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Legionella pneumophila ist ein gramnegatives Bakterium, das sich als intrazelluläres Pathogen, neben Amöben als natürlichen Wirt, auch in alveolaren Makrophagen vermehren kann. Dort löst es das Pontiac-Fieber, oder in schwerwiegenderen Fällen die Legionärskrankheit aus, welche durch eine schwere Pneumonie charakterisiert ist. Das Ziel dieser Arbeit war es ein Hochdurchsatzverfahren zu entwickeln. Durch dieses sollte es ermöglicht werden, eine große Anzahl an Substanzen zu untersuchen und so eine erweiterte Einsicht in die Interaktion zwischen Legionellen und Makrophagen zu gewinnen. Mit dieser Methode wurden Proben einer miRNA-Library und Proben einer selbst zusammengestellten Sammlung aus bioreaktiven Substanzen untersucht. Dabei wurde das Verhältnis zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen sowie die Infektionsstärke abhängig von der Behandlung bestimmt. Als Versuchsmodell dienten differenzierte THP-1 Zellen um Makrophagen zu imitieren, die in Folge mit Legionella pneumophila des Stammes Corby infiziert wurden. Obwohl die Analyse der miRNA-Library technische Schwierigkeiten offenbarte, konnten mit miRNA-101-3p, miRNA-106a-5p und miRNA-107, drei miRNAs identifiziert und validiert werden, die die Infektion der Makrophagen steigerten. Über Massenspektrometrie wurden, durch die miRNAs regulierte Proteine detektiert, um Aufschluss darüber zu geben, wodurch die Steigerung der Infektion bedingt ist. In Folge zeigten sich mehrere Proteinklassen sowie Signalwege, die durch die Transfektion der miRNAs, eine veränderte Proteinkonzentration aufwiesen und eine potentielle Beteiligung in dieser Infektion haben. Durch die Analyse der bioreaktiven Substanzen wurden mit 25-hydroxy Cholesterol, H-89, Fluoxetin, Forskolin und W-7, fünf Substanzen gefunden, die in diesem Infektionskontext unbekannt waren. Da die Kontrolle Amitriptylin und Fluoxetin als Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase agieren, wurden mit Benztropin und Perhexilin zwei weitere Substanzen getestet, die dieses Protein inhibieren. Erneut zeigte sich eine starke Reduktion der Infektionsrate, was auf die Relevanz dieses Protein während des Infektionsgeschehens hindeutet. Dies wird auch dadurch bestärkt, dass sowohl Makrophagen als auch Legionellen die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu regulieren scheinen. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit eine Screening-Methode etabliert die es, trotz Limitationen, erlaubt eine erhöhte Anzahl an Proben auf deren Einfluss auf die Legionellen-Makrophagen Interaktion zu testen. Die von den drei miRNAs sowie fünf Substanzen regulierten Proteinklassen und Signalwege geben Anhaltspunkte für die weitere Forschung.

