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Contexte : alors que la réponse humorale observée après la vaccination COVID est diminuée chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) traités par Rituximab (RTX), la réponse immunitaire cellulaire spécifique contre Spike semble être préservée. Étant donné que cette altération de la réponse humorale modifie le schéma de rappel vaccinal proposé aux patients sous RTX, l'analyse de la réponse T spécifique du SARS-CoV-2 et de sa persistance éventuelle à long terme pourrait constituer un outil décisionnel utile en pratique courante. Cette étude a pour but de confirmer l’existence et d’évaluer la persistance de l’immunité médiée par les lymphocytes T après la dernière vaccination ou infection COVID (dernier boost COVID) chez des patients atteints de PR traités par RTX. Les paramètres cliniques et biologiques pouvant influencer cette immunité ont également été étudiés. Méthodes : notre étude de cohorte observationnelle a inclus des patients atteints de PR ayant reçu au moins une dose de vaccin anti-SARS-CoV-2 à ARN messager. La réponse immunitaire cellulaire a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant une approche simplifiée de la caractérisation des cellules T spécifiques d’antigène. Cette méthode est basée sur l'incubation initiale d'échantillons de sang total avec des peptides de Spike et s'appuie ensuite sur l’étude de l’expression de molécules de surface tels que CD69, CD154, CD137 et CD107a pour mesurer l'activation des lymphocytes T.Résultats : nous avons inclus 51 patients atteints de PR traités par RTX et 24 patients atteints de PR traités par d’autres traitements anti-rhumatismaux de fond, conventionnels synthétiques (csDMARDs) ou biologiques (bDMARDs). Nous avons observé une diminution significative de la réponse humorale chez les patients atteints de PR sous RTX (PR RTX) avec un taux moyen d’Ac anti-SARS-CoV-2 de 562 BAU/mL contre 839 BAU/mL chez les patients atteints de PR non traités par RTX (PR non RTX) (p = 0.034). Tous les patients de notre étude ont présenté une réponse lymphocytaire T4 (LT4) et lymphocytaire T8 (LT8) spécifique de Spike avec une meilleure réponse LT8 chez les patients PR RTX (p < 0.001). Les patients PR RTX ont montré une persistance de cette réponse T spécifique de Spike sans diminution jusqu’à 18 mois après le dernier boost COVID. Conclusion : bien que le traitement par RTX diminue la réponse humorale au vaccin COVID chez les patients atteints de PR, une réponse lymphocytaire T spécifique de Spike robuste a été observée et persiste jusqu'à 18 mois après le dernier boost COVID.

Introduction. Après 40 ans de recherche, l’éradication de la pandémie mondiale à VIH n’est pas encore à notre portée. Si le Canada a connu une raréfaction des cas de transmissions verticales, en 2019 on compte plus de 1,8 million d’enfants infectés par le VIH. Durant l’infection à VIH, la thérapie antirétrovirale (TAR) et les réponses immunitaires à médiation cellulaire, y compris celles véhiculées par les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL), jouent aussi un rôle important dans la limitation de la réplication virale. L’atteinte et le maintien d’une suppression virale soutenue (SVS) sous l’effet de la TAR sont associés à une limitation de taille du réservoir cellulaire du VIH pédiatrique. Si l’on possède beaucoup d’informations sur le développement et l’évolution des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre le VIH chez l’adulte, ce n’est pas le cas au niveau pédiatrique. Cette thèse avait pour but de caractériser la complexité phénotypique et fonctionnelle de la réponse antivirale des cellules CD8+ chez les enfants et les adolescents infectés par le VIH-1. Objectifs : Caractériser les réponses anti-VIH-1 à médiation cellulaire chez les enfants et les adolescents infectés. Mesurer la réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre la protéine Gag du VIH-1. Nous avons aussi étudié l’expression des marqueurs d’épuisement des cellules T chez l’enfant et l’adolescent infectés verticalement, ainsi que le transcriptome des cellules T CD8+ effectrices mémoires. Résultats : Les enfants et les adolescents sont capables de développer des réponses à médiation cellulaire dirigées spécifiquement contre le VIH-1, et cela malgré une longue période sous TAR. Les réponses observées sont influencées par l’âge et la proportion de vie cumulative sous SVS (cPLUS). Les réponses IFN- spécifiques au VIH sont augmentées avec l'âge en termes d'amplitude et de spectre de reconnaissance antigénique et sont diminuée avec une cPLUS plus faible, ce qui pourrait refléter une exposition moindre aux antigènes du VIH. Les mécanismes de l'expansion quantitative des réponses des lymphocytes T sont différents de ceux qui conduisent à l'élargissement du spectre de reconnaissance des antigènes viraux par les lymphocytes T de l’hôte. L’âge et la cPLUS exerçaient une influence sur l’expression des récepteurs inhibiteurs, ce qui pourrait contribuer à la difficulté d’atteindre et de maintenir une SVS ainsi que la progression plus rapide de l’infection chez les enfants vivant avec le VIH. Comparativement aux lymphocytes T CD4+, des fréquences plus élevées de lymphocytes T CD8+ exprimaient des récepteurs inhibiteurs et exprimaient un plus grand nombre de récepteurs différents. Cette tendance était influencée par l'âge. Cela indique que les lymphocytes T CD8+ sont plus épuisés que les lymphocytes T CD4+, ce qui pourrait contribuer à la persistance du VIH de l'enfance à l'âge adulte sous TAR. Cependant, les corrélations des fréquences de cellules exprimant des récepteurs inhibiteurs avec l'ampleur des réponses immunitaires à médiation cellulaire spécifiques au VIH suggèrent fortement que ces cellules n'étaient pas fonctionnellement épuisées. L’âge et la cPLUS exerçaient une influence déterminante sur l’expression de certains gènes. L’exploitation de technologies récentes pour l’étude du transcriptome des cellules T CD8+ mémoires au niveau unicellulaire nous ont permis d’obtenir une grande quantité de données à partir qu’un faible échantillon de cellules. Les participants avec une longue cPLUS avaient une fréquence plus grande de cellules exprimant CD69 et exprimant des gènes stimulés par l'interféron (ISG). Cependant, chez ces patients, on observait également une expression moindre des gènes associés à l’épuisement. Conclusion. Nous avons apporté des réponses quant aux mécanismes de la réponse immunitaire pédiatrique, mais aussi d’identifier les facteurs qui peuvent l’influencer. Cependant, l’écriture de la thèse a révélé une carence importante dans la compréhension des mécanismes de l’immunité au niveau pédiatrique au niveau de la littérature. Pour dépasser les limites des études pédiatriques, il existe un besoin constant de mettre en place des techniques de suivi immunitaire réalisables sur de petits échantillons biologiques., Introduction. After 40 years of research, the eradication of the global HIV pandemic is not yet within our reach. While Canada has experienced a decline in cases of vertical transmission, in 2019 there were more than 1.8 million children infected with HIV. During HIV infection, antiretroviral therapy (ART) and cell-mediated immune responses, including those mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL), also play an important role in limiting viral replication. The achievement and maintenance of sustained viral suppression (SVS) under the effect of ART are associated with a limitation in the size of the cellular reservoir of HIV at the pediatric level. While there is a lot of information on the development and evolution of cell-mediated immune responses against HIV, this is not the case at the pediatric level. This thesis aimed to characterize the phenotypic and functional complexity of the antiviral response of CD8+ cells in children and adolescents infected with HIV-1. Objectives: To characterize cell-mediated anti-HIV-1 responses in infected children and adolescents. To measure the immune response directed specifically against the Gag protein of HIV-1. To study the expression of T cell exhaustion markers in vertically infected children and adolescents, as well as the transcriptome of effector memory CD8+ T cells. Results: Children and adolescents are able to develop cell-mediated responses specifically directed against HIV, despite SVS under ART. The immune responses observed are influenced by age and the proportion of cumulative life on SVS (cPLUS). HIV-specific IFN- responses are increased with age in terms of amplitude and antigen recognition spectrum and are decreased with lower cPLUS, which may reflect shorter exposure to HIV antigens. Two distinct mechanisms of T cell responses were observed. On one hand quantitative expansion of T cell responses and on the other hand the broadening of the T cells spectrum of viral antigens recognition. Age and cPLUS exerted an influence on the expression of inhibitory receptors, which could contribute to the difficulty of achieving and maintaining SVS as well as the more rapid progression of infection in children living with HIV. Compared to CD4+ T cells, higher frequencies of CD8+ T cells expressed inhibitory receptors and expressed more different type of receptors. This trend was influenced by age. This indicates that CD8+ T cells are more depleted than CD4+ T cells, which may contribute to the persistence of HIV from childhood to adulthood on ART. However, correlations of frequencies of cells expressing inhibitory receptors with the magnitude of HIV-specific cell-mediated immune responses strongly suggest that these cells were not functionally exhausted but rather recently activated. Age and cPLUS exerted a determining influence on the expression of certain genes. The exploitation of recent technologies for the study of the transcriptome of memory CD8+ T cells at the single-cell level has enabled us to obtain a large amount of data from only a small biological sample. Participants with long cPLUS had a higher frequency of cells expressing CD69 and ISGs. However, in these patients, there was also a lower expression of genes associated with exhaustion. Conclusion. We have provided answers as to the mechanisms of the pediatric immune response but also identify the factors that can influence it. However, the writing of the thesis revealed an important deficiency in the understanding of the immunity mechanisms at the pediatric level in current literature. To overcome limits in pediatric studies, there is a constant need to set up immune monitoring techniques that can be performed on small biological samples Keywords: HIV, perinatal infection, inhibitory receptors, immune response, sustained viral suppression.

La compréhension scientifique des mécanismes prébiotiques et probiotiques s'est considérablement développée ces dernières années. Bien que les effets soient souvent spécifiques à une souche et à un produit, certains avantages des prébiotiques et des probiotiques peuvent être induits par des mécanismes communs et partagés et peuvent donc être généralisables. L'utilisation de nouveaux outils physiologiques et analytiques dans un cadre de recherche multidisciplinaire permettra d'élucider d'autres mécanismes. Il sera ainsi possible d'améliorer la compréhension des effets des prébiotiques, probiotiques et symbiotiques sur la santé. Sur la base des preuves scientifiques solides obtenues récemment, cette monographie est un ouvrage de référence très intéressant, destiné à informer un large public sur le microbiote intestinal et les concepts nutritionnels des prébiotiques et probiotiques.

