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Tese no âmbito do Doutoramento em Biociências, especialização em Biotecnologia orientada pelo Senhor Professor Euclides Vieira Pires e pela Senhora Professora Doutora Marlene Maria Tourais de Barros apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O cardo (Cynara cardunculus L.), pela biodiversidade morfológica, bioquímica e molecular, revela-se uma cultura multifuncional, adaptada às alterações climáticas, com um potencial de valorização das diferentes formas de biomassa em aplicações biotecnológicas. É uma fonte de compostos bioativos onde se destacam a inulina, os ácidos cafeoilquínicos, os flavonoides, as antocianinas, as lactonas sesquiterpénicas, os ácidos gordos e as proteases aspásticas. As flores de cardo, pela elevada concentração em cardosinas, são usadas como coagulante vegetal utilizado no fabrico de alguns queijos DOP da região mediterrânica. Foram analisadas as características morfológicas de cultivares de cardo, estabelecidos na região da Serra da Estrela, ao longo de três anos usando 34 descritores morfológicos com diferenças estatisticamente significativas entre cultivares para vinte e quatro características morfológicas que indicam uma ampla diversidade genética. As cultivares A26, D32 e D33, apresentaram uma arquitetura vegetal simultaneamente bem adaptada para a produção de flores e biomassa vegetal. Dez marcadores moleculares de microssatélites mostraram-se polimórficos revelando a capacidade em identificar a variabilidade genética nos genótipos de cardo selecionados. A dimensão dos alelos nos diversos loci variou entre 98 e 392 pb e o número efetivo de alelos por locus entre e 3 e 13. Os resultados obtidos em relação à diversidade genética dos nossos recursos genéticos, ainda que preliminares, corroboram a diversidade taxonómica entre o cardo selvagem e os cardos cultivados. A produção de biomassa do cardo pode ser variável dependendo dos genótipos. Foram obtidas por hectare, em termos médios, produções de 14600 kg ha-1 de biomassa aérea, das quais 32% correspondentes a inflorescências, 40% a caules e 28% a folhas. Podem ainda ser colhidas 475 kg de flores e 600 kg de aquénios. Nos ensaios de fertilização a aplicação do biochar combinada com fertilizantes minerais reduziu as emissões de N2O em 36% e o potencial de aquecimento global (GWP) em 26% em relação à mineral. A produção de biomassa foi aumentada em 50% pela aplicação de biochar combinada com fertilizantes minerais. Os perfis cardosinas de cada genótipo foram baseados em quatro grupos principais A0, A1, A e B. Durante três anos foi confirmada a estabilidade de 12 características bioquímicas dos extratos de flores e 26 descritores morfológicos de plantas. As relações entre o perfil bioquímico das flores e a atividade proteolítica, as propriedades de coagulação e textura final do queijo foram avaliadas em seis genótipos selecionados de cardo (1M-6M). Os genótipos 1M e 2M foram positivamente influenciados pela cardosina B e negativamente pela ação proteolítica sobre a β-caseína, na floculação inicial e consistência do gel. O genótipo 3M revelou uma lenta agregação de micelar e baixa firmeza de gel ao longo da coagulação do leite, o que se refletiu na textura suave do queijo. Os genótipos 4M, 5M e 6M apresentaram a maior concentração total de cardosinas, nomeadamente cardosina A, ação proteolítica sobre Ƙ-caseína, consistência de gel e o menor tempo de coagulação que se refletiu numa textura mais firme da matriz do queijo. A caracterização específica da diversidade bioquímica natural das flores de cardo e a sua influência na textura do queijo pode permitir aos produtores preverem as propriedades de queijo. Os aquénios do cardo são uma importante fonte de óleo com um rendimento médio de 25%. Na composição química os aquénios viáveis, comparativamente com os inviáveis, apresentaram níveis mais elevados de α-tocoferol (6,7 mg 100 g-1), lípidos (23,11 g 100 g-1, ácidos oleicos e linoleicos) e açúcares livres (5,4 g 100 g-1). O extrato hidroetanólico de sementes viáveis apresentaram uma maior concentração de compostos fenólicos, nomeadamente os ácidos 5-O-cafeoilquínico (8,0 mg g-1) e 3,5-O-dicafeoilquínico (43,9 mg g-1) e maior atividade antioxidante in vitro. Os perfis fenólicos obtidos pelas flores de cardo mostraram diferenças significativas entre diferentes genótipos de cardo, com os derivados de apigenina e ácido cafeoilquínico a serem os compostos com maior concentração. Além da sua forte atividade antioxidante, as inflorescências de cardo apresentaram uma atividade antibacteriana satisfatória, nomeadamente contra estirpes Gram-positivas, com um MIC particularmente baixo para Listeria monocytogenes. O caule de cardo é