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021; Aachen : RWTH Aachen University 1 Online-Ressource : Illustrationen (2021). = Dissertation, RWTH Aachen University, 2021, Acid sphingomyelinase (ASM), an important regulator of the sphingolipid metabolism, catalyzes the hydrolysis of sphingomyelin into ceramide, which regulates various cellular processes as a secondary mediator. Previous studies on the role of ASM in T-lymphocytes show that ASM is considered to play a central role in the adaptive T-cell immune response and represents a potential, new therapeutic target for autoimmune and chronic inflammatory diseases such as bronchial asthma. The aim of this study was to investigate the immunological effects of Asm in allergic TH2-directed bronchial asthma. Therefore, the role of Asm-deficiency and Asm-inhibition via amitriptyline were characterized in vivo in the murine model of ovalbumin-induced bronchial asthma. Lung function analysis on the flexiVent-system showed that Asm-deficiency/inhibition led to an improved lung function due to reduced bronchial hyperreactivity. Using flow cytometry and immunoassays to detect the immune cell influx and T-cell immune response in BALF, we found a protective effect of an Asm-deficiency/inhibition in ovalbumin-induced bronchial asthma, caused by a decreased influx of immune cells, especially eosinophilic granulocytes. This resulted in a reduced secretion of the TH2-cytokines IL-4 and IL-5 into BALF. First results on molecular mechanisms of action of Asm-deficiency or Asm-inhibition via amitriptyline could be obtained in vitro after T-cell stimulation and TH2-differentiation. For a more detailed examination of TH2-signaling pathways, analyses of apoptosis/necrosis, cell viability, respiratory chain inhibition, cell proliferation and calcium influx were performed. In addition, TH2-typical cell surface proteins, transcription factors and cytokines were investigated on protein and gene levels by ELISA, flow cytometry and qPCR. We observed that Asm-deficiency downregulated important regulators of the IL-4-STAT6-signaling pathway such as IL-4R/CD124 and GATA3. This caused a decreased IL-4 production and therefore a deceased IL-4-secretion. Asm-inhibition via amitriptyline also influenced the IL-4-STAT6-signaling pathway and additionally the NFAT2- and IL-2-STAT5-signaling pathway. While IL-4R, GATA3 and NFAT2 were downregulated, amitriptyline increased IL-4- and IL-2-gene expression. Despite reduced calcium influx, this led to normal T-cell proliferation, but inhibited TH2-differentiation. Thus, it could be confirmed that Asm is an important modulator of the adaptive immune system. TH2-cells could be identified as an important immunological cell type affected by Asm. Therefore, Asm-deficiency or Asm-inhibition via amitriptyline represent a new, promising, cost-effective therapy option in allergic TH2-mediated bronchial asthma., Published by RWTH Aachen University, Aachen

Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus, spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch für die Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und für die Kostimulation benötigt und sind essentiell für die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine höhere "basale" Asm Aktivität, widergespiegelt im höheren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten Mäusen bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen. Außerdem führt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erhöhten Umsatzrate des immunsupprimierenden Moleküls CTLA-4 und zu einer verstärkten Suppressivität von Treg Zellen aus Asm-/- Mäusen gegenüber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der Treg-Frequenz, äquivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegenüber dem Asm Inhibitor-induzierten Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erklärbar sind die Unterschiede gegenüber den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch, dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 geschützt sind. In Abwesenheit von IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Veränderung des Verhältnisses von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und Autoimmunerkrankungen sein. Inwiefern die Asm für die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell näher untersucht. In Asm-/- Mäusen und Amitriptylin-behandelten Mäusen konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abhängige, verstärkte Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der akuten Phase gibt es in Asm-/- Mäusen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- Mäusen vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im Gehirn infizierter Mäuse noch deutlich erhöht, was die verstärkte Maserninfektion widerspiegelt. Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und einen Einfluss auf das Verhältnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im Masernvirus-Infektionsmodell kann die Veränderung des Tconv zu Treg Verhältnisses in Abwesenheit der Asm ursächlich für die verringerte Viruskontrolle sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg zu Tconv Verhältnisses können wiederum für therapeutische Zwecke genutzt werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis., The acid sphingomyelinase (Asm), an enzyme of the sphingolipid metabolism, hydrolyses sphingomyelin into ceramide and phosphocholine. Besides other stimuli the Asm is activated by ligation of the costimulatory molecule CD28. CD28 signaling is necessary to activate conventional T-cells (Tconv) and is crucial for the differentiation and maintenance of thymus-derived regulatory T-cells (Treg). We could demonstrate that Tconv and Treg cells differ with respect to Asm activity. Treg cells have an increased "basal" Asm activity resulting in an elevated level of ceramide and show a decreased lipid order compared to Tconv cells. The absence of Asm leads to a relative increase in Treg frequency among CD4+ T-cells in Asmdeficient mice. Furthermore, the Asm deficiency results in an increased turnover rate of the immunosuppressive molecule CTLA-4 and strengthens the suppressive capacity of Treg cells from Asm-/- mice compared to wild type Treg cells. An increase of the Treg cell frequency, equivalent to that seen with genetic deficiency, can be achieved by drugs like amitriptyline and desipramine too. The inhibitor treatment selectively decreases the absolute numbers of Tconv cells as Treg cells are more resistant towards Asm inhibitor induced cell death. The mechanistic explanation for the difference concerning the proapotptotic effects of Asm inhibitors between Treg and Tconv cells is that Treg cells are protected by IL-2. In the absence of IL-2 Treg cells die too. Therapeutically shifting the balance of Treg and Tconv cells by Asminhibiting drugs can be beneficial in inflammatory and autoimmune diseases. Whether the Asm is necessary for the function of T-cells during anti-viral immune responses was investigated in a measles virus infection model. In Asm-/- mice and amitriptyline treated mice control of the measles virus was impaired. Treg cells are of critical relevance as the Asm dependent boost in measles infection was only visible in the presence of Treg cells. During the acute phase of infection less measles virus specific T-cells were present leading to a decreased clearance of virus from the brains of Asm-/- mice. In the chronic phase the number of measles virus specific Tcell was comparable between wt and Asm-/- mice. But in the latter the number and frequency of T-cells in brains of infected mice was increased, which mirrors the enhanced measles virus infection. In conclusion, the Asm modulates the function of Treg cells and influences the Treg- Tconv ratio. The changed Treg-Tconv ratio in the absence of Asm expression might be responsible for the reduced virus control in the measles virus infection model. Additionally, the Asm inhibitor induced Treg cell activation and its effects on the Treg- Tconv ratio can be used for therapeutical approaches in diseases like multiple sclerosis or rheumatoid arthritis.

Isolierung humaner Monozyten und Inkubation mit saurer Sphingomyelinase. Messung des Ceramidgehalts und der Apoptoserate mittels Propidiumiodid und Annexin V

