescine, a été modifiée à la hausse ou à la baisse, tout comme l’expression du facteur de transcription solyc06g083900.2 susceptible d’être impliqué dans l’accumulation d’un ensemble plus large de phénolamides. Les plantes obtenues sont maintenant disponibles pour un travail de caractérisation de leur contenu métabolique et des conséquences physiologiques des modifications générées. Nous avons évalué le potentiel thérapeutique de quelques phénolamides de tomate induits par l’herbivorie de T. absoluta. L’obtention de molécules pures a demandé le concours de chimistes. Parmi les molécules évaluées, la caféoylputrescine et la kukoamine présentent des activités antibactériennes modérées vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Les tests ont révélé la propriété anti-inflammatoire de la caféoylputrescine sur des cellules de macrophage. Ces travaux confirment le potentiel thérapeutique des phénolamides. Ils seront poursuivis en vue de l’évaluation de leurs propriétés anti-cancéreuses.

In the glucose-free environment that is the midgut of the tsetse fly vector, the procyclic form of Trypanosoma brucei primarily uses proline to feed its central carbon and energy metabolism. In these conditions, the parasite needs to produce glucose 6-phosphate (G6P) through gluconeogenesis from metabolism of non-glycolytic carbon source(s). We showed here that two phosphoenolpyruvate-producing enzymes, PEP carboxykinase (PEPCK) and pyruvate phosphate dikinase (PPDK) have a redundant function for the essential gluconeogenesis from proline. Indeed, incorporation of 13C-enriched proline into G6P was abolished in the PEPCK/PPDK null double mutant (Δppdk/Δpepck), but not in the single Δppdk and Δpepck mutant cell lines. The procyclic trypanosome also uses the glycerol conversion pathway to feed gluconeogenesis, since the death of the Δppdk/Δpepck double null mutant in glucose-free conditions is only observed after RNAi-mediated down-regulation of the expression of the glycerol kinase, the first enzyme of the glycerol conversion pathways. Deletion of the gene encoding fructose-1,6-bisphosphatase (Δfbpase), a key gluconeogenic enzyme irreversibly producing fructose 6-phosphate from fructose 1,6-bisphosphate, considerably reduced, but not abolished, incorporation of 13C-enriched proline into G6P. In addition, the Δfbpase cell line is viable in glucose-free conditions, suggesting that an alternative pathway can be used for G6P production in vitro. However, FBPase is essential in vivo, as shown by the incapacity of the Δfbpase null mutant to colonise the fly vector salivary glands, while the parental phenotype is restored in the Δfbpase rescued cell line re-expressing FBPase. The essential role of FBPase for the development of T. brucei in the tsetse was confirmed by taking advantage of an in vitro differentiation assay based on the RNA-binding protein 6 over-expression, in which the procyclic forms differentiate into epimastigote forms but not into mammalian-infective metacyclic parasites. In total, morphology, immunofluorescence and cytometry analyses showed that the differentiation of the epimastigote stages into the metacyclic forms is abolished in the Δfbpase mutant., Author summary Trypanosoma brucei, the parasite responsible for sleeping sickness in humans, is transmitted by the tsetse fly that primarily uses amino acids for its energy production. In the glucose-free environment encountered between the insect blood meals, T. brucei needs to produce through gluconeogenesis glucose 6-phosphate, a key precursor for several essential metabolic pathways. We have shown here that two key gluconeogenic steps, which produce phosphoenolpyruvate and fructose 6-phosphate, respectively, are performed by redundant enzymes (PPDK and PEPCK for phosphoenolpyruvate production; FBPase and a yet unknown enzyme for fructose 6-phosphate production), which highlights the importance of this metabolic pathway for the insect stages of the parasite. Interestingly, deletion of the parasite FBPase gene abolished both the colonisation of the insect salivary glands and the in vitro differentiation of the epimastigote forms into the mammalian infective form of the parasite. Altogether, these data demonstrate for the first time that gluconeogenesis is essential for development of T. brucei in its insect vector and that early development stages of the parasite present in the tsetse midgut are not affected by the absence of FBPase, probably by developing an alternative yet unknown approach to produce fructose 6-phosphate.