um material em que a celulose é a principal componente (46,3%), seguida da lenhina Klason (25,3%). Nos testes realizados para liquefação as melhores condições foram uma temperatura de 200ºC, duração de 60 min e uma dimensão de partícula de 60-80 mesh. Pelas suas características é um material promissor na produção de painéis de aglomerados de baixa densidade. As características e funções da biomassa de cardo podem permitir o desenvolvimento de produtos de base natural inovadores para aplicação biotecnológica na alimentação e nutrição, farmacologia e cosméticos, proteção de plantas e biocidas, óleos e energia, indústrias de aglomerados, saúde e promoção de bem-estar seguindo as tendências atuais de uma economia circular. Os resultados obtidos são, ainda, promissores para o desenvolvimento de um programa de melhoramento de plantas baseado em características bioquímicas e morfológicas, de forma a obter a arquitetura vegetal mais adaptada para fins combinados relacionados com a produção de flores contendo composições específicas de cardosinas, produção de diversas formas de biomassa e facilidade de colheita. Cardoon (Cynara cardunculus L.) is a multi-purpose and versatile Mediterranean crop, adapted to climate change with a wide spectrum of potential applications due its added value as a rich source of fibres, oils and bioactive compounds. The potential use of cardoon for biotechnological applications is due to its high content of bioactive compounds such as oligofructose inulin, caffeoylquinic acids, flavonoids, anthocyanins, sesquiterpenes lactones, triterpenes, fatty acids and aspartic proteases. Cardoon flower extract is a vegetable coagulant used exclusively in the manufacture of some Mediterranean PDO cheeses due to its extremely high concentration in cardosins. Selected cardoon cultivars established in the “Serra da Estrela” region were analysed to evaluate morphological characteristics. The biodiversity of twelve cardoon genotypes installed in an experimental field were evaluated over three growing seasons using thirty-four morphological descriptors. Statistically significant differences were found between cultivars for twenty-four morphological characteristics which indicate a wide genetic diversity. The relationship among the genotypes and characteristics was analysed using a principal component analysis. The first component was dominated positively by plant height diameter of stalk, inflorescence characteristics and flower production, while the second component was positively dominated by leaf characteristics. Genotypes A26, D32 and D33, presented a plant architecture simultaneously well adapted for flower production, ease of harvesting and plant biomass. 10 microsatellites molecular markers were polymorphic in cardoon, revealing the ability to identify genetic variability in selected thistle genotypes. The results obtained corroborate the morphological diversity between the wild and the cultivated cardoons. The application of biochar combined with mineral fertilizer reduced N2O emissions by 36% and global warming potential (GWP) by 26% relative to mineral. However, the cumulative CO2 and CH4 emissions as well as yield-scaled GWP were not significantly different among amended soil treatments. Furthermore, the biomass production was increased by 50% by the application of biochar combined with mineral fertilizer relative to mineral. Six distinct cardoon genotypes (1M-6M) selected based on total and specific cardosin concentrations were used to investigate the relationship between a given genotype, proteolytic activity on caseins, coagulation properties and final texture of cheese. During three growing seasons, the stability of 12 biochemical characteristics of flower extracts and 26 plant morphological descriptors was confirmed. The cardosin profiles of each genotype, based on four main groups A0, A1, A and B, were stable during the annual flower harvesting period and over all three years using ion-exchange chromatography and native-PAGE electrophoresis. Genotypes 1M and 2M were positively influenced by cardosin B and negatively by the proteolytic action over β-casein, in starting flocculation and gel consistency. Genotype 3M showed a slow micellar aggregation and low gel firmness along milk coagulation, which reflects in the smooth texture of cheese. Genotypes 4M, 5M and 6M, compared with others, presented the highest total concentration of cardosins, namely cardosin A, proteolytic action over Ƙ-casein, gel consistency, and the lowest time of coagulation which reflects in a firmer texture of the cheese matrix. The specific characterization of natural biochemical diversity of cardoon flowers and their influence on cheese texture seems to be of great