Session 3 : La mise en place du protocole : un point clé de sa reproductibilité; National audience; La toxoplasmose est une maladie infectieuse cosmopolite due à un protozoaire intracellulaire, parasite opportuniste, Toxoplasma gondii. La toxoplasmose congénitale représente un problème majeur de santé publique et vétérinaire. Environ 3000 femmes enceintes s'infectent chaque année en France avec, dans 10% des cas, une transmission transplacentaire du parasite au fœtus. En parallèle, elle est l'une des causes majeures d'avortements pour les petits ruminants au sein des élevages français et également responsable depuis des décennies de mortalité pour de nombreuses espèces animales de parcs zoologiques. Du point de vue vétérinaire, la séroprévalence de la toxoplasmose est importante et souvent sous-estimée en France, comme en Europe au sein des élevages de ruminants. Le stress et l'anxiété dus au prélèvement sanguin sont observés chez les éleveurs de petits ruminants, comme pour les vétérinaires soignants les animaux de parcs zoologiques. Actuellement, le suivi immunologique de la toxoplasmose se fait sur sérum suite à une prise de sang dans les élevages lors d'une vague d'avortements Afin de proposer un test de dépistage de la toxoplasmose non invasif et non contraignant (raffinement), nous avons développé un outil de prélèvement (swab) et établi la preuve de concept chez la brebis, hôte naturel du toxoplasme. Ce système de prélèvement a déjà été validé pour l'enfant lors du suivi toxoplasmique. Le prélèvement a consisté en un recueil direct de la salive de 51 brebis Préalpes, infectées expérimentalement, par simple mastication mécanique d'un coton absorbant pendant une minute permettant de mesurer la réponse IgG salivaire et de la corréler avec la réponse IgG sérique. Le coton humidifié par la salive est placé dans un collecteur à l'intérieur d'un tube de centrifugation. Les tubes sont centrifugés pendant 15 min,afin d'essorer le coton sur les parois du tube collecteur percé et ensuite de recueillir environ 1mL de salive dans le fond du tube conique. La séroconversion des brebis a été suivie à sept jours et à deux mois post-infection. Une corrélation significative a été observée entre les cinétiques d'IgG sériques et salivaires (Coefficient de régression = 0,8). De plus, la réponse salivaire montre une très forte spécificité. En conclusion, nous avons développé un outil simple non invasif de prélèvement permettant de diminuer le stress de la brebis au cours du prélèvement. Le suivi salivaire est aussi spécifique et sensible que le suivi sérologique dans le cadre d'une toxoplasmose, tout en préservant le bien-être animal. Cet outil de raffinement permettra donc aux éleveurs d'avoir un meilleur suivi sanitaire pour la toxoplasmose de leur troupeau d'ovins, sans l'intervention du vétérinaire. Ce suivi sanitaire toxoplasmique aura un impact sur l'évaluation des risques de transmission pour l'espèce humaine et donc une amélioration de la prévention efficace de la maladie chez les femmes enceintes.

During the first years of life, the lung and airway grows and the immune system, immature at birth, develops. Innate immunity, as the first line of host defense, plays a key role and contributes to the imbalance of the neonatal adaptive response, characterized by an inherent bias against anti-infectious immunity that facilitates an allergic response. The hygiene hypothesis suggests that the development of asthma is, in part at least, attributable to immune dysregulation due to lack of exposure to certain microorganisms.Asthma, the most frequent chronic disease in children, is favored by genetic, epigenetic, and environmental risk factors. Different evolutionary patterns have been described, and the factors likely to influence the natural history of asthma are multiple. In terms of structural damage, remodeling appears early in the natural history of asthma, probably between 3 and 6 years of age. The preschool age could therefore constitute a window of opportunity to characterize severe asthma and to prevent irreversible lesions. Several approaches have made it possible to categorize asthma patients, either by identifying their specific clinical characteristics, named “phenotype”, or by the underlying pathophysiological process leading to inflammation, named “endotype”. Exacerbations are a particular event, frequent in young children, which is conducive to the study of the inflammatory response.Hypothesis: The heterogeneity of asthma phenotypes in children is the result of inter-individual variability of the bronchial mucosa immune response, partly determined by genetic factors, and partly influenced by environmental, among which microbial exposures. A better understanding of childhood asthma, taking into account its mechanisms, could lead to improved treatment to prevent functional impairment and anatomical damage. Objectives and main results of the PhD thesis:1/ To describe factors associated with severity in asthmatic children.The analysis of data from the French national CobraPed cohort suggests that factors influencing asthma severity may differ according to age: exposure to tobacco and/or molds is associated with severity at preschool age, whereas atopic diseases are associated with severity at school age.2/ To correlate endotypes and phenotypes at preschool age. The analysis of the immune response during respiratory infections (VIRASTHMA 2) showed in the most severe children, prone to exacerbations, lower systemic levels of Th1 and Th2, pro- and anti-inflammatory cytokines and antiviral responses during a severe virus-induced exacerbation.3/ To correlate endotypes and evolutionary phenotypes. The analysis of the immune response in parallel with the clinical evolutionary profile at one year in school-age children (VIRASTHMA) did not display a relationship between the cytokine profile at the time of exacerbation and future risk of poor asthma control and/or recurrence of exacerbations.4/ To generate hypotheses on the interactions between microbiota and atopy. The analysis of untargeted profiling of the plasma metabolome from children from the VIRASTHMA 1 and 2 cohorts allowed to identify a defect in secondary bile acids associated with atopy, suggesting that these metabolites, known to be generated by the intestinal microbiota and with immunomodulatory functions, could play a key role in tolerance during childhood. In conclusion, this thesis confirms the utility of phenotyping asthmatic children and describing their environment. Prone to exacerbation phenotype could correspond to a distinct endotype, characterized by a defect of the anti-infectious response. The microbiota also plays a key role in the development of atopy and the perpetuation of asthma., Les premières années de la vie sont marquées par un développement important des poumons et du système immunitaire, immatures à la naissance. Les défenses du poumon font intervenir en premier lieu, l’immunité innée qui, en période néonatale, contribue au déséquilibre de la réponse adaptative avec un biais inhérent en défaveur d’une immunité anti-infectieuse qui facilite une réponse allergique. La théorie hygiéniste suggère que le développement d’un asthme est, au moins en partie, attribuable à une dérégulation immunitaire, par manque d'exposition à certains microorganismes. L'asthme, première maladie chronique de l’enfant, est favorisé par des facteurs de risque génétiques, épigénétiques et environnementaux. Différents profils d’évolution ont été décrits et les facteurs susceptibles d’influencer l’histoire naturelle sont multiples. Sur le plan lésionnel, le remodelage apparait précocement, probablement entre 3 et 6 ans. L’âge préscolaire constitue donc une période cruciale pour caractériser les formes sévères et limiter des lésions irréversibles. Plusieurs approches permettent de catégoriser les patients asthmatiques, soit par l’identification de caractéristiques cliniques spécifiques, définissant un "phénotype", soit par l’identification de processus physiopathologiques à l’origine de l’inflammation, définissant un "endotype". Les exacerbations constituent un événement particulier, fréquent chez le jeune enfant, propice à l’étude de la réponse inflammatoire. Hypothèse : L’hétérogénéité des phénotypes d’asthme de l’enfant est la résultante de la variabilité interindividuelle de la réponse immune de la muqueuse bronchique, en partie prédéterminée génétiquement, et en partie influencée par les expositions environnementales, microbiennes en particulier. Mieux comprendre l’asthme de l’enfant en tenant compte des mécanismes pourrait permettre d’améliorer le traitement, pour prévenir l’altération fonctionnelle et les lésions anatomiques. Objectifs et principaux résultats du travail de thèse :1/ Décrire les facteurs associés à la sévérité dans l’asthme de l’enfant. L’analyse des données de la cohorte nationale CobraPed suggère que les facteurs influençant la sévérité de l'asthme différent selon l'âge : elle est associée à l’exposition au tabac et/ou aux moisissures à l’âge préscolaire, alors qu’elle est reliée aux maladies atopiques à l’âge scolaire.2/ Corréler les endotypes et les phénotypes à l’âge préscolaire. L’analyse de la réponse immunitaire au cours d’infections respiratoires (VIRASTHMA 2) a mis en évidence chez les enfants les plus sévères, exacerbateurs fréquents, des niveaux systémiques plus faibles de cytokines Th1 et Th2, pro et anti-inflammatoires et des réponses antivirales moins marquées pendant une exacerbation sévère viro-induite.3/ Corréler les endotypes et les phénotypes d’évolution. L’analyse de la réponse immunitaire en parallèle du profil d’évolution clinique à un an chez des enfants d’âge scolaire (VIRASTHMA) n’a pas mis en évidence de relation entre le profil cytokinique au moment de l'exacerbation et le risque futur de mauvais contrôle de l'asthme et/ou de récurrence des exacerbations.4/ Générer des hypothèses sur les interactions entre microbiote et environnement atopique. L’analyse du métabolome plasmatique par profilage non-ciblé chez les enfants des cohortes VIRASTHMA 1 et 2 a permis d’identifier un défaut d’acides biliaires secondaires associé à l’atopie, suggérant que ces métabolites, connus pour être générés par le microbiote intestinal et avoir des fonctions immunomodulatrices, pourraient jouer un rôle clé dans la tolérance pendant l'enfance [...]