Les trichomes sont des structures uni ou pluricellulaires dérivant du protoderme et se développant sur les parties aériennes végétatives et reproductives des plantes. Ces structures sont non-essentielles à la survie de la plante mais remplissent différents rôles dans l’adaptation de la plante à son environnement. Les trichomes pluricellulaires sont souvent séparés en deux groupes, les trichomes glandulaires et les trichomes non-glandulaires. Parmi les trichomes glandulaires, on retrouve des trichomes avec une ou plusieurs petites têtes glandulaires au sommet d’une tige, éventuellement ramifiée (capitate) et des trichomes formant une large glande pourvue d’ un espace de stockage des composés sous-cuticulaire (peltate). La particularité des trichomes glandulaires est leur capacité à synthétiser une grande quantité de métabolites secondaires aussi appelés métabolites spécialisés. Nicotiana tabacum possède à la fois des trichomes glandulaires de type capitate et peltate. Notre compréhension des processus d’initiation et de développement des trichomes multicellulaires glandulaires reste lacunaire pour de nombreuses espèces dont N. tabacum. Ceci, contrairement aux trichomes unicellulaires (non glandulaires), tels que ceux d’Arabidopsis thaliana, où les aspects cytologiques et moléculaires du développement sont déjà bien caractérisés. Pour N. tabacum, l’initiation et le développement des trichomes semble être ordonnés par un réseau transcriptionnel différent de celui opérant chez A. thaliana. Dans le but de découvrir les potentiels intervenants, différentes constructions génétiques sur des gènes supposés intervenir dans l’initiation et le développement des trichomes de cette plante ont été réalisées en vue de la création de lignées transgéniques stables de tabac. En premier lieu, la création de lignées rapportrices pour PDF1 et HEC2 dont les séquences promotrices ont été placées en amont d’un gène rapporteur GUS-Vénus afin de pouvoir déterminer le profil d’activité de ces promoteurs. En second lieu, la création de lignées surexprimant les gènes PDF1, HEC2 et CNR13 avec un promoteur inductible au β-estradiol afin d’observer l’impact de la surexpression de ces gènes sur le phénotype des trichomes de tabac. Et dernièrement, la création d’une lignée entraînant un silencing du gène CNR13 par technique amiRNA avec un promoteur inductible au β-estradiol afin d’observer l’impact du silencing de ce gène sur le phénotype des trichomes de tabac. Trichomes are uni or multicellular structures derived from the protoderm and developing on the aerial vegetative and reproductive parts of plants. These structures are non-essential to the survival of the plant but fulfill different roles in plant adapataion to its environment. The multicellular trichomes are often separated into two groups, the glandular trichomes and the non-glandular trichomes. Glandular trichomes include trichomes with one or more small glandular heads at the top of a stem, possibly branched (capitate), and trichomes forming a large gland with subcutaneous storage space(peltate). The peculiarity of glandular trichomes is their ability to synthesize a large amount of secondary metabolites also called specialized metabolites. Nicotiana tabacum has both glandular trichomes of capitate and peltate type. Our understanding of the initiation and development processes of glandular multicellular trichomes remains deficient for many species including N. tabacum. This, unlike unicellular (non-glandular) trichomes, such as those of Arabidopsis thaliana, where the cytological and molecular aspects of development are already well characterized. For N. tabacum, the initiation and development of trichomes seems to be ordered by a transcriptional network different from that operating in A. thaliana. In order to discover potential stakeholders, various genetic constructs on genes that are supposed to intervene in the initiation and development of trichomes of this plant have been carried out with a view to the creation of stable transgenic tobacco lines. First, the creation of reporter lines for PDF1 and HEC2 whose promoter sequences were placed upstream of a GUS-Venus reporter gene in order to be able to determine the activity profile of these promoters. Secondly, the creation of lines overexpressing the PDF1, HEC2 and CNR13 genes with a β-estradiol inducible promoter in order to observe the impact of the overexpression of these genes on the phenotype of tobacco trichomes. And finally, the creation of a line resulting in a silencing of the CNR13 gene by amiRNA technique with a β-estradiol inducible promoter in order to observe the impact of the silencing of this gene on the tobacco trichome phenotype. Master [120] : bioingénieur en chimie et bioindustries, Université catholique de Louvain, 2018

Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est l’agent responsable de la fièvre typhoïde et cause environ 200 000 morts et 27 millions de cas annuellement. C’est un pathogène entérique dont le réservoir est restreint à l’Homme. Les raisons de cette restriction d’hôte sont méconnues et pourraient dépendre de l’expression de facteurs d’adhésion à des étapes importantes au cours de la pathogenèse. L’annotation bioinformatique du génome de S. Typhi identifie 12 fimbriae de type chaperon-placier (FCP), un curli ainsi qu’un pilus de type IV. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier ces systèmes d’adhésion peu caractérisés. D’abord, le niveau d’expression de ces gènes a été évalué dans différentes conditions de culture in vitro en utilisant une approche de gènes rapporteurs. L’expression des 14 systèmes d’adhésion a été détectée. Nos résultats indiquent qu’une carence en fer favorise l’expression des opérons bcf et csg. Indépendamment du fer, l’expression de bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg et sth est influencée par la richesse nutritive du milieu. L’incubation en milieu LB liquide favorise l’expression de la plupart des systèmes d’adhésion par rapport à un milieu LB liquide sans agitation ou un milieu LB solide. En somme, l’expression des systèmes d’adhésion de S. Typhi a été observée et est influencée par des conditions environnementales. Dans un second volet, nous avons tent de surexprimer les différents systèmes d’adhésion chez une souche d’E. coli ou de S. Typhi afimbriaire. Avec cette approche, nous avons été en mesure de démontrer que l’opéron tcf encode pour un fimbria fonctionnel que l’on a pu observer en microscopie électronique. L’expression de tcf chez une souche afimbriaire d’E. coli et S. Typhi a également diminué leur capacité d’adhésion à des cellules épithéliales intestinales humaines lors d’essais in vitro. Nos observations démontrent que l’expression des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi est influencée par les conditions enviroi9onnementales. Au moins un de ces systèmes est fonctionnel. Ceci suggère une contribution des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi lors de l’interaction de ce pathogène avec l’humain., Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is the etiological agent of typhoid fever which causes more than 200 000 deaths and 27 million cases worldwide, mostly in south Asia. This pathogen can only cause significant symptoms in humans, which are the only recognized animal reservoir. This host restriction is not clearly understood and could depend on the expression of adhesion systems during critical pathogenesis steps. Bioinformatic studies on S. Typhi predict 12 chaperone-usher fimbriae, one curli and one type IV secretion system. The aim of the project was to study those poorly described adhesion systems using two different methodologies. First, transcription levels were evaluated in different in vitro growth conditions using both gfp and β-galactosidase reporter genes. The expression of the 14 adhesion systems was detected, even if some of them were poorly expressed. The expression of bcf and csg was higher during iron-deficiency. Also, the availability of nutrients had an impact on bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg and sth expression, independently of the presence of iron. Most of the adhesion systems showed higher expression levels in liquid LB media with aeration compared to the same media without aeration or supplemented with agar. Secondly, several S. Typhi adhesion systems were cloned into an inducible expression plasmid introduced in both an afimbriated E. coli K-12 strain (ORN172) and an afimbriated S. Typhi strain (ISP1820). This approach enabled us to directly observe the presence of tcf by electron microscopy. Furthermore, the expression of tcf was correlated with a reduction of the capacity of bacteria to adhere to INT-407 human intestinal epithelial cells in an in vitro assay. In summary, this work demonstrates that the putative adhesion systems found in S. Typhi can indeed be expressed and this expression can be regulated by environmental signals. Furthermore, tcf encodes for a functional fimbria which has never before been observed. Taken together, our results suggest a significant contribution of the putative adhesion systems during normal pathogenesis.