interest since this knowledge will enable producers to predicted cheese properties within a wider range of texture to fulfil consumer demand. Cardoon achenes were characterized for their chemical composition and bioactivities according to the viability. Viable achenes contained higher levels of α-tocopherol (6.7 mg 100 g-1), lipids (23.11 g 100 g -1, manly oleic and linoleic acids), and free sugars (5.4 g 100 g-1) than the unviable ones. The hydroethanolic extract of viable seeds presented a higher concentration of phenolic compounds, namely 5-O-caffeoylquinic (8.0 mg g-1) and 3,5-O-dicaffeoylquinic (43.9 mg g-1) acids, and greater in vitro antioxidant activity. Phenolic profiles obtained by cardoon flowers showed significant differences among different cardoon genotypes, but apigenin and caffeoylquinic acid derivatives were generally the major molecules in all samples. Besides their strong antioxidant activity, the cardoon inflorescences showed satisfactory antibacterial activity, namely against Gram-positive strains, with particularly low MIC in Listeria monocytogenes. Cardoon stem is a material in which cellulose is the major component (46.3 %), followed by Klason lignin (25.3%). Optimal conditions to attain the best liquefaction yield were 200ºC, 60 min and a 60-80 particle size. The characteristics and functions of cardoon biomass permits the development of innovative bio-based-products for biotechnological application in food and nutrition, pharmaceutics and cosmetics, plant protection and biocides, oils and energy, lignocellulose materials, and healthcare industries following the actual trends of a circular economy. The results obtained are promising for the development of a plant breeding program based on biochemical and morphological characteristics in order to obtain the most adapted plant architecture for combined purposes related to specific cardosins composition, flower and plant biomass production, and ease of harvesting.

This work aimed to obtain aspartic proteases of industrial and biotechnological interest from the stomach of the crevalle jack fish (Caranx hippos). In order to do so, a crude extract (CE) of the stomach was obtained and subjected to a partial purification by salting-out, which resulted in the enzyme extract (EE) obtainment. EE proteases were characterized physicochemically and by means of zymogram. In addition, the effect of chemical agents on their activity was also assessed. By means of salting-out it was possible to obtain a purification of 1.6 times with a yield of 49.4%. Two acid proteases present in the EE were observed in zymogram. The optimum temperature and thermal stability for EE acidic proteases were 55 ºC and 45 °C, respectively. The optimum pH and pH stability found for these enzymes were pH 1.5 and 7.0, respectively. Total inhibition of EE acid proteolytic activity was observed in the presence of pepstatin A. dithiothreitol (DTT) and Ca2+ did not promote a significant effect on enzyme activity. In the presence of heavy metals, such as Al3+, Cd2+ and Hg2+, EE acidic proteases showed more than 70% of their enzymatic activity. The results show that it is possible to obtain, from the stomach of C. hippos, aspartic proteases with high proteolytic activity and characteristics that demonstrate potential for industrial and biotechnological applications. Resumo Este trabalho objetivou obter proteases aspárticas de interesse industrial e biotecnológico a partir do estômago do peixe xaréu (Caranx hippos). Para isso, foi obtido um extrato bruto do estômago, o qual foi submetido a uma purificação parcial por salting-out onde se obteve o extrato enzimático (EE). As proteases do EE foram caracterizadas físico-quimicamente e através de zimograma. Além disso, o efeito de agentes químicos sobre sua atividade também foi avaliado. Através de salting-out foi possível obter uma purificação de 1,6 vezes com rendimento de 49,4%. Foram observadas duas proteases ácidas presentes no EE através de zimograma. A temperatura ótima e a estabilidade térmica para as proteases ácidas do EE foram de 55 ºC e 45 °C, respectivamente. O pH ótimo e a estabilidade ao pH encontrados para estas enzimas foram o pH 1,5 e 7,0, respectivamente. Observou-se a inibição total da atividade proteolítica ácida do EE na presença de pepstatina A. O ditiotreitol (DTT) e o Ca2+ não promoveram efeito significativo na atividade enzimática. Na presença de metais pesados, como Al3+, Cd2+ e Hg2+, o EE manteve mais de 70% de atividade enzimática do EE. Os resultados mostram que é possível obter, a partir do estômago de C. hippos, proteases aspárticas com alta atividade proteolítica e características que demonstram potencial para aplicações industriais e biotecnológicas.

