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Orientador: Roger Frigerio Castilho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A acidemia metilmalônica (MMAemia) é uma desordem metabólica hereditária do metabolismo de aminoácidos com cadeia ramificada e de ácidos graxos com cadeia ímpar, envolvendo um defeito na conversão de metilmalonil-CoA a succinil-CoA. Manifestações sistêmicas e neurológicas nesta doença são relacionadas com o acúmulo de metilmalonato (MMA) em tecidos e fluidos biológicos e com o comprometimento do metabolismo energético. Neste trabalho, verificou-se que o MMA inibiu com grande intensidade a conversão de lactato a piruvato catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH) em homogenatos de fígado e cérebro de rato. A conversão de piruvato a lactato, catalisada pela LDH, foi menos sensível à inibição por MMA. Estudos de cinética enzimática sobre a inibição da LDH de cérebro, utilizando-se lactato como substrato, indicaram que o MMA inibe esta enzima competitivamente (Ki = 3,02 ± 0,59 mM). Propôs-se que a inibição da conversão lactato/piruvato por MMA contribui para a fisiopatologia da MMAemia, resultando, dentre outras alterações, em acúmulo de lactato e acidemia metabólica. Mostrou-se que, em mitocôndrias isoladas de cérebro e músculo de rato, concentrações milimolares de MMA inibiram o consumo de O2 mantido por succinato, enquanto nenhum efeito inibitório foi observado quando substratos para os complexos I ou IV foram utilizados. Notadamente, o efeito inibitório de MMA, mas não de malonato, no consumo mitocondrial de O2 mantido por succinato foi minimizado quando uma permeabilização não-seletiva das mitocôndrias foi induzida por alameticina. Em adição, o MMA apresentou apenas um pequeno efeito inibitório no consumo de O2 por partículas submitocondriais invertidas na presença de succinato. Não se obteve evidência de produção de malonato nas mitocôndrias tratadas com MMA. Conclui-se que o MMA inibe o consumo mitocondrial de O2 na presença de succinato por interferir na captação deste substrato pela mitocôndria. A inibição do transporte mitocondrial de substratos, induzida pelo MMA, através do carreador de dicarboxilatos, pode ter importantes implicações fisiopatológicas na MMAemia. Comparou-se a suscetibilidade de mitocôndrias isoladas de fígado, rim e coração de rato, assim como de diferentes subregiões cerebrais quanto à transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) induzida por 3-nitropropionato (3-NP) e Ca2+. A MPT foi estimada pela queda do potencial elétrico transmembrana e inchamento mitocondrial sensíveis à ciclosporina A. Mitocôndrias de cérebro e coração foram mais suscetíveis à MPT induzida por 3-NP e Ca2+ que organelas isoladas de fígado e rim. A comparação de mitocôndrias de diferentes regiões cerebrais indicou que uma inibição parcial da respiração por 3-NP resultou em MPT mais rapidamente em organelas estriatais que corticais ou cerebelares. Em ratos tratados sistemicamente com 3-NP, verificou-se uma inibição de mesma magnitude da succinato desidrogenase em todos os tecidos estudados. Notadamente, mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados sistemicamente com 3-NP apresentaram uma maior suscetibilidade à MPT induzida por Ca2+ quanto comparadas a controles. Propôs-se que a maior suscetibilidade do estriado à neurodegeneração induzida por 3-NP pode ser, pelo menos em parte, explicada por uma maior vulnerabilidade desta região cerebral à MPT, juntamente com a vulnerabilidade desta região ao influxo de Ca2+ citosólico mediado pelo estímulo de receptores de glutamato Abstract: Methylmalonic acidemia (MMAemia) is an inherited metabolic disorder of branched amino acid and odd-chain fatty acid metabolism, involving a defect in the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to succinyl-coenzyme A. Systemic and neurological manifestations in this disease are thought to be associated with the accumulation of methylmalonate (MMA) in tissues and biological fluids with consequent impairment of energy metabolism. In the present work it was observed that MMA potently inhibited lactate dehydrogenase (LDH)-catalyzed conversion of lactate to pyruvate in liver and brain homogenates. LDH was about one order of magnitude less