Les lymphocytes T orchestrent la réponse immunitaire adaptative afin de nous protéger contre les pathogènes. Les lymphocytes T sont dotés d’un récepteur de surface, le récepteur de cellules T (TCR), qui transmet le signal de stimulation vers l’intérieur de la cellule afin d’amorcer la cascade d’activation des cellules T. Le TCR est un complexe multimérique composé des dimères TCRαβ, CDεγ, CD3εδ et CD3ζζ. Les chaînes TCRαβ reconnaissent les antigènes pathogéniques tandis que les chaînes CD3 initient la cascade de signalisation des cellules T par la phosphorylation de leurs chaînes cytoplasmiques. Il est toujours incompris comment le signal d’activation du TCR est transmis des chaînes TCRαβ jusqu’aux domaines cytoplasmiques des chaînes CD3. Chez les lymphocytes T au repos, les chaînes CD3ε et CD3ζ sont associées au feuillet interne de la membrane plasmique (MP). Le domaine cytoplasmique de CD3ε et CD3ζ est riche en acides aminés basiques, ce qui permet leur association électrostatique avec les phospholipides acides de la MP. La phosphatidylsérine (PS) est le phospholipide acide le plus abondant de la MP. La PS est redistribuée exclusivement à la face cytoplasmique de la MP. Lors de l’activation des lymphocytes T, les chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs doivent se détacher de la PS pour leur phosphorylation. La dissociation membranaire d’un grand nombre de chaînes CD3 est essentielle à l’amplification de l’activation des lymphocytes T. Un mécanisme de dissociation des chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs proposé dans la littérature est par l’élévation intracellulaire de calcium. Un influx robuste de calcium est généré suivant la stimulation des cellules T. En plus d’être essentiel à l’activation efficace des cellules T, il a été proposé que le calcium neutralise les phospholipides acides de la MP afin de dissocier les chaînes CD3. Le calcium est également un co-facteur dans l’activité de plusieurs enzymes, comme la scramblase lipidique TMEM16F. TMEM16F redistribue la PS à la MP suivant l’élévation du calcium intracellulaire, ce qui résulte en la réduction de la PS au feuillet interne. Nous avons donc émis l’hypothèse que le calcium régule la dissociation des chaînes CD3 par l’activation de TMEM16F. Notre étude démontre que la redistribution calcium-dépendante de la PS par TMEM16F est essentielle à la dissociation membranaire de CD3ε dans la lignée de cellules T Jurkat. La réduction de l’expression de TMEM16F par ARN interférant (shTMEM16F) empêche la dissociation massive des chaînes CD3ε suivant la stimulation des cellules T. De plus, les cellules shTMEM16F démontrent une diminution de la phosphorylation des molécules de signalisation des cellules T. En contraste, l’expression d’une forme constitutivement active de TMEM16F augmente la redistribution de PS à la MP, la dissociation membranaire des chaînes CD3ε et la phosphorylation des molécules de signalisation. Notre étude démontre que la redistribution de la PS par la scramblase calcium-dépendante TMEM16F régule la dissociation membranaire des chaînes CD3 du TCR afin d’amplifier l’activation des cellules T. Enfin, nous avons confirmé les défauts d’activation dans des cellules T murines primaires exprimant shTMEM16F lors d’une réponse immunitaire. En conclusion, notre étude démontre le rôle de la régulation de la PS dans l’activation des cellules T. Nous avons démontré que nous pouvons modifier le niveau d’activation des cellules T en modulant la PS à la MP. Nos résultats ont ainsi plusieurs implications pour la conception et l’amélioration des immunothérapies basées sur les cellules T., T lymphocytes protect us against pathogens by orchestrating the adaptive immune response. T lymphocytes possess a specific surface receptor, the T cell receptor (TCR), which conveys the stimulation signal towards the cytoplasm for the initiation of the T cell activation cascade. The TCR is a multimeric complex composed of the TCRαβ, CDεγ, CD3εδ and CD3ζζ dimers. The TCRαβ chains recognize the pathogenic antigens while the CD3 chains initiate the T cells signaling cascade through the phosphorylation of their cytoplasmic tails. It is not yet understood how the TCR activating signal is transmitted through the membrane from the TCRαβ chains towards the cytoplasmic tails of the CD3 chains. In resting T cells, the CD3ε and CD3ζ chains are associated to the inner leaflet of the plasma membrane (PM). The cytoplasmic tails of CD3ε and CD3ζ are rich in basic amino acids, which allow electrostatic association with acidic phospholipids at the PM. Phosphatidylserine (PS) is the most abundant acidic phospholipid and is exclusively distributed towards the cytoplasmic PM leaflet. During T cell activation, the CD3ε and CD3ζ cytoplasmic tails have to dissociate from PS for their phosphorylation. The membrane dissociation of a large number of CD3 chains is essential for the amplification of T cell activation. A mechanism of CD3ε and CD3ζ chain dissociation that has been proposed in the literature is through intracellular calcium elevation. A robust calcium influx is generated following T cell stimulation. In addition to its essential role in regulating T cell activation, it has been proposed that calcium ions neutralize the PM acidic phospholipids for CD3 chain dissociation. Calcium is also an essential cofactor for the activity of many enzymes, such as the phospholipid scramblase TMEM16F. TMEM16F redistributes PS at the PM following intracellular calcium mobilization, resulting in a reduction of inner leaflet PS. We propose that calcium regulates CD3 chain dissociation through TMEM16F activity. Our study demonstrates that calcium-dependent PS redistribution by TMEM16F is required for CD3ε membrane dissociation in the Jurkat T cell line. Reduction of TMEM16F expression by shRNA targeting (shTMEM16F) prevents massive CD3ε chain dissociation following 8 T cell stimulation. The shTMEM16F cells show a reduction in the phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. In contrast, expression of a constitutively active mutant of TMEM16F increases PS redistribution, CD3ε chain dissociation and phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. Our study demonstrates that PS redistribution by the calcium-dependent TMEM16F scramblase regulates CD3 chain dissociation for the amplification of T cell activation. In addition, we have confirmed T cell activation defects in shTMEM16F murine primary T cells during an immune response. In conclusion, our study demonstrates the role of PS regulation by TMEM16F in T cell activation. We showed that we could modify the level of T cell activation by modulating the concentration of PS at the inner leaflet of the PM. Our results thus have important implications for the development and improvement of immune receptor-based cancer immunotherapies.

In Sub Saharan Africa HIV-HBV co-infection is still a public health concern, even at a time when ART are universal. We study the consequences of HBV infection in HIV-positive individuals during the era of early antiretroviral therapy. Methods: From the Temprano ANRS 12136 trial database, we conducted three analyses to evaluate in co-infected patients: (1) the risk of mortality, (2) the immune recovery, and (3) HBV DNA replication and ALT fluctuation in hepatitis B “e” antigen negative individuals and the dispersion of these two markers. Findings: 2052 (99.8%) were included in this analysis, 1862 (91%) were mono infected with HIV and 190 (9%) co-infected with HIV / HBV. Of these, 135 (71%) had an HBV viral load 2000 IU / ml have a mortality three times higher compared to patients not co-infected, or with an HBV B viral load 70 IU / L) occurring in patients consistently classified with "hepatitis" chronic HBeAg negative (60.0%) or those oscillating between chronic HBeAg negative “infection” and “hepatitis” (38.1%). In the study of mortality as a function of CD4 count, the adjusted incidence of mortality was comparable between HBsAg positive and HBsAg negative individuals when the CD4 + cell count was> 500 / mm3 (adjusted RTI = 0.85, 95% CI = 0.13-2.95). This difference became more apparent when the CD4 count reached 350-500 / mm3 (adjusted IRR = 1.51, 95% CI = 0.34-4.46) or 2000 UI/ml ont une mortalité trois fois plus élevée comparée aux patients non co-infectés, ou avec une charge virale B VHB < 2000 UI/ml. L’étude de l’activité du virus de l’hépatite B chez les patients co-infectés naïfs de traitement a montré que la quantification de l’AgHBs était stable pendant le suivi pour la plupart des patients, quel que soit le profil d'activité AgHBe-négatif du VHB. Le taux d’ALAT était très variable au cours du suivi, la majorité des poussées d'ALAT supérieures à deux fois la limite supérieure de la normale (> 70 UI / L) survenant chez des patients systématiquement classés avec une « hépatite » chronique AgHBe négative (60,0 %) ou celles oscillant entre « infection » chronique AgHBe négatif et « hépatite » (38,1%).l’étude de la mortalité en fonction du taux de CD4 a noté que l'incidence ajustée de la mortalité était comparable entre les individus AgHBs positifs et AgHBs négatifs lorsque le les CD4 étaient> 500/mm3 (RTI ajusté = 0,85, IC à 95% = 0,13-2,95). Cette différence est devenue plus apparente lorsque le nombre de CD4 atteignait 350-500 / mm3 (IRR ajusté = 1,51, IC à 95% = 0,34-4,46) ou

During the first years of life, the lung and airway grows and the immune system, immature at birth, develops. Innate immunity, as the first line of host defense, plays a key role and contributes to the imbalance of the neonatal adaptive response, characterized by an inherent bias against anti-infectious immunity that facilitates an allergic response. The hygiene hypothesis suggests that the development of asthma is, in part at least, attributable to immune dysregulation due to lack of exposure to certain microorganisms.Asthma, the most frequent chronic disease in children, is favored by genetic, epigenetic, and environmental risk factors. Different evolutionary patterns have been described, and the factors likely to influence the natural history of asthma are multiple. In terms of structural damage, remodeling appears early in the natural history of asthma, probably between 3 and 6 years of age. The preschool age could therefore constitute a window of opportunity to characterize severe asthma and to prevent irreversible lesions. Several approaches have made it possible to categorize asthma patients, either by identifying their specific clinical characteristics, named “phenotype”, or by the underlying pathophysiological process leading to inflammation, named “endotype”. Exacerbations are a particular event, frequent in young children, which is conducive to the study of the inflammatory response.Hypothesis: The heterogeneity of asthma phenotypes in children is the result of inter-individual variability of the bronchial mucosa immune response, partly determined by genetic factors, and partly influenced by environmental, among which microbial exposures. A better understanding of childhood asthma, taking into account its mechanisms, could lead to improved treatment to prevent functional impairment and anatomical damage. Objectives and main results of the PhD thesis:1/ To describe factors associated with severity in asthmatic children.The analysis of data from the French national CobraPed cohort suggests that factors influencing asthma severity may differ according to age: exposure to tobacco and/or molds is associated with severity at preschool age, whereas atopic diseases are associated with severity at school age.2/ To correlate endotypes and phenotypes at preschool age. The analysis of the immune response during respiratory infections (VIRASTHMA 2) showed in the most severe children, prone to exacerbations, lower systemic levels of Th1 and Th2, pro- and anti-inflammatory cytokines and antiviral responses during a severe virus-induced exacerbation.3/ To correlate endotypes and evolutionary phenotypes. The analysis of the immune response in parallel with the clinical evolutionary profile at one year in school-age children (VIRASTHMA) did not display a relationship between the cytokine profile at the time of exacerbation and future risk of poor asthma control and/or recurrence of exacerbations.4/ To generate hypotheses on the interactions between microbiota and atopy. The analysis of untargeted profiling of the plasma metabolome from children from the VIRASTHMA 1 and 2 cohorts allowed to identify a defect in secondary bile acids associated with atopy, suggesting that these metabolites, known to be generated by the intestinal microbiota and with immunomodulatory functions, could play a key role in tolerance during childhood. In conclusion, this thesis confirms the utility of phenotyping asthmatic children and describing their environment. Prone to exacerbation phenotype could correspond to a distinct endotype, characterized by a defect of the anti-infectious response. The microbiota also plays a key role in the development of atopy and the perpetuation of asthma., Les premières années de la vie sont marquées par un développement important des poumons et du système immunitaire, immatures à la naissance. Les défenses du poumon font intervenir en premier lieu, l’immunité innée qui, en période néonatale, contribue au déséquilibre de la réponse adaptative avec un biais inhérent en défaveur d’une immunité anti-infectieuse qui facilite une réponse allergique. La théorie hygiéniste suggère que le développement d’un asthme est, au moins en partie, attribuable à une dérégulation immunitaire, par manque d'exposition à certains microorganismes. L'asthme, première maladie chronique de l’enfant, est favorisé par des facteurs de risque génétiques, épigénétiques et environnementaux. Différents profils d’évolution ont été décrits et les facteurs susceptibles d’influencer l’histoire naturelle sont multiples. Sur le plan lésionnel, le remodelage apparait précocement, probablement entre 3 et 6 ans. L’âge préscolaire constitue donc une période cruciale pour caractériser les formes sévères et limiter des lésions irréversibles. Plusieurs approches permettent de catégoriser les patients asthmatiques, soit par l’identification de caractéristiques cliniques spécifiques, définissant un "phénotype", soit par l’identification de processus physiopathologiques à l’origine de l’inflammation, définissant un "endotype". Les exacerbations constituent un événement particulier, fréquent chez le jeune enfant, propice à l’étude de la réponse inflammatoire. Hypothèse : L’hétérogénéité des phénotypes d’asthme de l’enfant est la résultante de la variabilité interindividuelle de la réponse immune de la muqueuse bronchique, en partie prédéterminée génétiquement, et en partie influencée par les expositions environnementales, microbiennes en particulier. Mieux comprendre l’asthme de l’enfant en tenant compte des mécanismes pourrait permettre d’améliorer le traitement, pour prévenir l’altération fonctionnelle et les lésions anatomiques. Objectifs et principaux résultats du travail de thèse :1/ Décrire les facteurs associés à la sévérité dans l’asthme de l’enfant. L’analyse des données de la cohorte nationale CobraPed suggère que les facteurs influençant la sévérité de l'asthme différent selon l'âge : elle est associée à l’exposition au tabac et/ou aux moisissures à l’âge préscolaire, alors qu’elle est reliée aux maladies atopiques à l’âge scolaire.2/ Corréler les endotypes et les phénotypes à l’âge préscolaire. L’analyse de la réponse immunitaire au cours d’infections respiratoires (VIRASTHMA 2) a mis en évidence chez les enfants les plus sévères, exacerbateurs fréquents, des niveaux systémiques plus faibles de cytokines Th1 et Th2, pro et anti-inflammatoires et des réponses antivirales moins marquées pendant une exacerbation sévère viro-induite.3/ Corréler les endotypes et les phénotypes d’évolution. L’analyse de la réponse immunitaire en parallèle du profil d’évolution clinique à un an chez des enfants d’âge scolaire (VIRASTHMA) n’a pas mis en évidence de relation entre le profil cytokinique au moment de l'exacerbation et le risque futur de mauvais contrôle de l'asthme et/ou de récurrence des exacerbations.4/ Générer des hypothèses sur les interactions entre microbiote et environnement atopique. L’analyse du métabolome plasmatique par profilage non-ciblé chez les enfants des cohortes VIRASTHMA 1 et 2 a permis d’identifier un défaut d’acides biliaires secondaires associé à l’atopie, suggérant que ces métabolites, connus pour être générés par le microbiote intestinal et avoir des fonctions immunomodulatrices, pourraient jouer un rôle clé dans la tolérance pendant l'enfance [...]