Tese de doutoramento em Bioquímica, na especialidade de Tecnologia Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Os membros do género Rickettsia são bactérias intracelulares obrigatórias do tipo gram-negativas, cuja transmissão a mamíferos pode ocorrer através de vetores artrópodes como carraças, pulgas ou piolhos. Entre as várias espécies identificadas, muitas são patogénicas para o Homem causando doenças infeciosas agudas das quais se destacam o tifo epidémico (Rickettsia prowazekii), a febre maculosa das montanhas rochosas (Rickettsia rickettsii) e a febre escaro-nodular (Rickettsia conorii). A elevada patogenicidade e o caráter emergente destas doenças, associados à inexistência de vacinas eficazes para a sua prevenção, reforçam inequivocamente a necessidade de identificar novos fatores proteicos para o desenvolvimento de terapêuticas inovadoras. Neste sentido, tem-se assistido nas últimas décadas a avanços significativos na compreensão dos mecanismos de patogénese e de resposta imunitária às rickettsioses. Contudo, a validação da função biológica de genes de Rickettsia tem sido amplamente limitada pela natureza estritamente intracelular destes organismos que dificulta a sua manipulação. Por conseguinte, a comparação entre os múltiplos genomas disponíveis de Rickettsia tem revelado ser o método mais expedito para a identificação de novos fatores proteicos potencialmente implicados na patogenicidade destes micro-organismos. Este trabalho descreve a identificação e caracterização de uma nova protease membranar do tipo retropepsina, altamente conservada em 55 genomas de Rickettsia. Apesar da baixa similaridade na sequência de aminoácidos relativamente a outras retropepsinas, demonstrámos que a proteína codificada pelo gene homólogo RC1339 de R. conorii Malish 7, designada por APRc para protease aspártica de Rickettsia conorii, é uma enzima ativa com propriedades altamente reminiscentes desta família de proteases aspárticas. Entre outras, destacam-se a atividade autolítica comprometida pela mutação do aspartato catalítico, a acumulação na forma dimérica, uma atividade ótima a pH de 6 e a inibição por inibidores específicos da protease do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1. Além disso, utilizando uma abordagem de mapeamento de especificidade de alto débito, foi possível confirmar que os determinantes de especificidade da APRc são semelhantes aos de outras proteases aspárticas de ambos os tipos, retropepsina e pepsina. Neste trabalho, demonstrámos também que o gene codificante da APRc é transcrito e traduzido em pelo menos duas espécies patogénicas de Rickettsia (R. conorii e R. rickettsii), e que esta proteína é integrada na membrana externa de ambas. Ao explorar as potenciais funções biológicas da APRc, verificámos que esta protease catalisa o processamento in vitro de dois membros da família das proteínas autotransportadoras envolvidas na adesão e invasão de Rickettsia: Sca5/rOmpB e Sca0/rOmpA. Estes resultados apontam assim para a participação da APRc numa via proteolítica relevante para a virulência destes micro-organismos, surgindo esta protease como um alvo interessante para a intervenção terapêutica contra as rickettsioses. Por fim, ao demonstrar que a APRc é um novo membro da família das proteases aspárticas do tipo retropepsina, provamos simultaneamente que estas enzimas estão efetivamente presentes em bactérias gram-negativas intracelulares, pelo que poderão representar uma forma ancestral desta classe de proteases. Members of the genus Rickettsia are obligate intracellular, gram-negative, arthropod-borne pathogens of humans and other mammals, causing severe infections including epidemic typhus (Rickettsia prowazekii), Rocky Mountain spotted fever (Rickettsia rickettsii), and Mediterranean spotted fever (Rickettsia conorii). The life-threatening character of diseases caused by many Rickettsia spp. and the lack of reliable protective vaccine against rickettsioses strengthens the importance of identifying new protein factors for the potential development of innovative