Tomato ( Lycopersicon esculentum var MP-1) plants overexpressing Arabidopsis hexokinase 1 (AtHXK1) exhibited high hexokinase (HXK) activity in correlation with drastic phenotypic modifications in fruit. Transgenic fruit and seeds were reduced in size. Reduction in fruit size was due to decreased cell expansion, which could not be corrected by perfusion with sucrose (Suc). Neither could wild type (WT) fruit and seed size be obtained by grafting of transgenic flowers onto WT shoots. Starch and hexose contents were lower but organic and amino acids were higher in transgenic fruit. Lower respiratory rates measured in vitro accompanied by even lower ATP levels and ATP/ADP ratios indicated metabolic perturbations that may explain, in part, reduced fruit and seed size.

The cell wall of marine algae is characterized by the abundance of anionic polysaccharides (sulfated or uronic) which have no equivalent in land plants. These polysaccharides constitute a crucial carbon resource for numerous heterotrophic marine bacteria, which play a central role in the global carbon cycle in the sea. Among these microorganisms, the planctomycete Rhodopirellula baltica appears as a good model to indentify enzymes specific for algal polysaccharides. Its genome contains numerous carbohydrate active enzymes (29GH, 4PL, 17CE and 59 GT, http://www.cazy.org/) and more than 100 sulfatases! In order to understand the molecular basis of the ecological role of R. baltica, I have started a medium-throughput project. Using various bioinformatics tools, I have established that the 120 polysaccharides from R. baltica are constituted by 165 independent structural modules. I have selected 96 targets, based on their structural and/or functional signifiance, cloned into a His-tag vector. 96/96 targets have been successfully transformed into E. coli strain. Recombinant proteins have been overexpressed at low temperature (20°) in an auto-inducer culture medium. The expression and the solubility of the proteins have been tested by SDS-PAGE and Dot-Blot analyses. At least 30 target-proteins have been expressed under a soluble form. Four enzymes have been expressed on a wider scale, then purified, characterized biochemically and studied by cristallography. I could give evidence that at least two of those enzymes have been incorrectly annoted (two glycoside hydrolases of the families GH16 and GH57), and I confirmed the pectase lyase activity on one of them (family PL1), on which cristallographic study have been done. I've also performed some bioinformatic analyses of all the polysaccharide-related enzymes of R. baltica in order to reevaluate the initial annotations of these enzymes, and to sharpen our understanding of the ecological role of this bacterium. These analyses lead me to reconstruct some of the main metabolisms implying polymers degradation. In correlation with my experimental data, I could settle the grounds for wider experiments in the study of those metabolisms.; La paroi des algues marines est caractérisée par une forte abondance de polysaccharides anioniques (sulfatés ou uroniques) qui n'ont pas d'équivalents chez les plantes terrestres. Ils constituent une source de carbone cruciale pour de nombreuses bactéries marines hétérotrophes qui jouent un rôle central dans le cycle global du carbone dans les océans. Parmi ces microorganismes, la planctomycète Rhodopirellula baltica apparaît comme un bon modèle pour identifier les enzymes spécifiques de ces polysaccharides algaux. Son génome contient de nombreuses polysaccharides (29GH, 4PL, 17CE et 59 GT, http://www.cazy.org/) ainsi que plus de 100 sulfatases ! Dans le but de comprendre les bases moléculaires du rôle écologique de R. baltica, j'ai procédé à une étude à moyen-débit des polysaccharides de cette bactérie. Aidés de divers outils bioinformatiques, j'ai établi que les 120 polysaccharides de R. baltica sont constitués de 165 modules structuralement indépendants. J'ai sélectionné 96 cibles parmi ces modules, en fonction de leur intérêt structural et/ou fonctionnel, et les ait inséré dans un vecteur avec une étiquette poly-His. 92/96 gènes ont été clonés avec succès dans une souche E. coli. La surexpression des protéines recombinantes a été réalisée à basse température (20°) dans un milieu de culture auto-inducteur. Leur expression et solubilité ont été testées par des analyses en SDS-PAGE et Dot-Blot. Au moins 30 protéines-cibles ont été exprimées sous forme soluble. Quatre polysaccharides ont été surexprimées en plus grand volume, purifiées, caractérisées biochimiquement et cristallographiquement. J'ai pu mettre en évidence qu'au moins deux de ces enzymes avaient été annotées incorrectement (deux glycoside hydrolases des familles GH16 et GH57), et j'ai confirmé l'activité pectase lyase de l'une d'entre elles (famille PL1), dont plusieurs jeux de données ont été collectés. Parallèlement, j'ai réalisé une étude bioinformatique de l'ensemble des polysaccharides de R. baltica pour réévaluer les annotations initiales de ces enzymes et affiner le rôle de dégradeur mobile que constitue cette bactérie. Cette analyse a permis de reconstruire les grandes voies métaboliques impliquant des polysaccharides complexes et, conjointement avec mes analyses expérimentales, de préparer le terrain à des analyses plus poussées de caractérisation de ces voies métaboliques.