Zystische Fibrose (CF), auch bekannt als Mukoviszidose, ist die in den westlichen Ländern am häufigsten vorkommende autosomal rezessiv vererbte Erkrankung, ausgelöst durch Mutationen im CFTR-Gen (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Neben weiteren Symptomen ist CF vor allem charakterisiert durch eine im Verlauf der Erkrankung immer wiederkehrende und schließlich chronisch verlaufende Infektion der Lunge. Die daraus resultierende progressive Einschränkung der Lungenfunktion stellt nach wie vor die Hauptursache für den letalen Verlauf der Krankheit dar. Während die bislang etablierte Mukoviszidosetherapie auf rein symptomatischen Behandlungsmethoden beruht, zeichnet sich durch CF-Tiermodelle und die vorliegende klinische Studie eine neue, kausal ansetzende Therapieoption mittels des trizyklischen Antidepressivums Amitriptylin ab. Erstmals wurde das entzündungshemmende Wirkungspotential von Amitriptylin und damit seine hemmende Wirkung auf den fortschreitenden Prozess der Lungeninsuffizienz bei Menschen mit CF getestet. Die molekularen Mechanismen, welche bei Mutationen innerhalb des CFTR-Gens zu einer gesteigerten Infektanfälligkeit des Respirationstraktes führen, sind bislang noch nicht ausreichend geklärt. Es konnte gezeigt werden, dass das CFTR-Molekül neben seiner Funktion als Anionenkanal maßgeblich an der Aufrechterhaltung des sauren pH-Milieus intrazellulärer Vesikel im Respirationsepithel beteiligt ist. Eine eingeschränkte Funktion von CFTR hat schließlich über ein resultierendes Konzentrations-Ungleichgewicht zweier für den Sphingolipidstoffwechsel wesentlicher pH-abhängiger Enzyme, der sauren Sphingomyelinase (ASM) und der sauren Ceramidase, eine Alkalisierung dieser Vesikel mit konsekutiver Ceramid-Anreicherung zur Folge. In vorangegangen Untersuchungen wurde die Hypothese generiert, dass die Akkumulationen von Ceramid innerhalb des Respirationsepithels eine erhöhte Zellapoptose, eine gestörte mukoziliäre Clearance, die Förderung des chronischen proinflammatorischen Status, die hohe Infektanfälligkeit gegenüber des Hauptinfektionserregers Pseudomonas aeruginosa und die Ausbildung von Lungenfibrose bewirkt. Das in unserer Studie verwendete Prüfpräparat Amitriptylin agiert neben seiner Wirkung auf das zentrale Nervensystem als funktioneller Inhibitor der ASM und ist damit nach unserer Hypothese in der Lage die Ceramidkonzentration im Respirationsepithel zu senken. Nach der erfolgreichen Durchführung einer Pilot- und Phase IIa-Studie überprüften wir im Rahmen einer placebo-kontrollierten, prospektiven, randomisierten, doppelverblindeten Studie an 40 erwachsenen CF-Patienten anhand diverser Surrogatparameter die Wirkung von Amitriptylin. Gegenstand der Untersuchung waren dabei die Veränderung der Lungenfunktion (gemessen als FEV1 mittels Spirometrie), der Einfluss auf die epitheliale Ceramidexpression (fluoreszenzmikroskopisch gemessen in nasalen Mukosazellen), auf abgestorbenes Zellgewebe (gemessen als DNAKonzentration im Trachealsekret), auf die proinflammatorische Immunlage (Leukozyten-Konzentration und Konzentration pro- sowie anti-inflammatorischer Zytokine gemessen in Trachealsekret und Serum) und auf die pulmonale Bakterienlast (gemessen als P. aeruginosa-Kolonienzahl). Unter der Therapie von täglich 2x25 mg Amitriptylin lässt sich eine statistisch und klinisch relevante Veränderung der Lungenfunktionswerte bestätigen. Eine zeitgleich signifikante Abnahme der epithelialen Ceramidkonzentrationen unterstützt das zugrunde liegende Therapiekonzept. Die weiteren sekundären Zielparameter ergaben zwar positive Tendenzen, jedoch keine statistisch signifikanten Veränderungen. Durch das ursächliche Eingreifen in den Progress der Lungeninsuffizienz könnte durch die Medikation mit Amitriptylin eine neue Mukoviszidose-Therapie etabliert werden, welche sowohl zu einer deutlichen Steigerung der Lebensqualität als auch der Lebenserwartung führen könnte. Eine klinische Phase III-Studie an insgesamt 102 CF-Patienten mit dem Ziel der Verifizierung des Wirkmechanismus von Amitriptylin im Einsatz bei CF ist zwischenzeitlich im Gange.

Das endo-lysosomale Enzym saure Sphingomyelinase (A-SMase) ist ein wichtiges Element der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose. Im CD95-Signalweg ist die Translokation der A-SMase zur äußeren Zellmembran von besonderer Bedeutung. An der Zelloberfläche katalysiert die A-SMase die Hydrolyse von Sphingomyelin und ermöglicht die Bildung von Ceramid-angereicherten Membrandomänen. Dies bewirkt das Clustern des CD95-Rezeptors, eine verstärkte Rekrutierung der Adaptorproteine FADD und Caspase 8 sowie die Induktion einer apoptotischen, proteolytischen Kaskade. Jedoch ist bisher unbekannt, ob der A-SMase während der Rezeptor-Internalisierung eine weitere Funktion in der CD95-Signaltransduktion zukommt. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit die Internalisierung des CD95-Rezeptors zu analysieren und eine enzymatisch aktive A-SMase in den CD95-enthaltenden Endosomen (Rezeptosomen) nachzuweisen. Die magnetische Isolierung des zu unterschiedlichen Zeitpunkten internalisierten CD95-Rezeptors ermöglichte eine zeitabhängige Analyse der Rekrutierung von Adaptorproteinen. In der Western-Blot Analyse ließ sich mit dem verstärkten Auftreten von FADD und Caspase 8 die Bildung des DISC (death-inducing signaling complex) nachweisen. Die Detektion Kompartiment-spezifischer Markerproteine veranschaulichte zudem die Fusion zwischen CD95-Rezeptosomen und Rab 4A- oder Cathepsin D-positiven Vesikeln. Darüber hinaus ließ sich mit verschiedenen methodischen Ansätzen eine biphasisch aktivierte A-SMase in den magnetischen Fraktionen identifizieren. Der erste Aktivitätsanstieg korrelierte mit einer verstärkten Translokation der A-SMase an die Zelloberfläche und konnte durch den Caspase 8-Inhibitor IETD blockiert werden. Die Inhibition der CD95-Internalisierung durch den Dynamin-Inhibitor Dynasore reduzierte dagegen den zweiten Aktivitätsanstieg der A-SMase in den CD95-Rezeptosomen. Auf Grundlage dieser Inhibitionsversuche ließ sich das biphasische Aktivitätsprofil mit der Caspase 8-abhängigen Translokation der A-SMase zur Plasmamembran sowie mit der anschließenden CD95-Internalisierung in Verbindung setzen. Interessanterweise führte auch die Behandlung mit dem Caspase 3/7-Inhibitor DEVD zu einer Inhibition des zweiten Aktivitätsanstiegs der A-SMase. Weitere Analysen zeigten, dass Caspase 3 und 7 in den CD95-Rezeptosomen angereichert sind und direkt mit der A-SMase interagieren. In vitro ließ sich zudem die Caspase 3- und 7-vermittelte proteolytische Aktivierung der A-SMase nachweisen. Diese Ergebnisse lassen somit darauf schließen, dass der zweite Aktivitätsanstieg der A-SMase auf einem Caspase 3- oder 7-abhängigen Aktivierungsmechanismus in internalisierten CD95-Rezeptosmen beruht.

Durch Auslöser wie eine konnatale Pneumonie kann sich ein akutes Lungenversagen (acute lung injury, ALI) durch Entzündung beim Neugeborenen entwickeln. Die derzeitige Standardtherapie beim neonatalen ALI besteht aus maschineller Beatmung, Antibiotikagaben und intratraschealer Surfactantsubstitution. In zahlreichen Studien konnte die positive Wirkung des Surfactants auf die Lungenfunktion bestätigt, jedoch auch der rasch abklingende klinische Effekte durch eine inflammatorisch getriggerte Surfactantinaktivierung aufgezeigt werden. Der Ansatz dieser Studie besteht nun in der Inhibition der sauren Sphingomyelinase (aSMase) durch die Gabe von Substanzen aus dem Intermediärstoffwechsel der Inositolphosphate (Myo-Inositol, IP3), wodurch die Ceramid-Produktion reduziert und die Wirksamkeit des Surfactants verbessert werden könnte, sog. "Surfactanthärtung". Dies führte zur Entwicklung und Durchführung einer tierexperimentellen Studie an neugeborenen Ferkeln mit intensivmedizinischem Monitoring über 72 Stunden, drei Lungenschädigungsprotokollen (broncho-alveoläre Lavagen, schädliche Beatmung, E.coli-Instillation) im Abstand von jeweils 24 Stunden mit einer nachfolgenden Intervention (Luftbolus, Surfactant, Myo-Inositol, IP3) zwei Stunden später und anschließenden ex-vivo Untersuchungen der Lunge. Wir formulierten die Hypothese, dass die positiven Wirkungen der Surfactantgabe auf die Lungenfunktion (Gasaustausch, Lungenmechanik, Lungenödem) durch die Zugabe von Myo-Inositol bzw. IP3 noch verbessert werden können und dies anhand der klinischen Parameter sowie molekularen und histologischen Auswertungen nachzuvollziehen ist. Die Ergebnisse für die IP3-Gruppe zeigten signifikante Unterschiede in wichtigen Parametern wie dem Oxygenierungsindex, dem extravaskulärem Lungenwasserindex sowie der aSMase-Aktivität, der Ceramidkonzentration und der epithelialen Apoptose im Vergleich mit den anderen 3 Interventionsgruppen. Für die Myo-Inositol-Gruppe konnten wir leider keine positiven Effekte auf die Lungenfunktion oder diesen Stoffwechselweg nachweisen. Zusammenfassend ist das Ergebnis dieser Studie die Erkenntnis, dass sich IP3 als Zusatz zu exogenem Surfactant durch die Inhibition der aSMase-Aktivität und Ceramid-Produktion als eine erfolgsversprechende Behandlungsoption in der Therapie von Neugeborenen mit akutem inflammatorischen Lungenschaden anbietet.