therapeutic tools. However, progress in correlating rickettsial genes and gene functions has been greatly hampered by the intrinsic difficulty in working with these obligate intracellular bacteria, despite the increasing insights into the mechanisms of pathogenesis of and the immune response to rickettsioses. Therefore, comparison of the multiple available genomes of Rickettsia is proving to be the most practical method to identify new factors that may play a role in pathogenicity. The present work reports the identification and characterization of a novel membrane-embedded retropepsin-like homologue, highly conserved in 55 Rickettsia genomes. Using R. conorii Malish 7 gene homologue RC1339 as our working model we demonstrate that, despite the low overall sequence similarity to retropepsins, the gene product of RC1339 APRc (for Aspartic Protease from Rickettsia conorii) is an active enzyme with features highly reminiscent of this family of aspartic proteases, such as autolytic activity impaired by mutation of the catalytic aspartate, accumulation in the dimeric form, optimal activity at pH 6, and inhibition by specific HIV-1 protease inhibitors. Moreover, specificity preferences determined by a high-throughput profiling approach confirmed common preferences between this novel rickettsial enzyme and other aspartic proteases, both retropepsin and pepsin-like enzymes. Additionally, we have also shown that APRc is transcribed and translated by at least two pathogenic rickettsial species, R. conorii and R. rickettsii, and is integrated into the outer membrane of both species. By further exploring one of its putative biological roles, we have demonstrated that APRc is sufficient to catalyze the in vitro processing of two conserved high molecular weight autotransporter adhesin/invasion proteins, Sca5/rOmpB and Sca0/rOmpA, thereby suggesting the participation of this enzyme in a relevant proteolytic pathway in rickettsial virulence. As a novel bona fide member of the retropepsin family of aspartic proteases, APRc emerges as an intriguing target for therapeutic intervention against fatal rickettsioses. Finally, with this work we demonstrate that retropepsin-type aspartic proteases are indeed present in gram-negative intracellular bacteria such as Rickettsia, suggesting that these enzymes may represent an ancestral form of this class of proteases. FCT - SFRH/BD/47638/2008

Doutoramento em Biologia As proteinases aspárticas (PAs) são um importante grupo de enzimas devido ao envolvimento em processos patológicos e fisiológicos. Apesar da diversidade funcional apresentam homologia nos seus domínios N- e Cterminal. Esta estrutura parece ter evoluído através de processos de duplicação e fusão interna de genes. Entre os membros das PAs está a cardosina A de Cynara cardunculus sp, uma enzima heterodimérica que tem sido alvo de intensa caracterização. O seu processo de purificação permite grandes rendimentos de enzima pura, tornando-se um candidato atractivo para proteína modelo em estudos de estrutura/função. Nos últimos anos alguns estudos de estrutura de proteínas têm sido feitos sobre os estados desnaturados e não nativos de proteínas. O objectivo destes estudos é a investigação do desenrolamento de proteínas e das possíveis funções fisiológicas destes estados não nativos. As PAs são enzimas derivadas de zimogéneos, que normalmente desenrolam irreversivelmente e cujos estados parcialmente desnaturados são estabilizados. No entanto, ainda há pouca informação sobre os estados não nativos. A caracterização estrutural destas proteínas poderá esclarecer as propriedades funcionais das PAs, bem como a estrutura, o enrolamento e a actividade das proteínas em geral. Neste trabalho os efeitos do pH e do acetonitrilo foram estudados para obter informação acerca dos estados conformacionais da cardosina A. Os estados conformacionais induzidos pelo pH e pelo acetonitrilo mostraram ser diferentes. A desnaturação térmica da cardosina A mostrou tratar-se de uma proteína estável provavelmente devido às fortes interacções entre