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The current research was designed to reach extracellular protease production potential in different strains of Sordaria fimicola which were previously obtained from Dr. Lamb (Imperial College, London) from North Facing Slope and South Facing Slope of Evolution Canyon. After initial and secondary screening, two hyper-producers strains S2 and N6 were selected for submerged fermentation and cultural conditions including temperature, pH, incubation period, inoculum size, substrate concentration, and different carbon and nitrogen sources were optimized for enzyme production. S2 strain showed maximum protease production of 3.291 U/mL after 14 days of incubation at 30 °C with 7 pH, 1% substrate concentration and 1 mL inoculum, While N6 strain showed maximum protease production of 1.929 U/mL under fermentation optimized conditions. Another aim of the present research was to underpin the biodiversity of genetics and post-translational modifications (PTMs) of protease DPAP (peptidyl-aminopeptidase) in Sordaria fimicola. Five polymorphic sites were observed in amino acid sequence of S. fimicola strains with reference to Neurospora crassa. PTMs prediction from bioinformatics tools predicted 38 phosphorylation sites on serine residues for protease peptidyl-aminopeptidase in S1 strain of S. fimicola while 45 phosphorylation sites on serine in N7 strain and 47 serine phosphorylation modifications were predicted in N. crassa. Current research gave an insight that change in genetic makeup effected PTMs which ultimately affected the production of protease enzyme in different strains of same organism (S. fimicola). The production and molecular data of the research revealed that environmental stress has strong effects on the specific genes through mutations which may cause genetic diversity. S. fimicola is non- pathogenic fungus and has a short life cycle. This fungus can be chosen to produce protease enzyme on a commercial scale. Resumo A pesquisa atual foi projetada para alcançar o potencial de produção de protease extracelular em diferentes cepas de Sordaria fimicola que foram previamente obtidas do Dr. Lamb (Imperial College, Londres) de North Facing Slope e South Facing Slope de Evolution Canyon. Após a triagem inicial e secundária, duas cepas hiperprodutoras S2 e N6 foram selecionadas para fermentação submersa e condições culturais, incluindo temperatura, pH, período de incubação, tamanho do inóculo, concentração de substrato, e diferentes fontes de carbono e nitrogênio foram otimizadas para produção de enzima. A cepa S2 apresentou produção máxima de protease de 3,291 U/mL após 14 dias de incubação a 30 °C com pH 7, concentração de substrato de 1% e inóculo de 1 mL, enquanto a cepa N6 apresentou produção máxima de protease de 1,929 U/mL em condições otimizadas de fermentação. Outro objetivo da presente pesquisa foi sustentar a biodiversidade da genética e modificações pós-tradicionais (PTMs) da protease DPAP (peptidil-aminopeptidase) em Sordaria fimicola. Cinco sítios polimórficos foram observados na sequência de aminoácidos de cepas de S. fimicola com referência a Neurospora crassa. A previsão de PTMs a partir de ferramentas de bioinformática previu 38 locais de fosforilação em resíduos de serina para protease peptidil-aminopeptidase na cepa S1 de S. fimicola, enquanto 45 locais de fosforilação em serina na cepa N7 e 47 modificações de fosforilação de serina foram previstas em N. crassa. A pesquisa atual deu uma ideia de que a mudança na composição genética afetou os PTMs que, em última análise, afetaram a produção da enzima protease em diferentes cepas do mesmo organismo (S. fimicola). A produção e os dados moleculares da pesquisa revelaram que o estresse ambiental tem fortes efeitos sobre genes específicos por meio de mutações que podem causar diversidade genética. S. fimicola é um fungo não patogênico e tem um ciclo de vida curto. Esse fungo pode ser escolhido para produzir enzima protease em escala comercial.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-04-20T13:57:02Z No. of bitstreams: 1 Patyanne Carvalho Correia.pdf: 1733331 bytes, checksum: 0fd1c13c3c6c63ed674e16d388765579 (MD5) Made available in DSpace on 2018-04-20T13:57:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patyanne Carvalho Correia.pdf: 1733331 bytes, checksum: 0fd1c13c3c6c63ed674e16d388765579 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES This study aimed to evaluate the production, purification characterization of proteases produced by filamentous fungi isolated from Caatinga. 