sensitive to inhibition by MMA when catalyzing the conversion of pyruvate to lactate. Kinetic studies on the inhibition of brain LDH indicated that MMA inhibits this enzyme competitively with lactate as a substrate (Ki = 3.02 ± ?0.59 mM). We proposed that inhibition of the lactate/pyruvate conversion by MMA contributes to the MMAemia physiophatology, leading to lactate accumulation and metabolic acidemia. While millimolar concentrations of MMA inhibit succinate-supported O2 consumption by isolated rat brain or muscle mitochondria, there is no effect when either a pool of NADH-linked substrates or N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamine (TMPD)/ascorbate were used as electron donors. Interestingly, the inhibitory effect of MMA, but not of malonate, on succinate-supported brain mitochondrial O2 consumption was minimized when nonselective permeabilization of mitochondrial membranes was induced by alamethicin. In addition, only a slight inhibitory effect of MMA was observed on succinate-supported O2 consumption by inside-out submitochondrial particles. Under our experimental conditions, there was no evidence of malonate production in MMA-treated mitochondria. We conclude that MMA inhibits succinate-supported mitochondrial O2 consumption by interfering with the uptake of this substrate. MMA-induced inhibition of substrate transport by the mitochondrial dicarboxylate carrier may have important physiopatological implications. The susceptibility of isolated mitochondria from liver, kidney and heart and different rat brain regions (striatum, cortex and cerebellum) was compared regarding to mitochondrial permeability transition (MPT) evoked by 3-nitropropionate (3-NP) and Ca2+ ions. In general, isolated brain mitochondria from different regions were more sensitive to 3-NP and Ca2+ toxicity than mitochondria from liver and kidney as estimated by decrease in the transmembrane electrical potential and mitochondrial swelling. The comparision of different brain regions revealed that the inhibition of 50% of the mitochondrial succinate-supported respiration elicited by 3-NP resulted in a Ca2+-induced MPT pore opening, inhibited by cyclosporin A, faster in striatal than in cortical and cerebellar mitochondria. It was verified an inhibition of succinate dehydrogenase activity from the same magnitude in all tissues studied after a 3-NP systemic treatment. Interestingly, isolated forebrain mitochondria obtained from rats systemically treated with 3-NP showed a more pronounced susceptibility to Ca2+-induced MPT pore opening when compared to control rats. We proposed that the increased susceptibility of rat striatum to 3-NP-induced neurodegeneration could be in part explain by a region-specific susceptibility to MPT together with increase vulnerability of this brain region to glutamate receptors-mediated cytosolic Ca2+ influx Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) se caracteriza por ser un trastorno crónico inflamatorio que afecta al tracto gastrointestinal. Se clasifica a su vez en dos tipos: enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Actualmente es una enfermedad cuya preva lencia e incidencia está en aumento, por lo que surge la necesidad de investigar y evaluar nuevas dianas terapéuticas como alternativa al tratamiento convencional. Por ello, este estudio se centra en tres elementos diferentes, polifenoles, succinato y micr obioma, con el objetivo de comprender sus posibles mecanismos de acción y las ventajas que pueden aportar a la terapéutica de la enfermedad. Los polifenoles intervienen en múltiples rutas de señalización relacionadas con la inflamación, además de poseer pr opiedades antioxidantes, por lo que sería de interés profundizar en el uso de estos compuestos naturales durante la enfermedad. Universidad de Sevilla. Grado en Farmacia