The chikungunya virus (CHIKV) belongs to Alphavirus genus which can be found in an ecological but not taxonomic group named arboviruses (for arthropod-borne viruses) indicating viruses transmitted by an arthropod vector hematophagous to a vertebrate host, during a blood meal. Alphaviruses are transmitted by bloodsucking arthropods, mainly mosquitoes, to humans and animals causing debilitating disease. While in human CHIKV disease is characterized by fever, headache, and a typical acute infection, sometimes followed by persistent arthralgia or myalgia, in mosquito the infection does not seem to cause significant pathology. Since the re-emergency of CHIKV at La Réunion in 2005-2006 Alphavirus-host or vector interactions are more and more studied at the cellular and molecular level. Indeed, the identification of cellular and viral factors involved in the human pathology and mosquito chronicity could allow to develop antiviral treatments. The regulated apoptotic cell death and interferon Type-I immune response are strong antiviral defence participating in rapid viral elimination. Moreover, it has been demonstrated that p53 plays a central role in the regulation of cell death and Type-I interferon signalling pathway during different viral infections. Finally, quite recently it has been suggested that in Dengue virus-infected insect, p53-induced cell death was associated to the permissiveness and resistance of vector. In this way my work was to study the potential role of p53 and p53 isoforms on cellular outcome and viral infection in mammal and insect infected with Alphavirus, mainly chikungunya virus and to a lesser extent Sindbis virus. First, in order to investigate a potential function of p53 on viral infection in mammal and insect, infected with chikungunya virus and Sindbis virus, we have generated p53 knockout human skeletal muscle cell line. In addition, thanks to a collaboration, we obtained Drosophila melanogaster p53-/- mutant strain. We observed an opposite effect of p53 knockout on chikungunya virus infection in in vitro human cells and in vivo in Drosophila melanogaster. Indeed, we have demonstrated an increase in CHIKV infection in p53 knockout human cells and a decrease in CHIKV and Sindbis virus replication in the whole flies p53-/- mutants. Several analyses on CHIKV-infected p53 knockout human cell line have demonstrated an immune antiviral effect of p53 through Type-I interferon production and signalling pathway and a negative impact on neighbouring cells protection. Moreover, it seems that infected-p53 knockout cells are not able to enhance IFN production and signalling. Further experiments are required to decipher the activity of p53 on immune signalling. In parallel, we have shown that CHIKV-induced cell death was p53-independent as no p53 family target genes were regulated and the knockout of p53 did not decreased or delayed the virus-induced cell death. Secondly, we have investigated a possible function of ∆40p53 and ∆133p53 isoforms on CHIKV infection. We have set up and carried out (i) human muscle cell line overexpressing endogenous ∆40p53 using CRISPR/Cas9 technology and (ii) an inducible-system overexpressing ∆40p53 or ∆133p53 protein isoforms. We observed that endogenous overexpression of ∆40p53 isoform led to a decrease in CHIKV infection, but the mechanism remains unclear, Le virus du chikungunya (CHIKV) appartient au genre des Alphavirus qui peuvent faire partis d’un groupe écologique mais pas taxonomique, nommée les Arboviruses (pour « Arthropod-borne viruses ») signifiant des virus transmis par des arthropodes vecteur hématophages à des hôtes vertébrés, au cours d’un repas sanguin. Les alphavirus sont transmis, principalement par des moustiques, à l’Homme et aux animaux causant des maladies invalidantes. Tandis que le CHIKV induit chez l’Homme une maladie caractérisée par de la fièvre, des maux de tête et une infection aigue typique, elle peut s’accompagner de douleurs articulaires et musculaires persistantes ; alors que chez le moustique l’infection ne semble pas causer de pathologie. A la suite de la réémergence du CHIKV au cours de l’épidémie de 2005-2006 à La Réunion, les interactions entre les alphavirus et leur hôte ou vecteur sont de plus en plus étudiées au niveau cellulaire et moléculaire. En effet, l’identification de facteurs cellulaires et viraux impliqués dans la pathologie de l’Homme et la chronicité du vecteur moustique permettrait de développer des traitements antiviraux. La mort cellulaire programmée (apoptose) et la réponse immunitaire de Type-I assurent une réponse antivirale rapide, participant à l’élimination du virus. De plus, il a été démontré que la protéine p53 joue un rôle central dans la régulation de l’apoptose et dans la voie de signalisation de la réponse interféron de Type-I. Pour finir, il a été suggéré récemment que l’infection d’un insecte par le virus de la Dengue, la morte cellulaire induite par p53 était associée à la permissivité et à la résistance du vecteur. L’objectif de mon travail était d’étudier le rôle possible de la protéine p53 et des isoformes p53 sur la réponse cellulaire et l’infection virale chez le mammifère et l’insecte infectés par des alphavirus, en prenant le virus du chikungunya comme modèle principal et dans une moindre mesure le virus Sindbis. Dans un premier temps, nous avons généré une lignée cellulaire de muscle squelettique humaine délété de la protéine p53 et grâce à une collaboration, nous avons obtenu des souches Drosophila melanogaster p53-/- mutantes. Nous avons observé un effet opposé de la délétion de p53 sur l’infection du chikungunya entre la lignée cellulaire humaine et la drosophile. En effet, nous avons démontré que la délétion de p53 induisait une augmentation de l’infection du CHIKV dans les cellules humaines et une diminution de la réplication virale du CHIKV et du virus Sindbis chez les drosophiles. Plusieurs analyses ont montré que la protéine p53 était impliquée dans la réponse interféron de Type-I, indépendamment de son implication dans la régulation de la mort cellulaire au cours de l’infection du CHIKV dans les cellules humaines. En effet, la délétion de p53 ne permet pas la production d’interféron Bêta et par conséquence la production des gènes cibles de la voie de signalisation. L’activité de p53 sur la réponse immune va être étudiée plus en détails dans des expériences futures. En parallèle, nous avons également montré que la mort cellulaire induite par le virus CHIKV était indépendante de p53 car aucuns des gènes cibles de p53 étudiés n’était régulés et la délétion de p53 n’a pas diminué ou retardé l’induction de la mort cellulaire à la suite de l’infection virale. Dans un deuxième temps, nous avons étudié le rôle possible des isoformes ∆133p53 et ∆40p53 sur l’infection du CHIKV. Pour cela nous avons mis au point (i) des cellules humaines de muscle qui présente une surexpression endogène de l’isoforme ∆40p53, générée par la technologie CRISPR/Cas9 et (ii) un système inductible pour surexprimer transitoirement les protéines des deux isoformes. Nous avons observé que la surexpression endogène de l’isoforme ∆40p53 conduisait à une diminution de l’infection, cependant le mécanisme est inconnu