Maintenance of the genomic integrity is crucial for all living organisms. Since cells are continuously submitted to genotoxic stresses that induce DNA damages, they have evolved sophisticated mechanisms to detect, signal the presence of, and repair these lesions. Among sources of DNA damage, UV radiation alters DNA structure and can cause mutations and chromosomal translocations. In humans, Nucleotide Excision Repair (NER) is an efficient way to remove DNA lesions induced by UV or ionizing radiation. NER inactivation leads to cell death and increase the susceptibility to develop diseases such as cancer and hereditary disorders. Among numerous proteins involved in the NER pathway, XPA and XPC can trigger the expression of several secondary genes such as KIN17 which encodes a 45 kDa protein. In order to elucidate the biological function of KIN17, biochemical and structural studies of its domains were performed. This thesis work focus on the region 51-160 of the human protein. NMR and Molecular Modelling studies showed that this region adopts a winged helix fold mainly know for its ability to bind nucleic acids. However, structure-activity relationships revealed that the Winged Helix of human KIN17 is not able to bind DNA or RNA. On the other hand, this domain exhibits a highly conserved surface involved in intramolecular interactions with the N-terminal region of the protein.; Le maintien de l'intégrité du patrimoine génétique est essentiel à la survie des organismes vivants. Face aux nombreuses sources de stress génotoxiques qui induisent des dommages de l'ADN, les cellules ont mis en place des mécanismes complexes capables de détecter et réparer ces lésions. Parmi ces sources, figurent les rayonnements ultraviolets (UV) contenus dans la lumière solaire, qui modifient la structure de l'ADN et peuvent conduire à l'introduction de mutations. Chez l'homme, la grande majorité des dommages de l'ADN produits par les rayonnements est éliminée par le système NER (Nucleotide Excision Repair), un système capable d'exciser les nucléotides lésés et de les remplacer. Une déficience de cette voie de réparation peut mener à l'apoptose (mort programmée des cellules), et augmente la susceptibilité de développer des maladies graves telles que le cancer. Le système NER met en œuvre de nombreuses protéines impliquées dans des mécanismes variés tels que la détection, la signalisation, ou la réparation de l'ADN. La protéine eucaryote KIN17, récemment découverte dans le noyau de la cellule humaine, semble appartenir à ce système de réparation. Cependant, son rôle précis dans la réponse aux dommages de l'ADN reste à ce jour inconnu. C'est pourquoi, nous avons entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine (domaine K2) afin d'améliorer la connaissance de ses fonctions, de ses partenaires biologiques, et de ses modes de fonctionnement. La première partie de ce manuscrit est consacrée à la préparation de l'échantillon de protéine en vue d'une analyse structurale par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Le travail a dans un premier temps consisté à choisir et optimiser le système d'expression de domaines structuraux d'une autre protéine : la proline déshydrogénase PRODH. Dans un second temps, la meilleure stratégie de préparation de l'échantillon a été appliquée à la protéine KIN17 pour produire, puis résoudre la structure tridimensionnelle du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire. Nous avons montré que la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine adopte un repliement caractéristique de la famille structurale « Winged Helix » des protéines de liaison aux acides nucléiques. Cependant, l'analyse des détails structuraux du domaine K2, la comparaison avec des protéines de fonction connue de la même classe structurale, et des études électrophorétiques, révèlent l'incapacité de ce domaine à lier l'ADN et l'ARN de manière autonome. En revanche, nous avons mis en évidence, par une étude RMN complémentaire, l'existence d'une surface ultra conservée impliquée dans des interactions de type protéine-protéine intra-moléculaires entre le motif « Winged Helix » de la région 51-160 et la région N-terminale 1-50 de KIN17 humaine.