Com o incremento exponencial da avicultura no Brasil, a disponibilidade de dejetos de aves e de cama de aviário tem aumentado de maneira semelhante. A proibição de uso desses produtos na ração animal tem feito com que eles sejam direcionados para a produção agrícola como fertilizantes. Ainda há na literatura carência de informação sobre lixiviação de bases no perfil do solo em conseqüência do efeito de ânions inorgânicos acompanhantes, como cloreto, nitrato e sulfato, e do efeito complexante de ácidos orgânicos de baixa massa molecular. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da aplicação de cama de aviário na lixiviação de Ca, Mg, K e Na em solos e sua associação com ânions inorgânicos e ácidos orgânicos de baixa molecular. Amostras de dois Latossolos Vermelho-Amarelos, um de textura média e outro de textura argilosa, foram colocadas em colunas de PVC constituídas de cinco anéis, cada um com 10 cm de altura e 5 cm de diâmetro, ligados entre si com fita adesiva. O solo colocado no anel superior recebeu, homogeneamente, cinco tipos de camas de aviário: casca de café, casca de arroz, sabugo de milho, capim-napier e maravalha, totalizando 160 t ha-1 de material seco, comparado à testemunha (sem a cama de aviário). O experimento constituiu um fatorial 5 x 2, com cinco camas e dois solos, dispostos em blocos casualizados com três repetições. As colunas foram submetidas a 10 percolações com água deionizada, duas vezes por semana, até atingirem o volume de 1.200 mm de chuvas. Nos 10 percolados, foram analisadas as concentrações de Ca, Mg, K e Na, dos ânions Cl-, NO3-e SO4(2-) e de ácidos orgânicos de baixa massa molecular. Houve grande lixiviação de bases nas colunas, principalmente até a terceira percolação. Esse fato foi causado pela adição dessas bases, em doses elevadas, pelas camas de aviário e, aparentemente, também pelo efeito dos ânions acompanhantes Cl-, NO3-e SO4(2-)no solo de textura média, Cl-e NO3-no solo de textura argilosa e, de maneira menos expressiva, pelo efeito acompanhante/complexante dos ácidos orgânicos de baixa massa molecular. No solo argiloso, a percolação de Ca esteve positivamente correlacionada com a concentração dos ácidos málico e oxálico. A concomitante elevada concentração de ácido acético nos percolados de solos tratados com todas as camas sugere que este pode estar favorecendo a lixiviação de bases no solo, provavelmente como ânion acompanhante. The exponential growth in poultry farming in Brazil has led to a parallel increase in the production of manure and poultry litter. The litter generated in this activity used to be largely employed as cattle feed. However, the enactment of a law that bans the use of poultry litter as animal feed intensified its use as organic fertilizer in agriculture. Despite its importance, there are gaps in our knowledge on an adequate use to obtain high plant yields without threatening the environment. One of these gaps is base-leaching in the soil profile as a result of the presence of accompanying anions such as chloride, nitrate and sulphate, and the complexing effect of low molecular mass organic acids. Samples of two Oxisols (a clayey and a sandy loam Red-Yellow Latosol) were placed in PVC columns. Each column consisted of five PVC rings (5 cm diameter, 10 cm height) fixed to each other with scotch tape. Five types of poultry litter (coffee husks, ground corn cob, rice husk, napier grass and wood shavings) were homogenously applied to the soil in the top ring in a dose equivalent to 160 t ha-1 (dry weight basis). The treatments consisted of a 5 x 2 + 1 factorial combination, corresponding to five poultry litter types, two soils with distinct textures, and a control treatment with no poultry litter application, with five repetitions, arranged in a complete randomized block design. Deionized water was applied on top of the columns twice a week, in a total volume corresponding to 1.200 mm, totaling 10 applications. Leachates were analyzed for cations (Ca, Mg, K and Na), anions (Cl-, NO3-and SO4(2-)) and low molecular mass organic acids by ion chromatography. Results indicate substantial base-leaching through the soil columns, particularly up to the third percolation. This was most likely a result of the presence of bases contained in the high poultry litter doses and the presence of accompanying anions (Cl-, NO3-and SO4(2-)in the sandy loam soil and Cl-and NO3-in the clayey soil). Ca leaching was positively correlated with the malic and oxalic acid concentrations in the clayey soil. High acetic acid concentration in leachates of poultry litter-treated soils suggest that it may have favored base-leaching in the soil profile as a result of its action as an ion pair.

