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There is an urgent need to identify reliable genetic biomarkers for accurate diagnosis, prognosis, and treatment of different tumor types. Described as a prognostic marker for many tumors is the neuronal protein carnitine palmitoyltransferase 1 C (CPT1C). Several studies report that CPT1C is involved in cancer cell adaptation to nutrient depletion and hypoxia. However, the molecular role played by CPT1C in cancer cells is controversial. Most published studies assume that, like canonical CPT1 isoforms, CPT1C is a mediator of fatty acid transport to mitochondria for beta-oxidation, despite the fact that CPT1C has inefficient catalytic activity and is located in the endoplasmic reticulum. In this review, we collate existing evidence on CPT1C in neurons, showing that CPT1C is a sensor of nutrients that interacts with and regulates other proteins involved in lipid metabolism and transport, lysosome motility, and the secretory pathway. We argue, therefore, that CPT1C expression in cancer cells is not a direct regulator of fat burn, but rather is a regulator of lipid metabolic reprograming and cell adaptation to environmental stressors. We also review the clinical relevance of CPT1C as a prognostic indicator and its contribution to tumor growth, cancer invasiveness, and cell senescence. This new and integrated vision of CPT1C function can help better understand the metabolic plasticity of cancer cells and improve the design of therapeutic strategies.

Resumen: Klotho es una proteína transmembrana de un solo paso que consta de 1012 aminoácidos y se expresa fuerte y débilmente en células epiteliales renales tubulares distales y proximales, respectivamente. Existen cuatro grupos de proteínas Klotho. El gen αKlotho se expresa abundantemente en riñones, glándulas paratiroides, plexo coroideo, así como en la corteza cerebral, la médula espinal, el cerebelo, el hipotálamo, la hipófisis, las glándulas paratiroides, el ovario, los testículos, las células epiteliales del seno, la placenta, el páncreas, el oído interno, el endotelio vascular del músculo liso y el intestino. Klotho exhibe múltiples funciones, además de la excreción de fosfato, incluida la mejora del estrés oxidativo y la inhibición de vías de señalización del factor de crecimiento de insulina, Wnt/β-catenina, la transformación del factor de crecimiento-β1 y el objetivo mecanicista de la señalización de rapamicina, de modo que se obtiene un importante papel dentro de un sinnúmero de eventos patológicos como, por ejemplo, el que causó la reciente pandemia generada por el COVID-19. Tanto nuevos trabajos como anteriores en humanos y ratones (p. ej., el impacto de Klotho en cuadros de lesión pulmonar aguda) proporcionan una fuerte justificación para examinar más a fondo el papel del Klotho en la salud y el envejecimiento. Abstract: Klotho is a single-pass transmembrane protein consisting of 1012 amino adds and it is strongly and weakly expressed in distal and proximal renal tubular epithelial cells, respectively. There are four groups of Klotho proteins. The αKlotho gene is abundantly expressed in kidneys, parathyroid glands, choroid plexus, as well as in the cerebral cortex, spinal cord, cerebellum, hypothalamus, pituitary gland, parathyroid glands, ovary, testis, breast epithelial cells, placenta, pancreas, inner ear, smooth muscle vascular endothelium, and intestine. Klotho exhibits multiple functions in addition to phosphate excretion, including enhancement of oxidative stress and inhibition of insulin growth factor signaling pathways, Wnt/β-catenin, transforming growth factor-β1 and mechanistic target of rapamycin, thus eliciting an important role within a myriad of pathological events such as, for example, the one caused by the recent COVID-19 pandemic. Both new and previous work in humans and mice (e.g., the impact of Klotho on acute lung injury) provide a strong rationale to further examine the role of Klotho in health and aging. Resumo: Klotho é uma proteína transmembrana de urna etapa que consiste em 1012 aminoácidos e é forte e fracamente expressa em células epiteliais renais tubulares distais e proximais, respectivamente. Existem quatro grupos de proteínas Klotho. O gene αKlotho é abundantemente expresso em rins, glándulas paratireóides, plexo coróide, bem como no córtex cerebral, medula espinhal, cerebelo, hipotálamo, glândulas pituitárias, ovário, testículos, células epiteliais do seio, placenta, páncreas, ouvido interno, endotélio vascular do músculo liso e intestinal. Klotho apresenta múltiplas funções, além da excreção de fosfato, incluindo a melhora do estresse oxidativo e inibição das vias de sinalização do fator de crescimento insulínico, WNT/β-catenina, transformação do fator de crescimento-β1 e o objetivo mecanicista da sinalização da rapamicina, de modo que um papel importante dentro de inúmeros eventos patológicos, como o que causou a recente pandemia gerada pela COVID-19. Estudos novos e anteriores em humanos e camundongos (por exemplo, o impacto do Klotho na lesão pulmonar aguda) fornecem urna forte justificativa para examinar melhor o papel do Klotho na saúde e no envelhecimento.