a) Hintergrund und Ziele Die saure Sphingomyelinase (ASM) ist ein lysosomales Enzym, welches die Spaltung von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin katalysiert. Ceramid, als Mediator für Apoptosevorgänge, und sein Abbauprodukt Sphingosin-1-Phosphat sind an zentralen zellulären Vorgängen beteiligt. Nachdem die Aktivität der ASM durch verschiedene Stimuli reguliert wird, wundert es nicht, dass die Aktivität dieses Enzyms entsprechend bei unterschiedlichsten Erkrankungen verändert ist. Die Hemmung der ASM-Aktivität stellt einen völlig neuen, vielversprechenden Behandlungsansatz für verschiedene Krankheiten dar, so zum Beispiel bei Depression, Endotoxämie, Sepsis, Infektionskrankheiten, chronisch entzündlichen Erkrankungen wie dem Morbus Crohn, Cystischer Fibrose – generell bei Erkrankungen, die mit Apoptose einhergehen. Dementsprechend gilt es, spezifische und effizient wirksame ASM-Inhibitoren zu identifizieren. Um die Suche nach solchen Verbindungen rational zu gestalten, entwickelten Kornhuber und Mitarbeiter 2008 ein chemoinformatisches Modell, das sogenannte „Struktur-Eigenschaften-Aktivitäts-Relations-Modell“ (SPAR-Modell). Dieses soll das Potential von Substanzen, die ASM funktionell zu hemmen, bereits in silico erkennen. Die vorliegende Arbeit dient einerseits der experimentellen Suche nach neuen funktionellen ASM-Inhibitoren, andererseits der Weiterentwicklung und Verbesserung des SPAR-Modells von 2008. b) Methoden Eine humane Glioblastom Zelllinie wurde mit 71 verschiedenen Testsubstanzen inkubiert. Diese Substanzen lassen sich grob in neun unterschiedliche pharmakologische Substanzklassen einteilen, wobei sich diese Klassifizierung an dem anatomical therapeutic chemical (ATC) classification-System orientiert. Es handelt sich hierbei um Substanzen aus der Gruppe der Neuroleptika, Antidepressiva, Antihistaminika, Antiarrhythmika, Sympatholytika, Sympathomimetika und Makrolidantibiotika, die restlichen Substanzen wurden unter „Alkaloide“ und „Sonstige“ subsummiert. Alle Substanzen wurden in sehr hohem Reinheitsgrad erworben, gelöst und in definierten Konzentrationen (10 µM) auf die Zellen ausgebracht. Nachdem die Zellen lysiert worden waren, wurde die ASM-Aktivität in den Zelllysaten bestimmt. c) Ergebnisse und Beobachtungen Als ASM-Inhibitoren wurden Substanzen eingestuft, welche in einer Konzentration von 10 µM die ASM-Aktivität um mindestens 50% reduzierten. Von 71 gemessenen Substanzen zeigten 13 einen hemmenden Effekt auf die ASM. Von keiner dieser Substanzen war diese inhibitorische Wirkung zuvor gezeigt worden. Bemerkenswert ist, dass besonders Substanzen, die eine Wirkung auf das Zentralnervensystem entfalten, als funktionelle Inhibitoren der ASM fungieren. So ließ sich ein prozentual höherer Anteil an positiv getesteten Substanzen in der Gruppe der Neuroleptika, Antidepressiva und systemisch wirksamen Antihistaminika feststellen. Das 2008 entwickelte SPAR-Modell konnte mithilfe der empirischen Messungen mit neuen Parametern ergänzt und verbessert werden. Die Vorhersagegenauigkeit des chemoinformatischen Modells erhöhte sich von 80,3% (2008) auf etwa 95% (2011) [Kornhuber et al., eingereicht]. d) Praktische Schlussfolgerungen Die klinische Relevanz bzw. der Transfer der gewonnenen experimentellen Ergebnisse auf eine reale Applikation am Menschen wird in fortführenden Untersuchungen geprüft werden müssen. Essentiell ist hierbei die Frage, ob diese hemmenden Substanzen in vivo bereits in ihrem therapeutischen Konzentrationsbereich wirksam sind. Besonders Flupenthixol scheint dabei ein äußerst vielversprechendes Präparat zu sein [A. Friedl, unveröffentlicht]. Die Hemmung der sauren Sphingomyelinase stellt bei Erkrankungen, die mit einer erhöhten ASM-Aktivität einhergehen (vgl. a), einen genialen Therapieansatz dar. Die Tatsache, dass die Mehrheit der im Rahmen dieser Arbeit getesteten Substanzen auf der Medikamentenliste der world