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is a Gram-negative opportunistic pathogen primarily affecting immunocompromised and cystic fibrosis patients. In addition to lung and urinary tract infections, Pa is often isolated from blood of bacteremic patients. Blood stream infections caused by this particular pathogen register with higher mortality rates compared to septicemia associated with other bacteria. Once in the circulation, Pa faces the innate immune system of the blood, however the strategies employed by this pathogen to escape killing by the complement system and circulating phagocytes have not been investigated in whole blood. In this work, we assessed the survival of a collection of six Pa strains in human whole blood. We found that rather than cytotoxicity toward circulating leukocytes, complement resistance is the main driver of survival in the blood. The origin, serotype of the isolate, as well as the nature of the toxins expressed by the strains did not affect their survival. We also discovered that complement-sensitive strains prevent their eradication through the generation of a minor subpopulation of ‘'evaders'', able to withstand complement-mediated lysis. Depending on the strain, between 0.0001 and 0.01% of the initial population survived in human plasma. The characterization of evaders showed that they harbor a transient persister-like phenotype, and are also observed in Acinetobacter baumannii, Burkholderia multivorans, enteroaggregative Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Yersinia enterocolitica. Formation of evaders likely represent an efficient strategy for complement-sensitive bacteria to persist within the blood and disseminate through the host. Using a genome-wide screen of a transposon mutant library in human plasma (Tn-Seq), we identified new bacterial factors influencing the interplay between Pa and the complement system. We observed that bacteria negatively affected in de novo biotin and purine synthesis survive better in plasma than the parental strain. In addition, Tn-Seq identified an operon of three genes, that we named ‘'srg'' for ‘'serum resistant genes'' whose products are predicted to be membrane bound. SrgABC overexpression confers tolerance to plasma (1000 fold-increased survival compared to wt) and triggers an overproduction of alginates by the bacteria, suggesting complex interplay between bacterial membrane, exopolysaccharides and complement-mediated lysis., Pseudomonas aeruginosa (Pa) est une bactérie à Gram négatif considérée comme pathogène opportuniste, principalement retrouvée chez les patients immunodéprimés ou atteint de mucoviscidose. Cette cause majeure d'infections nosocomiales est à l'origine de pathologies pulmonaires et urinaires, mais est également fréquemment isolée à partir du sang de patients atteints de bactériémies. Les infections sanguines causées par ce pathogène ont été montrées comme particulièrement mortelles par rapport aux septicémies associées à d'autres espèces bactériennes. Une fois entré dans la circulation, Pa doit faire face au système immunitaire inné du sang, cependant les stratégies employées par ce pathogène afin de résister au système du complément et aux cellules phagocytaires n'ont jamais été étudiées dans le sang total. Grâce à l'étude de la survie d'une collection de six souches de Pa dans le sang total humain, nous avons pu démontrer que plutôt que la cytotoxicité envers les leucocytes circulants, la résistance à la lyse par le complément est le principal moteur de la survie bactérienne. De plus, l'origine, le sérotype de l'isolat, ainsi que la nature des toxines exprimées par les différentes souches n'impactent pas leur survie dans cet environnement. Nous avons également découvert que les bactéries sensibles au complément étaient capables d'éviter une éradication totale, grâce à la formation d'une sous-population d'‘‘evaders'' résistante à l'action lytique du complément. Suivant la souche étudiée, cette population représente entre 0,0001 et 0,01% de la population initiale. Ces cellules rares présentent un phénotype transitoire proche des persisteurs, et ont également été observées chez Acinetobacter baumannii, Burkholderia multivorans, enteroaggregative Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Yersinia enterocolitica. La formation d'‘‘evaders'' représente probablement une stratégie efficace permettant aux souches sensibles au complément de persister dans le sang et ainsi disséminer dans l'organisme. Grâce au criblage d'une banque de mutants de transposition en plasma humain (Tn-Seq), nous avons pu identifier de nouveau facteurs bactériens impliqués dans l'interaction entre Pa et le système du complément. Nous avons observé que des bactéries incapables de synthétiser leurs biotine et purines survivent mieux en plasma par rapport à la souche parentale. Egalement, le Tn-Seq nous a permis d'identifier un opéron de trois gènes, que nous avons nommé ‘'srg'' pour ‘'serum resistant genes'', dont les produits sont prédits comme étant localisés à la membrane. La surexpression des protéines SrgABC confère à la bactérie une survie accrue en plasma (augmentation d'un facteur 1000 par rapport à la souche sauvage), et induit une surproduction des alginates chez cette dernière, suggérant l'existence d'une interaction complexe entre la membrane bactérienne, la sécrétion d'exopolysacharides et l'action lytique du complément.

Evolution constrains organism diversity through natural selection. Here we build theoretical models to study the effect of evolutionary constraints on two natural systems at different scales: viral-immune coevolution and protein evolution.First we study how immune systems constrain the evolutionary path of viruses which constantly try to escape immune memory updates. We start by studying numerically a minimal agent based model with a few simple ingredients governing the microscopic interactions between viruses and immune systems in an abstract framework. These ingredients couple processes at different scales --- immune response, epidemiology, evolution --- that all together determine the evolutionary outcome. We find that the population of immune systems drives viruses to a set of interesting evolutionary patterns, which can also be observed in nature. We map these evolutionary strategies onto model parameters.Then we study a coarse-grained theoretical model for the evolution of viruses and immune receptors in antigenic space consisting of a system of coupled stochastic differential equations, inspired by the previous agent-based simulations.This study sheds light on the interplay between the different scales constituting this phylodynamic system.We obtain some analytical insights into how immune systems constrain viral evolution in antigenic space while viruses manage to sustain a steady state escape dynamics.We validate the theoretical predictions against numerical simulations.In the second part of this work we exploit the enormous amount of protein sequence data to extract information about the evolutionary constraints acting on repeat protein families, whose elements are proteins made of many repetitions of conserved portions of amino-acids, called repeats.We couple an inference scheme to computational models, which leverage equilibrium statistical mechanics ideas to characterize the macroscopic observables arising from a probabilistic description of protein sequences.We use this framework to address how functional constraints reduce and shape the global space of repeat protein sequences that survive selection.We obtain an estimate of the number of accessible sequences, and we characterize quantitatively the relative role of different constraints and phylogenetic effects in reducing this space.Our results suggest that the studied repeat protein families are constrained by a rugged landscape shaping the accessible sequence space in multiple clustered subtypes of the same family.Then we exploit the same framework to address the interplay between evolutionary constraints and phylogenetic correlations in repeat tandem arrays.As a result we infer quantitatively the functional constraints, together with the relative timescale between repeat duplications/deletions and point mutations.We also investigate and map what microscopic evolutionary mechanisms can generate specific inter-repeat statistical patterns, which are recurrently observed in data.Preliminary results suggest that evolution of repeat tandem arrays is strongly out of equilibrium.; L'évolution limite la diversité des organismes par la sélection naturelle. Nous construisons ici des modèles théoriques pour étudier l'effet des contraintes évolutives sur deux systèmes biologiques à des échelles différentes: la coévolution virale-immune et l'évolution des protéines. Nous étudions d'abord comment les systèmes immunitaires limitent le parcours évolutif des virus qui tentent constamment d'échapper aux mises à jour de la mémoire immunitaire. Nous commençons par étudier numériquement un modèle agent-based minimal régissant les interactions microscopiques entre les virus et les systèmes immunitaires dans un cadre abstrait. Ces ingrédients couplent des processus biologiques à différentes échelles --- réponse immunitaire, épidémiologie, évolution --- qui conjointement déterminent le résultat de l'évolution. Nous constatons que la population des systèmes immunitaires pousse les virus vers un ensemble de motifs biologiquement pertinents. Nous caractérisons ces stratégies évolutives en fonction des paramètres du modèle. Ensuite nous étudions un description à gros grains décrivant l'évolution des virus et des récepteurs immunitaires dans l'espace antigénique. Cette approche consistant en un système d'équations différentielles stochastiques couplées permet de clarifier l'interaction entre les différentes échelles qui constituent ce système phylodynamique. Nous obtenons une description analytique de la façon dont les systèmes immunitaires limitent l'évolution des virus dans l'espace antigénique, alors que les virus parviennent à maintenir une dynamique de fuite en régime permanent. Nous validons les prédictions théoriques à l'aide des simulations numériques. Dans la deuxième partie de ce travail, nous exploitons l'énorme quantité de données accessible sur les séquences protéiques pour extraire des informations sur les contraintes évolutives agissant sur les familles de protéines répétées, constituées de nombreuses répétitions de portions conservées d'acides aminés. Nous couplons un schéma d'inférence à des modèles numériques en nous appuyant sur des idées de mécanique statistique à l'équilibre afin caractériser les observables biologiques découlant d'une description probabiliste des séquences de protéines. Nous utilisons ce cadre pour étudier comment les contraintes fonctionnelles réduisent et façonnent l'espace global des séquences protéiques répétées qui survivent à la sélection. Nous obtenons une estimation du nombre de séquences accessibles, et nous caractérisons quantitativement le rôle relatif des différentes contraintes et des effets phylogénétiques dans la réduction de cet espace. Nos résultats suggèrent que les familles de protéines répétées étudiées sont contraintes par un paysage accidenté qui façonne l'espace des séquences accessibles en plusieurs sous-types groupés de la même famille.Nous exploitons ensuite le même cadre pour étudier l'interaction entre les contraintes évolutives et les corrélations phylogénétiques dans les séries de répétitions. Nous déduisons quantitativement les contraintes fonctionnelles, ainsi que l'échelle de temps relative entre les duplications/suppressions des répétitions et les mutations ponctuelles. Nous étudions et caractérisons également les mécanismes évolutifs microscopiques qui peuvent générer des motifs statistiques spécifiques entre répétitions, observés de manière récurrente dans les données. Les résultats préliminaires suggèrent que l'évolution des séries de répétitions est un processus fortement hors équilibre.