The influence of succinate treatment on Zn toxicity was investigated using plant growth and mineral uptake as stress indicators. Pea plants (Pisum sativum L., cv. Citrine) were treated with various Zn concentrations (0.67 to 700 muM Zn) in the presence and absence of 0.2 mM Na-succinate. Plants pre-treated with succinate and then exposed to Zn exhibited higher dry root, stem and leaf weight than the plants treated with Zn alone. An increase in Zn supply resulted in a decrease in the concentrations of Ca, Mg, P in the roots and an increase of Ca and N levels in the stems and leaves. The amount of Zn in the roots, stems and leaves increased with greater Zn rates. The succinate treatment increased P in the roots but did not affect the Ca, N and Mg contents in Zn-treated plants. Most of the Zn taken up was retained in the roots after succinate treatment. The ameliorative effect of succinate on plant growth could be due to a lower Zn translocation in the leaves and stems and increased Zn accumulation in the roots. Lower Zn translocation in aboveground parts seemed to result from Zn complexing by organic anion in the roots. This probably caused less Zn transport to the stems and leaves and suggested that succinate has potential for complexing with Zn and may play a role in tolerance to high Zn levels. A influência do ácido succínico na toxicidade de Zn foi estudada, tendo-se o crescimento das plantas e a absorção mineral como parâmetros indicadores de estresse. Plantas de ervilha (Pisum sativum L., cv. Citrine) foram tratadas com várias concentrações de Zn (0,67 a 700 miM) na presença ou ausência de 0,2 mM de succinato de sódio. Plantas pré tratadas com succinato e então expostas ao Zn apresentaram maior massa seca de raízes, caules e folhas que plantas apenas tratadas com Zn. Aumento no fornecimento de Zn resultou em decréscimo nas concentrações de Ca, Mg, P nas raízes, mas aumento de Ca e N levels nos caules e folhas. A quantidade de Zn nas raízes, caules e folhas aumentou com o aumento do suprimento de Zn. O tratamento com succinato levou ao aumento P nas raízes e não afetou os conteúdos de Ca, N, Mg nas plantas tratadas com Zn. A maior parte do Zn absorvido ficou retido nas raízes depois do tratamento com o succinato. A melhora causada pelo succinato no crescimento das plantas talvez tenha sido devido ao acúmulo de Zn nas raízes, em função da maior complexação pelo íon orgânico, havendo menor translocação para as folhas e caules.

Süksinik asitin iyonlaşmasıyla oluşan süksinat (sue) anyonunun, 1,10-fenantrolin (phen) ve etilendiamin (en) içeren karışık ligantlı Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) ve Hg(II) kompleksleri sentezlenerek, spektroskopik ve termik özellikleri incelendi. Metal kompleksleri, metal süksinatlar ve amin ligantlarım içeren çözeltilerin kanştınlmasıyla hazırlandı. Komplekslerin manyetik duyarlıkları ölçülerek spin manyetik momentleri hesaplandı. Co(II), Ni(II) ve Cu(II) komplekslerinin paramanyetik, Zn(II), Cd(II) ve Hg(II) komplekslerinin ise beklenildiği gibi diyamanyetik olduğu belirlendi. Komplekslerin elementel analiz, İR ve UV-VIS çalışmalan yapıldı. Bu çalışmalar sonucunda Co(II) ve Ni(II)-phen kompleksleri ile Cu(ü) ve Zn(II)-en komplekslerinin oktahedral, diğerlerinin ise tetrahedral geometriye sahip oldukları önerildi. Komplekslerde Metal:suc oram lrl'dir. M-phen oranının Co(II) ve Ni(II) kompleksi için 1:2, diğerleri için 1:1 olduğu belirlendi, en kompleksleri için M-en oranının Cu(II) ve Zn(II) komplekslerinde 1:2, Ni(II), Cd(II) ve Hg(II) komplekslerinde ise 1:1 olduğu tespit edildi. Komplekslerin İR spektrumlarında, sue ligantma ait olan asimetrik ve simetrik karboksilat gerilme frekansları arasındaki farka bakılarak ligantın metale kaç dişli olarak bağlandığı açıklandı. Komplekslerin termik davranışları TG, DTG ve DTA teknikleri ile incelendi. Bu çalışmalar sonucunda, hidrat veya ligant suyu içeren komplekslerin öncelikle sularım kaybettikleri, daha sonra da amin ligantlanmn ayrılmasıyla kararlı metal-süksinat