health organisation (WHO) geführt sind und bereits seit Jahren in anderen Indikationen im klinischen Gebrauch sind, könnte zu einer erfreulich zügigen Zulassung für diese neue Indikation beitragen. a) Background and aims Acid sphingomyelinase (ASM) is a lysosomal enzyme that catalyzes the cleavage of sphingomyelin to ceramide and phosphorylcholine. Ceramide, a mediator of apoptosis processes, and its metabolite sphingosine-1-phosphate are involved in crucial cellular processes. Since the activity of the ASM is regulated by various stimuli, it is not surprising that the activity of this enzyme is altered in a few different diseases. Inhibition of ASM represents a completely new and promising approach in treatment of various diseases such as major depression, endotoxemia, sepsis, infectious disease, chronic inflammatory illness like Crohn's disease, mucoviscidosis – generally at diseases that are attended with apoptosis. Accordingly, it is a worthwhile aim to identify specific and efficient ASM-inhibitors. In order to create the search for such inhibitors rational, Kornhuber and co-workers developed a chemo-informatic-model in 2008, the so-called “structure-property-activity-relation-model” (“SPAR”-model). It is to be an in silico-tool which is able to predict the potential of any substance to functionally inhibit ASM. Purpose of the present work was the experimental search for new functional ASM inhibitors and the development and improvement of the SPAR model, invented in 2008. b) Methods A human glioblastoma cell line was incubated with seventy-one different test substances. These substances can be roughly grouped into nine different pharmacological drug classes according to the Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) Classification-system. Mainly substances from the groups of neuroleptics, antidepressants, antihistamines, antiarrhythmics, sympatholytics, sympathomimetic agents and macrolide antibiotics were tested. The remaining substances were summarised as “alkaloids” and “others”. All substances were obtained in very high purity, dissolved and applied on the cells in defined concentrations (10 µM). After the cells were lysed, the ASM activity was determined in the cell lysates. c) Results and observations Only substances, applied in a concentration of 10 µM, which showed an ASM-activity reduction of at least 50% were defined as ASM inhibitors. Thirteen of seventy-one tested substances showed an inhibitory effect on the ASM. The inhibitory effect on the ASM of those tested substances had never been shown before this work. It is noteworthy that particularly substances which affect the central nervous system tend to act as effective functional inhibitors of ASM. Thus, especially substances of the groups of neuroleptics, antidepressants and antihistamines were identified to be effective ASM-inhibitors. The SPAR model from 2008 was supplemented and improved with new parameters based on the empirical measurements. The predictive accuracy of the chemo-informatic-model increased from 80.3% (2008) to about 95% (2011) [Kornhuber et al., submitted]. d) Conclusion The clinical relevance as well as the transfer of the obtained experimental results to the application in humans will have to be tested in future investigations. The essential question might be whether the inhibitory substances are in vivo in their therapeutic dosage yet effective. Particularly flupenthixol appears to be an extremely promising compound [A. Friedl, unpublished data]. Inhibition of acid sphingomyelinase presents a completely new and very promising treatment approach of diseases associated with increased ASM activity (cp. a). The fact that most of the tested substances within this work are already listed on the World Health Organization (WHO) drug list and have been in clinical use in other indications than ASM-inhibition for years, could accelerate the approval for this new indication.