subunidades que vão enfraquecendo à medida que o valor de pH varia. A desnaturação da cardosina A mostrou ocorrer através do desenrolamento independente das suas cadeias polipeptídicas, onde a cadeia polipéptidica de baixo peso é menos estável do que a de alto peso. Adicionalmente, a desnaturação alcalina da cardosina A resulta na dissociação do heterodímero. Por outro lado, baixas concentrações de acetonitrilo induziram um aumento da actividade da cardosina A relacionada com ligeiro aumento da estrutura secundária. No geral, o acetonitrilo induz alterações de estrutura secundária e terciária na cardosina A inactivando-a a concentrações mais elevadas, mas baixas concentrações do solvente parecem resultar num efeito directo no local activo. Finalmente, as alterações dependentes do tempo em 10 % acetonitrilo mostraram que a cardosina A adopta uma conformação onde o desenrolamento da cadeia de baixo peso é notório. Neste estado a cardosina A apresenta uma actividade catalítica comparável à do estado nativo sugerindo uma elevada flexibilidade funcional e conformacional da enzima. Os resultados foram comparados com informação estrutural e funcional de outras PAs e as possíveis implicações da natureza heterodimérica da cardosina A discutidas. Aspartic proteinases (APs) are an important group of proteinases due to their involvement in pathological and physiological processes. Despite their function diversity they have N-terminal and C-terminal domains that show evidence of homology to each other. This structure appears to have arisen by ancient internal gene duplication and fusions. Among the most interesting members of aspartic proteinases is cardosin A from Cynara cardunculus sp, a recently well characterized heterodimeric enzyme. High yields of pure protein can be obtained making it an attractive model protein for structure/function studies. In the last years protein structural studies have been carried out on denatured and other non-native states of proteins. The aim of such studies is to investigate protein folding and to understand the physiological roles of nonnative structures. APs are zymogen-derived enzymes, which usually unfold irreversibly and become trapped in partially denatured states. There is still little information about the structures of these denatured states. Characterization of such states in APs should give insights not only into the functional properties of this very important family of enzymes, but also in protein folding and activity of proteins in general. In this work the effects of varying pH and acetonitrile concentrations on the structure and folding of cardosin A were investigated to obtain further insight of cardosin A conformational states. pH and acetonitrile induced conformational states in cardosin A revealed to be different. It is a stable protein probably due to strong intersubunit interactions that weaken as pH values varies. Furthermore, the unfolding of cardosin A occurs through independent unfolding of its polypeptide chains, where the small chain is less stable than the longer chain. The alkaline denaturation of cardosin A was shown to point to the heterodimer dissociation. At low acetonitrile concentrations cardosin A activity is increased and correlated with mild secondary structural changes. Overall, acetonitrile induce tertiary and secondary structure changes in cardosin A molecule, causing the complete inactivation at high acetonitrile concentrations and at low organic solvent content a direct effect in the active site was suggested. Finally, time dependent changes induced by 10 % acetonitrile were studied and showed that at some point cardosin A adopts a partial folded conformation with the unfolding of the small chain. This conformational state is characterized by catalytic activity comparable with the native cardosin A, pointing to high cardosin A functional conformational flexibility. Results were compared with available structure/function information of other APs and the possible physiological roles of the heterodimeric nature of cardosin A discussed.