Orientador: Tomomasa Yano Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Estudos preliminares sobre adesão e invasão mostraram que 100% de 49 amostras de Escherichia coli associada à sepse humana (SEPEC) foram capazes de aderir e invadir células Vero (Rim de macaco verde africano) e Huvec (Veia umbilical humana). Em análise genotípica, foi observada uma alta prevalência dos genes fimH (98,0%) que codificam para a adesina da fimbria de tipo 1 (F1). No entanto, as cepas analisadas aderiram tanto na presença quanto na ausência de ?-D-manopiranosideo, um inibidor da adesão mediada pela F1. Por esse motivo foram analisadas as proteínas de membrana externa de SEPEC, com o objetivo de se avaliar potenciais fatores adesão e invasão dessas cepas. Por técnicas de proteômica, foram identificadas três proteínas de SEPEC com afinidade a glicoproteínas celulares: OmpA (Proteína de membrana A); FimA (Subunidade maior da fimbria do tipo 1) e YdeR (Subunidade menor da fimbria do tipo 9 - F9). Esses dados foram coerentes com a análise genotípica das amostras SEPEC, pois foi observada uma alta porcentagem dos genes que codificam para as três proteínas descritas anteriormente, sendo que 100% das amostras foram ompA+, 98,0% foram fimA+ e 100% foram ydeR+. Os ensaios de adesão e invasão de SEPEC (OmpA+/ F1+) em células Vero e Huvec mostraram que ?-D-manopiranosideo e GlcNAc, quando atuando juntos, agem como potentes inibidores da adesão e invasão, sugerindo que essas moléculas poderiam estar ocupando os sítios de ligação a carboidratos das duas adesinas F1 e/ou OmpA, respectivamente. Para confirmar essa hipótese, mutantes nulos para ?fimA (OmpA+/ F1-) e ?ompA (OmpA-/F1+) foram construídos, e os resultados de adesão e invasão bacteriana foram similares aos obtidos na presença dos inibidores: ?-D-manopiranosideo e GlcNAc. Mutante nulo para a proteína YdeR da fimbria F9 (OmpA+/ F1+), mostrou significativa redução da adesão e invasão bacteriana em células Vero e Huvec (p ? 0,05) somente na presença dos inibidores da adesão mediada por F1 e OmpA: ?-D-manopiranosideo e GlcNAc, respectivamente. Esses dados sugerem que F9 também contribui para a adesão e invasão de SEPEC. Juntos, nossos dados demonstram que os processos de adesão e invasão de SEPEC são dependentes de OmpA, F1 e F9, as quais podem ser complementares, e devem atuar sinergicamente para a adesão e invasão de SEPEC Abstract: Our preliminary studies about bacterial adhesion and invasion showed 100% of 49 strains of human sepsis-associated Escherichia coli (SEPEC) were able to adhere and invade Vero (African green monkey kidney) and HUVEC (human umbilical vein) cells. In genotypic analysis, high prevalence of fimH (98.0%), gene encoding for the type 1 fimbrial adhesin was observed. However, all the strains analyzed were able to adhere and invade these cellular lineages both in the presence and absence of the type 1 fimbriae adherence-inhibitor ?-D-mannopiranoside. Consequently, the outer membrane proteins of SEPEC were analyzed in order to find potential adhesion and invasion factors expressed by these strains. Through proteomic techniques, three proteins with affinity to cellular glycoproteins were identified: OmpA (Membrane Protein A); FimA (major subunit of type 1 fimbriae - F1) and YdeR (minor subunit of type 9 fimbriae - F9). These data were consistent with the genotypic analysis of SEPEC strains because a high percentage of the genes encoding these three proteins was observed, being that ompA+ (100%) fimA+ (98%) and ydeR+ (100%). Assays of adhesion and invasion of SEPEC (OmpA+ / F1+) in Vero and HUVEC cells showed that ?-D-manopiranosideo and GlcNAc, when acting together, act as potent inhibitors of adhesion and invasion, suggesting that these molecules could be occupying sites of carbohydrate-binding displayed by adhesins from both F1 and/or OmpA, respectively. To confirm this hypothesis, null mutants ?fimA (OmpA+/F1-) and ?ompA (OmpA-/F1+) were constructed, and the phenotypic results of bacterial adhesion and invasion were similar to those obtained in the presence of inhibitors ?