Evolution constrains organism diversity through natural selection. Here we build theoretical models to study the effect of evolutionary constraints on two natural systems at different scales: viral-immune coevolution and protein evolution. First we study how immune systems constrain the evolutionary path of viruses which constantly try to escape immune memory updates. We start by studying numerically a minimal agent based model with a few simple ingredients governing the microscopic interactions between viruses and immune systems in an abstract framework. These ingredients couple processes at different scales - immune response, epidemiology, evolution - that all together determine the evolutionary outcome. We find that the population of immune systems drives viruses to a set of interesting evolutionary patterns, which can also be observed in nature. We map these evolutionary strategies onto model parameters. Then we study a coarse-grained theoretical model for the evolution of viruses and immune receptors in antigenic space consisting of a system of coupled stochastic differential equations, inspired by the previous agent-based simulations. This study sheds light on the interplay between the different scales constituting this phylodynamic system. We obtain some analytical insights into how immune systems constrain viral evolution in antigenic space while viruses manage to sustain a steady state escape dynamics. We validate the theoretical predictions against numerical simulations. In the second part of this work we exploit the enormous amount of protein sequence data to extract information about the evolutionary constraints acting on repeat protein families, whose elements are proteins made of many repetitions of conserved portions of amino-acids, called repeats. We couple an inference scheme to computational models, which leverage equilibrium statistical mechanics ideas to characterize the macroscopic observables arising from a probabilistic description of protein sequences. We use this framework to address how functional constraints reduce and shape the global space of repeat protein sequences that survive selection. We obtain an estimate of the number of accessible sequences, and we characterize quantitatively the relative role of different constraints and phylogenetic effects in reducing this space. Our results suggest that the studied repeat protein families are constrained by a rugged landscape shaping the accessible sequence space in multiple clustered subtypes of the same family. Then we exploit the same framework to address the interplay between evolutionary constraints and phylogenetic correlations in repeat tandem arrays. As a result we infer quantitatively the functional constraints, together with the relative timescale between repeat duplications/deletions and point mutations. We also investigate and map what microscopic evolutionary mechanisms can generate specific inter-repeats statistical patterns, which are recurrently observed in data. Preliminary results suggest that evolution of repeat tandem arrays is strongly out of equilibrium.; L'évolution limite la diversité des organismes par la sélection naturelle. Nous construisons ici des modèles théoriques pour étudier l'effet des contraintes évolutives sur deux systèmes biologiques à des échelles différentes : la coévolution virale-immune et l'évolution des protéines. Nous étudions d'abord comment les systèmes immunitaires limitent le parcours évolutif des virus qui tentent constamment d'échapper aux mises à jour de la mémoire immunitaire. Nous commençons par étudier numériquement un modèle agent-based minimal régissant les interactions microscopiques entre les virus et les systèmes immunitaires dans un cadre abstrait. Ces ingrédients couplent des processus biologiques à différentes échelles - réponse immunitaire, épidémiologie, évolution - qui conjointement déterminent le résultat de l'évolution. Nous constatons que la population des systèmes immunitaires pousse les virus vers un ensemble de motifs biologiquement pertinents. Nous caractérisons ces stratégies évolutives en fonction des paramètres du modèle. Ensuite nous étudions une description à gros grains décrivant l'évolution des virus et des récepteurs immunitaires dans l'espace antigénique. Cette approche consistant en un système d'équations différentielles stochastiques couplées permet de clarifier l'interaction entre les différentes échelles qui constituent ce système phylodynamique. Nous obtenons une description analytique de la façon dont les systèmes immunitaires limitent l'évolution des virus dans l'espace antigénique, alors que les virus parviennent à maintenir une dynamique de fuite en régime permanent. Nous validons les prédictions théoriques à l'aide des simulations numériques. Dans la deuxième partie de ce travail, nous exploitons l'énorme quantité de données accessible sur les séquences protéiques pour extraire des informations sur les contraintes évolutives agissant sur les familles de protéines répétées, constituées de nombreuses répétitions de portions conservées d'acides aminés. Nous couplons un schéma d'inférence à des modèles numériques en nous appuyant sur des idées de mécanique statistique à l'équilibre afin caractériser les observables biologiques découlant d'une description probabiliste des séquences de protéines. Nous utilisons ce cadre pour étudier comment les contraintes fonctionnelles réduisent et façonnent l'espace global des séquences protéiques répétées qui survivent à la sélection. Nous obtenons une estimation du nombre de séquences accessibles, et nous caractérisons quantitativement le rôle relatif des différentes contraintes et des effets phylogénétiques dans la réduction de cet espace. Nos résultats suggèrent que les familles de protéines répétées étudiées sont contraintes par un paysage accidenté qui façonne l'espace des séquences accessibles en plusieurs sous-types groupés de la même famille. Nous exploitons ensuite le même cadre pour étudier l'interaction entre les contraintes évolutives et les corrélations phylogénétiques dans les séries de répétitions. Nous déduisons quantitativement les contraintes fonctionnelles, ainsi que l'échelle de temps relative entre les duplications/suppressions des répétitions et les mutations ponctuelles. Nous étudions et caractérisons également les mécanismes évolutifs microscopiques qui peuvent générer des motifs statistiques spécifiques entre répétitions, observés de manière récurrente dans les données. Les résultats préliminaires suggèrent que l'évolution des séries de répétitions est un processus fortement hors équilibre.

Viral hepatitis is the most common form of hepatitis, with more than 360 million cases worldwide. Viral infection leads to the mobilization of the immune response via cytokines production, in particular chemokines and interleukins. The first part of our work focused on studying the role of the IL-18bp protein. For this, a model of murine hepatitis fulminant by inoculation of the murine hepatitis virus (MHV-3) was developed in wild-type mice and mice deficient in the protein IL-18bp. Following infection, we demonstrated that IL-18bp protein did not affect the development of fulminant hepatitis in mice. The second part of our work focused on the study of the chemokine CXCL14. We have demonstrated that this chemokine is expressed and then released by the hepatocytes during their lysis induced by viral infection. Our study also demonstrated that chemokine is present in high concentrations in the serum of patients with acute viral hepatitis. The MHV-3- induced viral hepatitis model was developed in wildtype mice and mice deficient in CXCL14. Infection of these mice with MHV-3 did not demonstrate a specific role for the chemokine CXCL14. However, differences in the immune response in uninfected mice have demonstrated a role for CXCL14 in immune surveillance. In fact, mice deficient in CXCL14 demonstrate a more active immune activity mediated by B lymphocytes than that observed in wild-type mice. The chemokine CXCL14 would therefore be a central actor in the immune response., Les hépatites virales constituent la forme la plus fréquente d’hépatite, avec plus de 360 millions de cas dans le Monde. L’infection virale entraine la mobilisation de la réponse immunitaire via la production de cytokines, en particulier de chimiokines et d’interleukines. Une première partie de nos travaux a porté sur l’étude du rôle de la protéine IL-18bp. Pour cela, un modèle d’hépatite murine virale fulminante par l’inoculation du virus de l’hépatite murine (MHV-3) a été développé chez des souris sauvages et des souris déficientes pour la protéine IL-18bp. Suite à l’infection, nous avons mis en évidence que la protéine IL-18bp n’impactait pas le développement de l’hépatite fulminante chez la souris. La seconde partie de nos travaux a porté sur l’étude de la chimiokine CXCL14. Nous avons mis en évidence que cette chimiokine était exprimée puis relarguée par les hépatocytes lors de leur lyse induite par l’infection virale. Notre étude a également démontré que la chimiokine était présente à de fortes concentrations dans le sérum de patients présentant une hépatite aiguë d’origine virale. Le modèle d’hépatite virale induite par le MHV-3 a été développé chez des souris sauvages et des souris déficientes pour CXCL14. L’infection de ces souris par le MHV-3 n’a pas démontré de rôle spécifique de la chimiokine CXCL14. Cependant, des différences de réponse immunitaire chez les souris non infectées ont mis en évidence un rôle de CXCL14 dans la surveillance immunitaire. En effet, les souris déficientes pour CXCL14 démontrent une activité immunitaire médiée par les lymphocytes B plus active que celle observée chez les souris sauvages. La chimiokine CXCL14 serait donc un acteur central de la réponse immunitaire.

NO or nitric oxide is a highly reactive free radical that is ubiquitous in the living world. It is capable of modifying DNA bases, membrane lipids, the activity of enzymes, etc. It has many biological roles in animals, plants, fungi and bacteria. It is produced in particular by cells of the innate immunity to fight against infections.To infect host, certain pathogenic bacteria have developed mechanisms to resist this stress. Bacillus cereus, is a pathogen that is able to resist NO. However, these mechanisms have not been fully elucidated. The Mfd protein is known to repair damage to NO on DNA and to increase resistance to NO stress.On one hand, a transcriptomic approach on Bacillus cereus allows to highlight a genomic region particularly activated in presence of NO. This region contains genes that code for a damage repair protein, a nitrogen metabolism enzyme and enzymes from the biosynthesis of siroheme, a ferrous group.On the other hand, a Mfd inhibitor has been tested for its antibacterial efficiency on Bacillus cereus and on four bacteria responsible for infections in therapeutic impasse due to the appearance of antibiotic resistance.; Le NO ou monoxyde d’azote est un radical libre très réactif omniprésent dans le monde du vivant. Il est capable de modifier les bases d’ADN, les lipides membranaires, l’activité des enzymes… Il a de nombreux rôles biologiques chez les animaux, les plantes, les champignons et les bactéries. Il est notamment produit par les cellules de l’immunité innée pour lutter contre les infections.Pour infecter l’hôte, certaines bactéries pathogènes ont mis au point des mécanismes de résistance à ce stress. Bacillus cereus, est une bactérie pathogène qui est capable de résister au NO. Cependant ces mécanismes ne sont pas tout à fait élucidés. La protéine Mfd est connue comme pouvant réparer les lésions du NO sur l’ADN et augmenter la résistance au stress NO.D’une part, une approche transcriptomique sur Bacillus cereus a permis de mettre en évidence, une région du génome particulièrement activée en présence de NO. Cette région contient des gènes qui codent pour une protéine de réparation des dommages causés par le NO, une enzyme de métabolisme de l’azote et des enzymes de biosynthèse du sirohème, un groupement ferreux.D’autre part, un inhibiteur de la protéine Mfd a été testé pour son efficacité antibactérienne sur Bacillus cereus et sur quatre bactéries responsables d’infections en impasse thérapeutique à cause de l’apparition de résistances aux antibiotiques.

Streptococcus suis, l'une des principales bactéries pathogènes présentes chez les porcelets sevrés, est responsable d’importantes pertes économiques dans l'industrie porcine. Aujourd'hui, les vaccins autogènes composés de bactéries tuées (bactérines) sont principalement utilisés mais les études ayant mesuré leur effet chez les porcs sont rares et controversées. Cette étude a évalué la réponse immunitaire induite par ces vaccins sur le terrain en comparant la vaccination des truies (immunité passive transférée aux porcelets) et des porcelets (immunité active). L’étude utilisait une ferme ayant des problèmes récurrents à S. suis et était divisée en deux parties : I) Les porcelets de truies non vaccinées ont reçu 2 doses d'une bactérine autogène. II) Les truies ont reçu 2 doses du même vaccin durant la gestation. Les réponses en anticorps ont été analysées par ELISA et leur effet protecteur par un test d'opsonophagocytose (OPA). La vaccination des porcelets n'a pas induit de réponse immunitaire active même après deux doses. Dans la deuxième partie, des taux élevés d'anticorps (principalement d'origine maternelle) avec une importante activité OPA ont été observés chez les porcelets âgés d’environ 1 semaine, indépendamment de la vaccination des truies. Ils diminuaient à 3 semaines d’âge, période la plus à risque. Malgré une légère augmentation des anticorps chez les truies vaccinées, le transfert d'immunité maternelle aux porcelets restait identique. Globalement, un programme de vaccination actif ou passif de porcelet avec la bactérine autogène utilisée ici n'a pas induit de protection durable chez les porcelets post-sevrés. Une amélioration de la formulation du vaccin est requise., Streptococcus suis, one of the most important bacterial pathogen in weaned piglets, is responsible for serious economic losses in the swine industry. Today, mostly autogenous vaccines composed of killed bacteria (bacterins) are used but studies that assessed their protective effect on pigs are missing and their ability to protect is controversial. This comparative field study evaluated the immunological response induced by these vaccines comparing vaccination of sows (passive immunity transferred to piglets) or piglets (active immunity). Using a sow herd with recurrent S. suis problems, the study was divided in two parts: I) Piglets from non-vaccinated sows received 2 doses of an autogenous bacterin. II) Sows received 2 doses of the same vaccine during gestation. Antibody responses were analyzed by ELISA and their protective effect was evaluated by an opsonophagocytosis assay (OPA). Piglet vaccination failed to induce an active immune response even after two vaccine doses. In the 2nd part of the study, high levels of antibodies (mainly maternal-derived) with marked OPA activity were observed in piglets at 1 week old approximately, independently of sow vaccination. These antibodies decreased at 3 weeks of age, in the post-weaning high-risk period. In spite of a slight increase of antibodies in vaccinated sows, maternal immunity transfer to piglets did not increase. Overall, an active or passive piglet vaccination program with the autogenous bacterin used herein failed to induce lasting protection in post-weaned piglets. An improvement of vaccine formulation may be required.