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Maintenance of the genomic integrity is crucial for all living organisms. Since cells are continuously submitted to genotoxic stresses that induce DNA damages, they have evolved sophisticated mechanisms to detect, signal the presence of, and repair these lesions. Among sources of DNA damage, UV radiation alters DNA structure and can cause mutations and chromosomal translocations. In humans, Nucleotide Excision Repair (NER) is an efficient way to remove DNA lesions induced by UV or ionizing radiation. NER inactivation leads to cell death and increase the susceptibility to develop diseases such as cancer and hereditary disorders. Among numerous proteins involved in the NER pathway, XPA and XPC can trigger the expression of several secondary genes such as KIN17 which encodes a 45 kDa protein. In order to elucidate the biological function of KIN17, biochemical and structural studies of its domains were performed. This thesis work focus on the region 51-160 of the human protein. NMR and Molecular Modelling studies showed that this region adopts a winged helix fold mainly know for its ability to bind nucleic acids. However, structure-activity relationships revealed that the Winged Helix of human KIN17 is not able to bind DNA or RNA. On the other hand, this domain exhibits a highly conserved surface involved in intramolecular interactions with the N-terminal region of the protein., Le maintien de l'intégrité du patrimoine génétique est essentiel à la survie des organismes vivants. Face aux nombreuses sources de stress génotoxiques qui induisent des dommages de l'ADN, les cellules ont mis en place des mécanismes complexes capables de détecter et réparer ces lésions. Parmi ces sources, figurent les rayonnements ultraviolets (UV) contenus dans la lumière solaire, qui modifient la structure de l'ADN et peuvent conduire à l'introduction de mutations. Chez l'homme, la grande majorité des dommages de l'ADN produits par les rayonnements est éliminée par le système NER (Nucleotide Excision Repair), un système capable d'exciser les nucléotides lésés et de les remplacer. Une déficience de cette voie de réparation peut mener à l'apoptose (mort programmée des cellules), et augmente la susceptibilité de développer des maladies graves telles que le cancer. Le système NER met en œuvre de nombreuses protéines impliquées dans des mécanismes variés tels que la détection, la signalisation, ou la réparation de l'ADN. La protéine eucaryote KIN17, récemment découverte dans le noyau de la cellule humaine, semble appartenir à ce système de réparation. Cependant, son rôle précis dans la réponse aux dommages de l'ADN reste à ce jour inconnu. C'est pourquoi, nous avons entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine (domaine K2) afin d'améliorer la connaissance de ses fonctions, de ses partenaires biologiques, et de ses modes de fonctionnement. La première partie de ce manuscrit est consacrée à la préparation de l'échantillon de protéine en vue d'une analyse structurale par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Le travail a dans un premier temps consisté à choisir et optimiser le système d'expression de domaines structuraux d'une autre protéine : la proline déshydrogénase PRODH. Dans un second temps, la meilleure stratégie de préparation de l'échantillon a été appliquée à la protéine KIN17 pour produire, puis résoudre la structure tridimensionnelle du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire. Nous avons montré que la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine adopte un repliement caractéristique de la famille structurale « Winged Helix » des protéines de liaison aux acides nucléiques. Cependant, l'analyse des détails structuraux du domaine K2, la comparaison avec des protéines de fonction connue de la même classe structurale, et des études électrophorétiques, révèlent l'incapacité de ce domaine à lier l'ADN et l'ARN de manière autonome. En revanche, nous avons mis en évidence, par une étude RMN complémentaire, l'existence d'une surface ultra conservée impliquée dans des interactions de type protéine-protéine intra-moléculaires entre le motif « Winged Helix » de la région 51-160 et la région N-terminale 1-50 de KIN17 humaine.