-D-mannopiranoside and GlcNAc. The mutant ?ydeR (OmpA+ / F1+), null mutant for YdeR protein of F9 fimbriae, showed a significant reduction in bacterial adhesion and invasion in Vero and HUVEC (p ? 0.05) just in the presence of inhibitors of cell adhesion mediated by F1 and OmpA. These data suggest that F9 also can contribute to the adhesion and invasion of SEPEC in Vero and HUVEC cells. Hold together, our data demonstrated that adhesion and invasion of SEPEC are OmpA, F1 and F9 dependents, which can be complementary and express synergistic activity leading to enhancing the ability of adhesion and invasion in SEPEC strains Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

ilustraciones, fotografías, gráficas El parásito intracelular Leishmania compite con sus hospederos para la adquisición de compuestos esenciales y, por lo tanto, debe desarrollar mecanismos eficientes de captación. Este proceso es mediado por proteínas transportadoras que desempeñan un papel fundamental en la homeostasis celular, no solo permiten que el parásito compita de manera eficiente con los tejidos, si no también que estos compuestos sean distribuidos de manera competente al interior celular. Múltiples familias de proteínas tienen la capacidad de movilizar moléculas de relevancia metabólica para este tipo organismos, en particular, el trasporte del dinucleótido de nicotinamida y adenina, NAD+ una molécula que desempeña un rol clave en funciones esenciales ha sido descrito principalmente por las proteínas SLC25A, una familia de transportadores mitocondriales (MCF) presente únicamente en eucariotas. En respuesta a la creciente tasa de desarrollo de resistencia a los medicamentos, así como los numerosos efectos secundarios de los mismos para el control de organismos de gran importancia en la salud pública de nuestro país como lo es Leishmania; caracterizar las proteínas responsables de esta translocación, con base en homologías, ya sea de secuencia o estructura con sus ortólogos, promete proporcionar información sobre muchos aspectos básicos de su biología, determinantes para el desarrollo de nuevas terapias en el tratamiento de estas parasitemias. En este trabajo se estudiaron en Leishmania braziliensis, dos candidatos a transportador de NAD+; esto mediante el uso de herramientas bioinformáticas, donde se encontró que las proteínas denominadas LbNDT2 y LbNDT3, poseen todas las características estructurales y de secuencia propias de la familia de transportadores mitocondriales (MCF). Presentando potenciales sitios de modificación postraduccional mediante fosforilación, acetilación y glicosilación. De igual manera, al compararlas con los ortólogos descritos en otros organismos, se evidencia que estas proteínas son altamente conservadas a nivel estructural. Por otro lado, de manera experimental, con el fin de evaluar su capacidad transportadora fueron desarrollados tres acercamientos de manera paralela; el primero involucró el uso del sistema heterólogo algal Chlamydomonas reinhardtii; permitiendo insertar el candidato LbNDT2 en una membrana eucariota; el segundo, mediante la manipulación del vector bacteriano pETx28Mistic, se logró la inserción de las proteínas de interés, en la membrana plasmática de un sistema procariota, realizando una aproximación a su estudio in vivo; y finalmente, ensayos de complementación llevados a cabo en la levadura Saccharomyces cerevisiae, donde fue reestablecido el retraso en el crecimiento de los mutantes, con la inserción de los genes de interés, corroborando de manera indirecta la actividad de las proteínas. Asimismo, utilizando la tecnología del ADN recombinante y el sistema de expresión heterólogo Escherichia coli se obtuvo el antígeno necesario para la producción de una herramienta inmunológica desarrollada en el modelo aviar, que permitió su estudio in situ, encontrando que estas proteínas se ubican a nivel mitocondrial en el estadio de promastigote. En general, corroborar la función de este tipo de proteínas representa un reto; sin embargo, gracias a estos acercamientos se puede concluir que la LbNDT2 y LbNDT3, desempeñan un papel