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is a Gram-negative opportunistic pathogen primarily affecting immunocompromised and cystic fibrosis patients. In addition to lung and urinary tract infections, Pa is often isolated from blood of bacteremic patients. Blood stream infections caused by this particular pathogen register with higher mortality rates compared to septicemia associated with other bacteria. Once in the circulation, Pa faces the innate immune system of the blood, however the strategies employed by this pathogen to escape killing by the complement system and circulating phagocytes have not been investigated in whole blood. In this work, we assessed the survival of a collection of six Pa strains in human whole blood. We found that rather than cytotoxicity toward circulating leukocytes, complement resistance is the main driver of survival in the blood. The origin, serotype of the isolate, as well as the nature of the toxins expressed by the strains did not affect their survival. We also discovered that complement-sensitive strains prevent their eradication through the generation of a minor subpopulation of ‘'evaders'', able to withstand complement-mediated lysis. Depending on the strain, between 0.0001 and 0.01% of the initial population survived in human plasma. The characterization of evaders showed that they harbor a transient persister-like phenotype, and are also observed in Acinetobacter baumannii, Burkholderia multivorans, enteroaggregative Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Yersinia enterocolitica. Formation of evaders likely represent an efficient strategy for complement-sensitive bacteria to persist within the blood and disseminate through the host. Using a genome-wide screen of a transposon mutant library in human plasma (Tn-Seq), we identified new bacterial factors influencing the interplay between Pa and the complement system. We observed that bacteria negatively affected in de novo biotin and purine synthesis survive better in plasma than the parental strain. In addition, Tn-Seq identified an operon of three genes, that we named ‘'srg'' for ‘'serum resistant genes'' whose products are predicted to be membrane bound. SrgABC overexpression confers tolerance to plasma (1000 fold-increased survival compared to wt) and triggers an overproduction of alginates by the bacteria, suggesting complex interplay between bacterial membrane, exopolysaccharides and complement-mediated lysis., Pseudomonas aeruginosa (Pa) est une bactérie à Gram négatif considérée comme pathogène opportuniste, principalement retrouvée chez les patients immunodéprimés ou atteint de mucoviscidose. Cette cause majeure d'infections nosocomiales est à l'origine de pathologies pulmonaires et urinaires, mais est également fréquemment isolée à partir du sang de patients atteints de bactériémies. Les infections sanguines causées par ce pathogène ont été montrées comme particulièrement mortelles par rapport aux septicémies associées à d'autres espèces bactériennes. Une fois entré dans la circulation, Pa doit faire face au système immunitaire inné du sang, cependant les stratégies employées par ce pathogène afin de résister au système du complément et aux cellules phagocytaires n'ont jamais été étudiées dans le sang total. Grâce à l'étude de la survie d'une collection de six souches de Pa dans le sang total humain, nous avons pu démontrer que plutôt que la cytotoxicité envers les leucocytes circulants, la résistance à la lyse par le complément est le principal moteur de la survie bactérienne. De plus, l'origine, le sérotype de l'isolat, ainsi que la nature des toxines exprimées par les différentes souches n'impactent pas leur survie dans cet environnement. Nous avons également découvert que les bactéries sensibles au complément étaient capables d'éviter une éradication totale, grâce à la formation d'une sous-population d'‘‘evaders'' résistante à l'action lytique du complément. Suivant la souche étudiée, cette population représente entre 0,0001 et 0,01% de la population initiale. Ces cellules rares présentent un phénotype transitoire proche des persisteurs, et ont également été observées chez Acinetobacter baumannii, Burkholderia multivorans, enteroaggregative Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Yersinia enterocolitica. La formation d'‘‘evaders'' représente probablement une stratégie efficace permettant aux souches sensibles au complément de persister dans le sang et ainsi disséminer dans l'organisme. Grâce au criblage d'une banque de mutants de transposition en plasma humain (Tn-Seq), nous avons pu identifier de nouveau facteurs bactériens impliqués dans l'interaction entre Pa et le système du complément. Nous avons observé que des bactéries incapables de synthétiser leurs biotine et purines survivent mieux en plasma par rapport à la souche parentale. Egalement, le Tn-Seq nous a permis d'identifier un opéron de trois gènes, que nous avons nommé ‘'srg'' pour ‘'serum resistant genes'', dont les produits sont prédits comme étant localisés à la membrane. La surexpression des protéines SrgABC confère à la bactérie une survie accrue en plasma (augmentation d'un facteur 1000 par rapport à la souche sauvage), et induit une surproduction des alginates chez cette dernière, suggérant l'existence d'une interaction complexe entre la membrane bactérienne, la sécrétion d'exopolysacharides et l'action lytique du complément.

Viral hepatitis is the most common form of hepatitis, with more than 360 million cases worldwide. Viral infection leads to the mobilization of the immune response via cytokines production, in particular chemokines and interleukins. The first part of our work focused on studying the role of the IL-18bp protein. For this, a model of murine hepatitis fulminant by inoculation of the murine hepatitis virus (MHV-3) was developed in wild-type mice and mice deficient in the protein IL-18bp. Following infection, we demonstrated that IL-18bp protein did not affect the development of fulminant hepatitis in mice. The second part of our work focused on the study of the chemokine CXCL14. We have demonstrated that this chemokine is expressed and then released by the hepatocytes during their lysis induced by viral infection. Our study also demonstrated that chemokine is present in high concentrations in the serum of patients with acute viral hepatitis. The MHV-3- induced viral hepatitis model was developed in wildtype mice and mice deficient in CXCL14. Infection of these mice with MHV-3 did not demonstrate a specific role for the chemokine CXCL14. However, differences in the immune response in uninfected mice have demonstrated a role for CXCL14 in immune surveillance. In fact, mice deficient in CXCL14 demonstrate a more active immune activity mediated by B lymphocytes than that observed in wild-type mice. The chemokine CXCL14 would therefore be a central actor in the immune response., Les hépatites virales constituent la forme la plus fréquente d’hépatite, avec plus de 360 millions de cas dans le Monde. L’infection virale entraine la mobilisation de la réponse immunitaire via la production de cytokines, en particulier de chimiokines et d’interleukines. Une première partie de nos travaux a porté sur l’étude du rôle de la protéine IL-18bp. Pour cela, un modèle d’hépatite murine virale fulminante par l’inoculation du virus de l’hépatite murine (MHV-3) a été développé chez des souris sauvages et des souris déficientes pour la protéine IL-18bp. Suite à l’infection, nous avons mis en évidence que la protéine IL-18bp n’impactait pas le développement de l’hépatite fulminante chez la souris. La seconde partie de nos travaux a porté sur l’étude de la chimiokine CXCL14. Nous avons mis en évidence que cette chimiokine était exprimée puis relarguée par les hépatocytes lors de leur lyse induite par l’infection virale. Notre étude a également démontré que la chimiokine était présente à de fortes concentrations dans le sérum de patients présentant une hépatite aiguë d’origine virale. Le modèle d’hépatite virale induite par le MHV-3 a été développé chez des souris sauvages et des souris déficientes pour CXCL14. L’infection de ces souris par le MHV-3 n’a pas démontré de rôle spécifique de la chimiokine CXCL14. Cependant, des différences de réponse immunitaire chez les souris non infectées ont mis en évidence un rôle de CXCL14 dans la surveillance immunitaire. En effet, les souris déficientes pour CXCL14 démontrent une activité immunitaire médiée par les lymphocytes B plus active que celle observée chez les souris sauvages. La chimiokine CXCL14 serait donc un acteur central de la réponse immunitaire.