This work aimed to characterize and produce two new biocatalysts which hydrolyze two polysaccharides extracted from the cell wall of red algae (γ-carrageenan) and brown algae (fucoidan). These extracellular endo-hydrolases are produced by two saprophytic marine bacteria, Pseudoalteromonas carrageenovora, (y-Proteobacteria), and SW5 (Bacteroidetes). Following the purification ofwild-type proteins, their genes were cloned and sequenced. The recombinant activity obtained by overexpression in E. coli confirmed that the cloned sequences coded for corresponding enzymes. Sequence analysis showed that the enzymes have a modular structure. The catalytic domain of the γ-carrageenase was net identified. This enzyme is therefore different from previously described glycoside hydrolases, and aise distinct from previously known carrageenases. The fucoidanase sequence shares similarity with two other bacterial putative fucoïdanase and these three enzymes define a new glycosidase family.; Ce travail visait à caractériser et produire deux enzymes originaux hydrolysant d'une part un polysaccharide pariétal d'algue rouge (le γ-carraghénane), et d'autre part un polysaccharide d'algue brune (le fucoïdane). Ces deux endo-hydrolases extracellulaires sont produites par deux bactéries marines saprophytes, P. carrageenovora, et SW5. Suite à la purification des deux enzymes sauvages, leur[s] gène[s] ont été clonés puis séquencés. L'activité recombinante obtenue par surexpression dans E. coli a validé les séquences obtenues. L'analyse de ces dernières montre l'architecture modulaire des deux protéines. Cependant, le domaine catalytique de la γ-carraghénase n'a pas pu être identifié. Il s'agit donc d'un membre orphelin des glycoside hydrolases, distinct des carraghénases préalablement caractérisées. A l'inverse, les similitudes partagées par la séquence de la fucoïdanase avec deux autres fucoïdanases, a permis de définir une nouvelle famille de glycoside hydrolases.

This work aimed to characterize and produce two new biocatalysts which hydrolyze two polysaccharides extracted from the cell wall of red algae (γ-carrageenan) and brown algae (fucoidan). These extracellular endo-hydrolases are produced by two saprophytic marine bacteria, Pseudoalteromonas carrageenovora, (y-Proteobacteria), and SW5 (Bacteroidetes). Following the purification ofwild-type proteins, their genes were cloned and sequenced. The recombinant activity obtained by overexpression in E. coli confirmed that the cloned sequences coded for corresponding enzymes. Sequence analysis showed that the enzymes have a modular structure. The catalytic domain of the γ-carrageenase was net identified. This enzyme is therefore different from previously described glycoside hydrolases, and aise distinct from previously known carrageenases. The fucoidanase sequence shares similarity with two other bacterial putative fucoïdanase and these three enzymes define a new glycosidase family.; Ce travail visait à caractériser et produire deux enzymes originaux hydrolysant d'une part un polysaccharide pariétal d'algue rouge (le γ-carraghénane), et d'autre part un polysaccharide d'algue brune (le fucoïdane). Ces deux endo-hydrolases extracellulaires sont produites par deux bactéries marines saprophytes, P. carrageenovora, et SW5. Suite à la purification des deux enzymes sauvages, leur[s] gène[s] ont été clonés puis séquencés. L'activité recombinante obtenue par surexpression dans E. coli a validé les séquences obtenues. L'analyse de ces dernières montre l'architecture modulaire des deux protéines. Cependant, le domaine catalytique de la γ-carraghénase n'a pas pu être identifié. Il s'agit donc d'un membre orphelin des glycoside hydrolases, distinct des carraghénases préalablement caractérisées. A l'inverse, les similitudes partagées par la séquence de la fucoïdanase avec deux autres fucoïdanases, a permis de définir une nouvelle famille de glycoside hydrolases.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.