importante para el metabolismo energético en este parásito intracelular. De manera adicional, se estudió mediante la clonación, expresión y purificación, la Triparredoxina peroxidasa citosólica de L. braziliensis (LbTXNPxII) a partir del sistema heterólogo E. coli; permitiendo generar una herramienta inmunológica en modelo aviar, para el estudio in situ de esta proteína y la determinación de posibles interacciones moleculares en el parásito, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación. (Texto tomado de la fuente). The intracellular parasite Leishmania competes with its hosts for the acquisition of essential compounds and, therefore, must develop efficient uptake mechanisms. This process is mediated by transporter proteins that play a fundamental role in cellular homeostasis, not only allowing the parasite to compete efficiently with the tissues, but also for these compounds to be distributed competently within the cell. Multiple families of proteins can mobilize molecules of metabolic relevance for this type of organisms the transport of the nicotinamide and adenine dinucleotide, NAD+ a molecule that plays a key role in essential functions has been described mainly by the SLC25A proteins, a family of mitochondrial transporters (MCF) present only in eukaryotes. In response to the increasing rate of development of resistance to drugs, as well as the numerous side effects of the same for the control of organisms of great importance in the public health of our country such as Leishmania; characterizing the proteins responsible for this translocation, based on homologies, either in sequence or structure with their orthologs, promises to provide information on many basic aspects of their biology, determining factors for the development of new therapies in the treatment of these parasitemias. In this work, two candidates for the NAD + transporter were studied in Leishmania braziliensis; this using bioinformatic tools, where it was found that the proteins called LbNDT2 and LbNDT3, possess all the structural and sequence characteristics of the family of mitochondrial transporters (MCF). Presenting potential post-translational modification sites by phosphorylation, acetylation, and glycosylation. Similarly, when comparing them with the orthologs described in other organisms, it is evident that these proteins are highly conserved at the structural level. On the other hand, in an experimental way, in order to evaluate its transport capacity, three approaches were developed in parallel; the first involved the use of the heterologous algal system Chlamydomonas reinhardtii; allowing the candidate LbNDT2 to be inserted into a eukaryotic membrane; the second, by manipulating the bacterial vector pETx28Mistic, the proteins of interest were inserted into the plasma membrane of the prokaryotic system, making an approach to their in vivo study; and finally, complementation tests carried out in the yeast Saccharomyces cerevisiae, where the growth retardation of the mutants was reestablished, with the insertion of the genes of interest, indirectly corroborating the activity of the proteins. Likewise, using recombinant DNA technology and the Escherichia coli heterologous expression system, the necessary antigen was obtained to produce an immunological tool developed in the avian model, which allowed the candidates to be studied in situ, finding that these proteins were located at the mitochondrial level in the promastigote stage. In general, corroborating the function of this type of protein represents a challenge; however, thanks to these approaches it can be concluded that LbNDT2 and LbNDT3 play an important role for energy metabolism in this intracellular parasite. Additionally, the cytosolic Triparredoxin peroxidase of L. braziliensis (LbTXNPxII) from the heterologous E. coli system was studied by means of cloning, expression, and purification, allowing the generation of an immunological tool in an avian model, for the in-situ study of this protein and the determination of possible molecular interactions in the parasite, through co-immunoprecipitation