32 strains of filamentous fungi were previously selected from the best protease producer and the best culture conditions for the microorganisms were determined in shake flasks using a factorial design 23, the influence of the independent variables were evaluated: glucose and soy concentrations, and pH on proteinase activity. Based on the obtained results from the fermentation in shake flasks, a a factorial design 22 was performed in a bioreactor type stirred tank of 1.5L to verify the influence of the independent variables: agitation and aeration in the protease production. The resulting metabolic liquid from the fermentation was used in the following purification steps using aqueous two phases system (ATPS) and chromatographic methods. Another protease with fibrinolytic activity was studied and proprieties analyzed effect on coagulation, stability with solvents and the structure on different pH and fibrinogenolytic activity.The maximum protease production (69.77 U/ml) for shake flasks was obtained under the following conditions: 6.0 of pH, glucose 0.5% and soy 3%. On stirred-tank bioreactor maximum protease activity it was obtained 61.19 U/mL after 72 h of cultivation, under conditions of agitation and aeration at 450 rpm and 0.5 vvm. The protease characterization revealed that the optimum temperature of the enzyme was 50 °C and the activity was 75% when incubated for 3 hours at 20, 30 and 40 °C. The enzyme activity was slightly inhibited by metal ions (ZnSO4 and CuSO4) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), indicate be a serine protease. The enzyme was parcial purified by 24% (w/w) PEG 400 and 20% (w/w) citrate system, at pH 6 the proteases preferably partitioned to the top phase, resulting in 146% recovery and a 1.6-fold increase in specific activity. The ATPS combined with varied chromatography methods reached 8 fold purified and a 12.5% recovery. The fibrinolytic protease on coagulation time was analyzed, a prolonged effect over time was observed in the activated partial thromboplastin time (APTT), indicating an inhibition of intrinsic pathway coagulation and the prothrombin time (PT) was less sensitive to time variation, even at high enzymatic concentration. The fibrinolytic protease was more stable in the presence of ethyl acetate solvents and less stable in the presence of ethanol. When fibrinogenolytic activity was evaluated, a preferential action of the fibrinolytic protease on the Aα and Bβ chains occurred. The fibrinolytic protease presented a structural disorder at pH scales with higher acidity and alkalinity. The two fungal enzymes studied present potential for application in the biotechnology industry. O presente estudo objetivou avaliar a produção, purificação e caracterização de proteases produzidas por fungos filamentosos isolados da Caatinga. Foram previamente utilizados 32, sendo selecionada a linhagem com maior produção de proteases em condições de cultivo em frascos agitados utilizando planejamento fatorial 23, foi avaliado influência das variáveis independentes: concentração de glicose, concentração de soja e pH. Com base nos resultados obtidos na fermentação em frascos agitados foi realizado em biorreator tipo tanque agitado de 1,5L, avaliando a influência das variáveis independentes: velocidade de agitação e aeração na produção da protease. O líquido metabólico resultante das fermentações foi utilizado nas etapas de purificação utilizando o sistema de duas fases aquosas (SDFA), métodos cromatográficos por troca iônica e gel filtração. Uma segunda protease com atividade fibrinolítica. foi utilizada e foram analisadas as propriedades em termos de coagulação, estabilidade da enzima na presença de solventes orgânicos e estrutural em diferentes pH, e atividade fibrinogenolíta. Em frascos agitados a produção máxima de protease (69,77 U/mL) foi obtida pH 6,0, 0,5% de glicose e 3% de soja, enquanto em biorreator nas condições de agitação e aeração iguais à 450 rpm e 0,5 vvm, a atividade máxima de protease foi de 61,19 U/mL após 72h de cultivo. A protease revelou uma temperatura ótima de 50°C e valores de atividade cerca de 75% quando incubada por 3h a 20, 30 e 40°C, respectivamente. A atividade enzimática foi fracamente inibida pelos íons metálicos ZnSO4 e CuSO4 e por fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), sugerindo ser uma serino protease. A protease foi parcialmente purificada a partir do sistema 24% (m/m) polietilenoglicol (PEG) 400 e 20% (m/m) citrato em pH 6, o que assegurou um fator de purificação de 1.6 e 146% de recuperação, na fase rica em (PEG). Associado o sistema a cromatografia por troca iônica e gel filtração foi possível alcançar uma purificação de 8 e rendimento de 12,5%. Quando analisado o efeito da protease fibrinolítica sobre o tempo de coagulação, observou-se no tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) um efeito prolongado com o passar do tempo, sugerindo uma inibição da via intrínseca.Com relação ao tempo de protrombina (TP), esse foi menos sensível a variação do tempo, mesmo em concentração enzimática elevada. A protease fibrinolítica apresentou-se mais estável na presença do solvente acetato de etila e menos estável na presença de etanol. Quando foi avaliada a atividade fibrinogenolítica ocorreu uma ação preferencial da protease fibrinolítica sobre as cadeias Aα e Bβ. A protease fibrinolítica apresentou uma desordem estrutural a valors extremos de pH. As duas enzimas fúngicas estudadas apresentam potencial para aplicação na indústria biotecnológica.