Doutoramento em Bioquímica O estabelecimento de culturas celulares primárias constitui um aspecto relevante para o estudo da biologia celular e molecular. Várias linhas celulares humanas estão disponíveis contudo, muitas adquiriram alterações genéticas significativas, incluindo a delecção de importantes genes reguladores. Neste sentido, é importante a criação de novos métodos que permitam aceder ao natural comportamento celular. Para analisar as actividades celulares relacionadas com a expressão de proteínas extracelulares da matriz, determinantes no processo de ramificação das neurites, procedeu-se ao desenvolvimento de um novo protocolo para isolamento e estabelecimento de culturas neuronais embrionárias de rato utilizando cardosinas. As cardosinas são proteases aspárticas de plantas, extraídas dos pistilos de Cynara cardunculus L., tendo sido usadas neste trabalho como uma nova ferramenta para desagregação de tecidos. As cardosinas foram comparadas com a tripsina, em termos de efeito durante o processo de isolamento de neurónios corticais. Conjuntamente, os resultados morfológicos e funcionais sugerem uma potencial aplicação das cardosinas em técnicas de isolamento de diferentes tipos celulares. Os resultados apresentam vantagens claras, em termos da viabilidade celular, do rendimento, sugerindo a implementação das cardosinas para isolamento celular, em alternativa à tripsina. Os neurónios corticais resultantes atingiram rácios de expressão MMPs/TIMPs após 24 horas em cultura proporcionais ao desenvolvimento e proliferação das neurites. A célere recuperação celular do processo de isolamento está relacionada com uma especificidade mais restrita das cardosinas o que suporta a sua aplicação, não só para o estabelecimento de culturas primárias, mas também para os procedimentos de subcultivo. Esta recuperação mais rápida sugere que, durante a desagregação do tecido nervoso, as cardosinas seguem um mecanismo menos agressivo para os neurónios que a tripsina. Este aspecto pode ter particular interesse em procedimentos de autotransplante, uma vez que a manipulação das culturas celulares deve preservar a integridade celular, para uma consequente reabilitação mais rápida do paciente. The establishment of primary cell cultures is invaluable for studying cell and molecular biological questions. A variety of human cell lines exist, however, most have acquired significant genetic alterations from their cells of origin, including deletion of important regulatory genes. Therefore is important to create new methods to ascertain natural cell behaviour. In order to analyze cellular activities related to extracellular matrix protein expression, determinant for neurite pathfinding, a new protocol was established for isolating and culturing neuronal cells from embryonic rats by using cardosins. Cardosins are plant aspartic proteinases extracted from the pistils of Cynara cardunculus L. and were used in the present work as novel tool for tissue disaggregation. Cardosins were compared to trypsin effect in the isolation of cortical neurons. Both morphological and functional data suggest a potential application of cardosins in isolation techniques for different cellular types. The results demonstrate clear advantages, in terms of improved cell viability, increased yields, suggesting cardosins implementation as alternative to use trypsin for cell isolation. The resultant cortical neurons revealed to achieve MMPs/TIMPs expression ratio after the first 24 hours in culture matching with a superior neurite outgrowth and dendritic extension. This early cell recovery to isolation procedure is related to the narrow specificity of cardosins that support their application for establishment of primary cell culture and for subcultivation procedures. The increase on neuronal recover after cell plating suggesting that, during brain disaggregation, cardosins follow a mechanism that is less aggressive to neurons than trypsin. This could be particularly interesting for autotransplantation procedures, as cell culture manipulation would preserve cell integrity, leading to a faster patient rehabilitation. FCT FSE

Mestrado em Biotecnologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2005 O cardo, Cynara cardunculus L. cresce abundantemente em terrenos baldios e áreas não cultivadas, em muitas regiões de Portugal. Estas flores apresentam propriedades coagulantes, sendo por isso utilizado em fabricos tradicionais de vários tipos de queijo. O extracto aquoso das flores de Cynara cardunculus L. possui proteases aspárticas, denominadas por cardosinas. Estas proteases podem ser imobilizadas, com alguma perda da sua actividade catalítica. Estas proteases apresentam elevado valor económico, sendo a imobilização uma forma de aumentar a sua aplicabilidade à escala industrial, visto permitir a sua reutilização. Os extractos enzimáticos de cardo, na forma livre e imobilizada, foram caracterizados em termos de pH e de temperatura de reacção, assim como em termos de parâmetros cinéticos para diferentes substractos (caseína bovina comercial, K-caseína bovina comercial, caseína de cabra e K-caseína de cabra). Os extractos aquosos de cardo foram imobilizados em celite por