ara ürününün oluştuğu belirlendi. Bu ara ürünlerin de daha yüksek sıcaklıklarda, karşılık gelen metal oksitleri oluşturmak üzere bozunduğu belirlendi. Elde edilen kristallerden aquabis(l,10-fenantrolin)süksinatokobalt(II) 1,5 hidrat, monobütanol; [Co(suc)(H20)(phen)2].l,5H2O.C4HıoO kompleksinin yapısı tek kristal X-ışınlan kırınımı yöntemiyle aydınlatıldı. Çözücü olarak kullanılan bütanol11 moleküllerinden bir tanesinin de kompleksin yapısına dahil olarak kristali hidrojen bağlarıyla kararlı kıldığı görüldü. Bu komplekste Co(II) iyonu bir su, bir sue ve iki phen ligantı içeren bozulmuş oktahedronun merkezindedir, sue ligantı negatif yüklü oksijen atomlarından birini kullanarak metale tek dişli olarak bağlanmıştır, phen ise N atomlarından iki dişli olarak metali koordine etmiştir. Yapıda kristal suları da bulunmaktadır. Ayrıca tetraaquabis(l,10-fenantrolin)-di-a-süksinato-di-mangan(II) dihitrat kristalinin yapısı da tek kristal X-ışınlan kırınımı yöntemiyle aydınlatıldı. Bu kompleks dimerik olarak kristallenmektedir. sue ligantlan ise şelatlayıcı ve köprü olarak metal iyonunu negatif yüklü oksijen atomları üzerinden koordine etmiştir. Molekül geometrisi aşın bozulmuş oktahedrondur. Anahtar kelimeler: süksinat kompleksleri, süksinato, metal süksinatlar, 1,10- fenantrolin ve etilendiamin kompleksleri. Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) and Hg(II) complexes of succinate (sue) with 1,10-phenanthroline (phen) and ethylenediamine (en) have been prepared and characterized by means of spectroscopic and thermal methods. Metal complexes have been prepared by mixing the metal-succinates and amine ligands. Spin-only magnetic moments of the complexes were calculated by measuring their magnetic susceptibility. The Co(II), Ni(II) and Cu(II) complexes found to be paramagnetic while the Zn(II), Cd(II) and Hg(II) complexes were diamagnetic, as expected. Elemental analysis, IR and UV-VIS studies of the complexes were carried out. From these observation it was suggested that the Ni(II), Co(II) complexes with phen and Cu(II) and Zn(II) complexes with en have octahedral geometry while the others have tetrahedral. Metal-suc ratio were 1:1 for all complexes. M-phen ratio were 1:2 for Co(II) and Ni(II) complexes, but 1:1 for the others. M-en ratio were found 1:2 for Cu(II) and Zn(II) complexes, but 1:1 for Ni(II), Cd(II) and Hg(II) complexes. The frequency changes of COO` vibrations of the sue ligand were used to explain its coordination behaviour. Thermal behaviour of the complexes were studied by TG, DTG and DTA techniques in static air atmosphere. The thermal decomposition behaviour of the complexes may be summarized as follows. They lose their lattice and/or ligand water molecules in the first stage of decomposition. At the next stage, complexes form stable metal(II)-sucs after elimination of amin ligands. Finally, the decompositions come to end to give the respective metal oxides. The structure of [Co(suc)(H20)(phen)2].l,5H2O.C4HioO complex was determined by single crystal X-ray diffraction method. It crystallizes as a monobutanol solvate. In the complex, the cobalt ion lies on the centre and shows a distorted octahedral coordination with one aqua, one sue and two phen ligands. The sue acts as a monodentate ligand through one of the negatively charged O atoms, while phen behavesIV as N-donor bidentate ligand. The crystal also contains disordered lattice water molecules and the structure is stabilized by extensive hydrogen bonding to form a three- dimensional infinite network. And also crystal structure of tetraaquabis(l,10-phenanthrolme)-di-u.-succinato- di-manganese(II) dihydrate complex was determined by single crystal X-ray diffraction method. It crystallizes in a dimeric form and the sue ligands behave as chelating and bridging by using their negatively charged O atoms. The coordination geometry is found as a hardly distorted octahedron. Keywords: succinate complexes, succinato, metal succinates, ethylenediamine and 1,10-phenanthroline complexes. 87