Lung cancer is the main cause of death by cancer worldwide. Despite the variety of available treatments, including surgery, chemotherapy, radiotherapy, and immune therapy, the average 5-year survival is 60%. One of the underlying reasons is a very high variability in patients’ susceptibility to treatment, explained by genetic background and since recently – our microbiota. The term microbiota includes bacteria, archaea, fungi, viruses and protists that inhabit our organism. The studies in animal models show that the gut microbiota (focused on bacteria) has a crucial role in host’s responsiveness to therapy through the stimulation of immune system. In this light, several “communication axes” between the gut and distal tumour sites have started to develop, including the “gut-lung” axis. However, the resident microbiota in the lungs that could directly influence the tumour response and interact with the gut microbiota has been scarcely characterised. To enable further development of the idea of the “gut-lung-lung cancer” axis, we included 18 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients eligible for surgery and analysed the microbiota from four different lung samples (non-malignant, peritumoural and tumour tissue and bronchoalveolar lavage fluid; BAL), saliva and faeces by high-throughput sequencing. We also analysed several immune markers, as lymphocytic tumour infiltrate, Th and neutrophil profiles and cytokines in BAL and blood, and inflammatory markers in faeces along with short-chain fatty acids. Focusing first on the lungs, we show that BAL microbiota represents a significantly distinct community compared to lung tissue microbiota by providing detailed characterisation of the four different lung samples. Since tumours in lower lobes are reported as the ones with the worse prognosis, we investigated how the lobe location affected the microbiota composition. Peritumoural tissue and BAL microbiota were identified as the most affected in both abundance and diversity, and tumour as the least affected. However, phylum Firmicutes, previously reported as elevated in chronic obstructive pulmonary disease compared to controls, was found more abundant in microbiota from lower lung lobes. Therefore, we propose that both increase in Firmicutes and extensive changes in peritumoural tissue could be associated to increased aggressiveness of the lower lobe tumours. Next, we show that the presence of metastatic lymph nodes (LN), negative prognostic marker in NSCLC, significantly influence the local tissue microbiota in relation to its respiratory profile. We reported that anaerobic bacteria were more abundant within the tumour in the presence of metastatic LN, and aerobic bacteria within the one without it. Moreover, exactly inverse was observed for the same bacteria in extratumoural tissues. Along with migratory hypothesis depending on the bacterial preference for growth conditions shaped by tumour’s features, we propose several biomarkers for detection of metastatic LN that might facilitate their detection without imposing LN biopsy. Finally, we showed that BAL microbiota is the most associated to the local immune response and independent of the presence of metastatic LN. Future research will focus on the exploration of the interaction between the lung microbiota, systemic immunity and the gut microbiota.; Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. En dépit de la variété de traitements disponibles, tels que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie, la survie moyenne à 5 ans est de 60 %. L’une des raisons sous-jacente est une très grande variabilité de réponse au traitement, expliquée par les antécédents génétiques du patient et depuis peu par son microbiote. Le terme « microbiote » regroupe les bactéries, les archées, les champignons, les virus et les protistes qui colonisent notre organisme. Des études utilisant des modèles animaux montrent que le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans la réponse de l’hôte au traitement, via la stimulation du système immunitaire. Dans ce contexte, plusieurs « axes de communication » entre le site intestinal et les sites tumoraux distaux commencent à émerger, y compris l’axe « intestin-poumon ». Cependant, le microbiote pulmonaire, qui pourrait directement influencer la réponse tumorale et interagir avec le microbiote intestinal, est pour l’heure peu caractérisé. Afin de développer cette idée d’un axe « intestin, poumon et cancer du poumon », nous avons inclus dans notre étude 18 patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules (CBNPC) admissibles à la chirurgie. Nous avons analysé leurs microbiotes par séquençage à haut débit à partir de quatre échantillons différents de poumon (tissu sain, tissus péritumoral et tumoral et fluide de lavage broncho-alvéolaire LBA) mais également à partir d’échantillons de salive et de fèces. Nous avons également analysé plusieurs marqueurs immunitaires (infiltration lymphocytaire des tumeurs, profils Th et neutrophiles, cytokines dans le LBA et le sang), des marqueurs inflammatoires et enfin les acides gras à chaînes courtes dans les fèces. Une caractérisation détaillée de ces quatre types d’échantillons de poumons nous a permis de montrer que le microbiote du LBA présente une communauté nettement distincte de celle du tissu pulmonaire. Les tumeurs des lobes inférieurs prédisant le plus mauvais pronostic, nous avons décidé d’étudier le lien entre l’emplacement des tumeurs et la composition du microbiote. Les microbiotes du tissu péritumoral et du LBA ont été identifiés comme étant les plus impactés en terme d’abondance et de diversité ; la tumeur est quant à elle moins impactée. Cependant nous avons observé que le phylum des Firmicutes, décrit comme étant élevé dans les maladies pulmonaires obstructives chroniques, est plus abondant dans le microbiote des lobes inférieurs du poumon. Par conséquent, nous pouvons émettre l’hypothèse que l’augmentation des Firmicutes et les variations importantes du microbiote dans le tissu péritumoral pourraient être associés à une agressivité accrue des tumeurs du lobe inférieur. Nous avons ensuite démontré que la présence de ganglions lymphatiques (GL) métastatiques, marqueur d’un pronostic négatif dans le NSCLC, influence considérablement le microbiote local de par le profil respiratoire du tissu. Nous avons en effet observé que les bactéries anaérobies étaient plus abondantes dans les tumeurs en présence de LN métastatiques. Les bactéries aérobies sont quant à elles plus représentées dans les tumeurs sans GL métastatiques. Nous avons cependant observé la situation inverse dans les tissus extratumoraux. L’hypothèse avancée est celle d’une migration bactérienne en fonction des préférences de conditions de croissance, directement liées aux caractéristiques de la tumeur. Ceci nous permet de proposer plusieurs biomarqueurs pour la détection de GL métastatique, facilitant ainsi leur détection sans imposer de biopsie. Enfin, nous montrons que le microbiote du LBA est d’avantage associé à la réponse immunitaire locale et est indépendant de la présence de GL métastatique. Les recherches à venir porteront sur l’exploration de l’interaction entre le microbiote pulmonaire, l’immunité systémique et le microbiote intestinal.

Lung cancer is the main cause of death by cancer worldwide. Despite the variety of available treatments, including surgery, chemotherapy, radiotherapy, and immune therapy, the average 5-year survival is 60%. One of the underlying reasons is a very high variability in patients’ susceptibility to treatment, explained by genetic background and since recently – our microbiota. The term microbiota includes bacteria, archaea, fungi, viruses and protists that inhabit our organism. The studies in animal models show that the gut microbiota (focused on bacteria) has a crucial role in host’s responsiveness to therapy through the stimulation of immune system. In this light, several “communication axes” between the gut and distal tumour sites have started to develop, including the “gut-lung” axis. However, the resident microbiota in the lungs that could directly influence the tumour response and interact with the gut microbiota has been scarcely characterised. To enable further development of the idea of the “gut-lung-lung cancer” axis, we included 18 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients eligible for surgery and analysed the microbiota from four different lung samples (non-malignant, peritumoural and tumour tissue and bronchoalveolar lavage fluid; BAL), saliva and faeces by high-throughput sequencing. We also analysed several immune markers, as lymphocytic tumour infiltrate, Th and neutrophil profiles and cytokines in BAL and blood, and inflammatory markers in faeces along with short-chain fatty acids. Focusing first on the lungs, we show that BAL microbiota represents a significantly distinct community compared to lung tissue microbiota by providing detailed characterisation of the four different lung samples. Since tumours in lower lobes are reported as the ones with the worse prognosis, we investigated how the lobe location affected the microbiota composition. Peritumoural tissue and BAL microbiota were identified as the most affected in both abundance and diversity, and tumour as the least affected. However, phylum Firmicutes, previously reported as elevated in chronic obstructive pulmonary disease compared to controls, was found more abundant in microbiota from lower lung lobes. Therefore, we propose that both increase in Firmicutes and extensive changes in peritumoural tissue could be associated to increased aggressiveness of the lower lobe tumours. Next, we show that the presence of metastatic lymph nodes (LN), negative prognostic marker in NSCLC, significantly influence the local tissue microbiota in relation to its respiratory profile. We reported that anaerobic bacteria were more abundant within the tumour in the presence of metastatic LN, and aerobic bacteria within the one without it. Moreover, exactly inverse was observed for the same bacteria in extratumoural tissues. Along with migratory hypothesis depending on the bacterial preference for growth conditions shaped by tumour’s features, we propose several biomarkers for detection of metastatic LN that might facilitate their detection without imposing LN biopsy. Finally, we showed that BAL microbiota is the most associated to the local immune response and independent of the presence of metastatic LN. Future research will focus on the exploration of the interaction between the lung microbiota, systemic immunity and the gut microbiota.; Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. En dépit de la variété de traitements disponibles, tels que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie, la survie moyenne à 5 ans est de 60 %. L’une des raisons sous-jacente est une très grande variabilité de réponse au traitement, expliquée par les antécédents génétiques du patient et depuis peu par son microbiote. Le terme « microbiote » regroupe les bactéries, les archées, les champignons, les virus et les protistes qui colonisent notre organisme. Des études utilisant des modèles animaux montrent que le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans la réponse de l’hôte au traitement, via la stimulation du système immunitaire. Dans ce contexte, plusieurs « axes de communication » entre le site intestinal et les sites tumoraux distaux commencent à émerger, y compris l’axe « intestin-poumon ». Cependant, le microbiote pulmonaire, qui pourrait directement influencer la réponse tumorale et interagir avec le microbiote intestinal, est pour l’heure peu caractérisé. Afin de développer cette idée d’un axe « intestin, poumon et cancer du poumon », nous avons inclus dans notre étude 18 patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules (CBNPC) admissibles à la chirurgie. Nous avons analysé leurs microbiotes par séquençage à haut débit à partir de quatre échantillons différents de poumon (tissu sain, tissus péritumoral et tumoral et fluide de lavage broncho-alvéolaire LBA) mais également à partir d’échantillons de salive et de fèces. Nous avons également analysé plusieurs marqueurs immunitaires (infiltration lymphocytaire des tumeurs, profils Th et neutrophiles, cytokines dans le LBA et le sang), des marqueurs inflammatoires et enfin les acides gras à chaînes courtes dans les fèces. Une caractérisation détaillée de ces quatre types d’échantillons de poumons nous a permis de montrer que le microbiote du LBA présente une communauté nettement distincte de celle du tissu pulmonaire. Les tumeurs des lobes inférieurs prédisant le plus mauvais pronostic, nous avons décidé d’étudier le lien entre l’emplacement des tumeurs et la composition du microbiote. Les microbiotes du tissu péritumoral et du LBA ont été identifiés comme étant les plus impactés en terme d’abondance et de diversité ; la tumeur est quant à elle moins impactée. Cependant nous avons observé que le phylum des Firmicutes, décrit comme étant élevé dans les maladies pulmonaires obstructives chroniques, est plus abondant dans le microbiote des lobes inférieurs du poumon. Par conséquent, nous pouvons émettre l’hypothèse que l’augmentation des Firmicutes et les variations importantes du microbiote dans le tissu péritumoral pourraient être associés à une agressivité accrue des tumeurs du lobe inférieur. Nous avons ensuite démontré que la présence de ganglions lymphatiques (GL) métastatiques, marqueur d’un pronostic négatif dans le NSCLC, influence considérablement le microbiote local de par le profil respiratoire du tissu. Nous avons en effet observé que les bactéries anaérobies étaient plus abondantes dans les tumeurs en présence de LN métastatiques. Les bactéries aérobies sont quant à elles plus représentées dans les tumeurs sans GL métastatiques. Nous avons cependant observé la situation inverse dans les tissus extratumoraux. L’hypothèse avancée est celle d’une migration bactérienne en fonction des préférences de conditions de croissance, directement liées aux caractéristiques de la tumeur. Ceci nous permet de proposer plusieurs biomarqueurs pour la détection de GL métastatique, facilitant ainsi leur détection sans imposer de biopsie. Enfin, nous montrons que le microbiote du LBA est d’avantage associé à la réponse immunitaire locale et est indépendant de la présence de GL métastatique. Les recherches à venir porteront sur l’exploration de l’interaction entre le microbiote pulmonaire, l’immunité systémique et le microbiote intestinal.

Pigs selected for high performance may be more at risk of developing diseases. This study aimed to assess the health and performance of two pig lines divergently selected for residual feed intake (RFI) (low RFI (LRFI) v. high RFI (HRFI)) and housed in two contrasted hygiene conditions (poor v. good) using a 2×2 factorial design (n=40/group). The challenge period (Period 1), started on week zero (W0) when 12-week-old pigs were transferred to good or poor housing conditions. At week 6 (W6), half of the pigs in each group were slaughtered. During a recovery period (Period 2) from W6 to W13 to W14, the remaining pigs (n=20/group) were transferred in good hygiene conditions before being slaughtered. Blood was collected every three (Period 1) or 2 weeks (Period 2) to assess blood indicators of immune and inflammatory responses. Pulmonary lesions at slaughter and performance traits were evaluated. At W6, pneumonia prevalence was greater for pigs housed in poor than in good conditions (51% v. 8%, respectively, P