adsorção. Verificou-se um pH óptimo de 5,4 e uma temperatura de reacção de 60 0C, para ambas as formas (livre e imobilizada). Os queijos fabricados a parir deste coagulante vegetal, apresentam distintas características bioquímicas, organolepticas e reológicas, tornando-os assim muito apreciados. Neste trabalho estudaram-se as características reológicas da coalhada a diferentes temperaturas de coagulação, adição de NaCl e de fermentos lácteos. Foi igualmente estudado o comportamento reológico da coalhada obtida a partir de extracto aquoso de cardo, imobilizado em celite. Em todos ensaios os desenvolvidos a coalhada apresentou sempre propriedades de fluido dilatante. Foram germinadas em condições de assepsia sementes de cardo, de modo a monitorizar o seu crescimento, determinando-se alguns parâmetros fisiológicos. Avaliou-se a forma como o teor de proteína total está associado ao crescimento, e a presença de prolina em situações de stresse durante o crescimento e a evolução da actividade proteolítica. Verificou-se que a actividade proteolítica se comporta de uma forma crescente ao longo do período de crescimento, em todas as secções da plântula. As flores de cardo secas foram ainda caracterizadas microbiologicamente, pela quantificação de microrganismos heterotroficos aeróbicos, coliformes totais, coliformes fecais, clostrídios sulfito-redutores, lipolíticos, bolores e leveduras. Neste estudo utilizaram-se duas amostras de origens diferentes, que foram sujeitas a diferentes tratamentos, para a redução da carga microbiana. Avaliou-se o efeito de exposição à radiação ultravioleta durante 12 horas, a microfiltração (0,22p.m) e a congelação (-20oC±2) sob as flores de cardo. Todos estes tratamentos provocaram uma diminuição do número de microrganismos contabilizados. Contudo o tratamento por microfiltração revelou-se como sendo o que melhor resultado apresentou, provocando a redução total da carga microbiana. É sugerido a sua utilização de outros métodos ao nível industrial, pois também provoca diminuição na contaminação e são de mais lácil aplicação. O extracto aquoso de cardo imobilizado em celite, pode ser utilizado à escala industrial, sem alteração das propriedades reológicas e organolepticas da coalhada. The cardoon, Cynara cardunculus L. is a variety of thistle, which grows wild and abundantly in uncultivated areas of many regions ofPortugal. In these regions, the dried flowers are used as a milk coagulant for the manufacture oftraditional cheese varieties. Aqueous extracts of dried flowers of Cynara cardunculus L. possess aspartic proteases, currently termed cardosins. Proteases can he immobilized with some loss of catalytic activity. Since proteases are often expensive, especially at high degrees of purity, immobilization may increase their industrial applicability. Free and immobilized crude extracts of cardoon were characterized in terms of determination of optimum temperature an pH values, determination of kinetic parameters towards at differents substracts (bovine casein, bovine K-casein, goat casein and goat K-casein). The aqueous extracts of cardoon were immobilized on celite by adsorption. Optimum pH was 5 .4 and optimum temperature was 60oC, both for free and immobilized extracts. Cheeses elaborated with vegetal rennet have distinct biochemical, sensory and rheological characteristics, wich make them very popular. In this work, the rheological characteristics of the curd were studied at different coagulation temperatures, addition NaCl and cultures of startes. The coagulation and rheologycal ofthe curd obtained with Cynara cardunculus L. extract immobilized on celite were also studied characteristcs. During milk clotting the fluid shows dilatant properties in ali cases studied. Seeds of cardon were germinated in sterile conditions, to characterize the growth, thought the monitorization some physiological parmeters. It was evaluated how concentration ofprotein is anciated to the growth and the development ofthe plant, and the presence of proline in stress conditions during growth. The proteolytic activity was studied, as well registed that increase with growth was observed in ali sections of the plant. Cardoon flowers were microbiologic caracterized, by quantification of the number of aerobic heterotrofic microrganisms, total coliforms, fecal coliforms, sulphite-redutors clostrídes, lipolitic microrganisms, mould and yeast. Two samples of cardoon with different source and conservation were subjected to different treatments, in order to reduce the microbiologic value. The effect of exposition to ultraviolet radiation during 12 hours, membrane microfiltration (0,22|,im) and the freezing (-20oC±2) of the dried cardoon flowers were evalueted. Those treatments induced a reduction ofthe number of tested microrganisms contents. However, the treatment using microfiltration showed a full eficiency. The use of the other ones is recommended for industrial a applications, because they also provide a decrease on contamination and are easier to apply. An efficient immobilized infusion of the cardoon, with controled contamination can be used in industry, without alteration of the rheological properties and flavour in cheese.