assays. Dirección académica con la Beca Asistente Docente durante los periodos 2018-II y 2019-I. Beca-Pasantía Jóvenes investigadores de Colciencias convocatoria 812, por el apoyo durante los periodos 2019-II y 2020-I. DIB por la financiación de proyecto titulado “Explorando el metabolismo del NAD de parásitos protozoos: En busca de blancos terapéuticos promisorios para el tratamiento de enfermedades infecciosas de alta incidencia en la salud pública”, código 42176. Universidad Nacional de Colombia, convocatoria "UN INNOVA" por la financiación del proyecto titulado “Desarrollo del modelo biológico, Chlamydomonas reinhardtii como sistema promisorio para la expresión de proteínas recombinantes y la implementación de ensayos de citotoxicidad.”, código 49183. Incluye anexos Maestría Magíster en Ciencias - Bioquímica Metabolismo energético de parásitos protozoarios

Orientador: Eneida de Paula Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A mitocôndria é uma organela vital, pois em células aeróbicas, ela é responsável pela produção da maior parte da energia química necessária para a célula. A síntese de ATP ocorre por fosforilação oxidativa na Fo,F1-ATPase, usando a energia gerada pela cadeia de transporte de elétr ons, uma série de enzimas presentes na membrana mitocondrial interna. A análise de proteínas de membrana pode ser feita pela técnica de eletroforese, tanto em condições nativas quanto desnaturantes. Neste trabalho analisamos a solubilização de proteínas da membrana interna de mitocôndria de músculo de rato, através do uso de surfatantes zwiteriônicos (ASB-14, ASB-16, CHAPS), não-iônicos (Digitonina, C12E8, Triton X- 100) e aniônico (Colato de sódio) na separação por eletroforese em gel nativo e bidimensional. Desenvolvemos um novo protocolo para preparo de eletroforese em gel nativo, mantendo o tampão de amostra descrito no procedimento de BN-PAGE e adaptando as demais etapas da técnica de acordo com o protocolo de Laemmli et al (1970). Os géis assim preparados em temperatura ambiente mostraram melhor resolução que os pelo método BN-PAGE, foram obtidos menor tempo de corrida (1- 2 horas), sem troca de tampões e com emprego de reagentes de menor custo. Quanto a eficiência dos diferentes surfatantes, usados em uma mesma concentração (43,2 mM), o zwiteriônico ASB-16 foi o melhor solubilizador das proteínas de MMI, tanto em relação a quantidade total de proteína solubilizada como em relação a número de ¿spots¿ visualizados na eletroforese bidimensional, seguido pelo não-iônico Triton X-100. O surfatante não-iônico dodecil maltosídeo foi usado na preparações dos géis 2D em concentrações menores inferiores (20%) do que as indicadas na literatura (10% ou 195,8 mM), sem prejuízo da eficiência de solubilização protéica. Os resultados obtidos com géis nativos mostraram que todos os surfatantes estudados podem ser usados para separar os complexos protéicos da MMI, mas apresentam seletividade específica pelos complexos da Cadeia Respiratória, devendo esse parâmetro ser melhor estudado futuramente, para a determinação de protocolos específicos para isolamento dos diferentes tipos de complexos Abstract: The majority of the chemical energy produced inside aerobic cells is a result of the oxidative phosphorylation of ATP, inside the mitochondria. A great part of mitochondria proteins are organized into complexes located in the inner mitochondria membrane. Isolation and identification of those proteins have been conducted by electrophoresis, both in native as in denaturant condition. In this work we analysed solubilization of the inner mitochondrial membrane proteins of rat¿s gastrocnemius muscles, through the use of zwitterionic (ASB-14, ASB-16, CHAPS), non-ionic (Digitonin, C12E8, Triton X-100) and anionic (sodium cholate), by native and two-dimensional electrophoresis. We have developed a new protocol for the native gel electrophoresis, using the buffer sample described in BN-PAGE but changing other steps of the technique according to the protocol of Laemmli et al (1970). With this novel protocol, the gels prepared at ambient temperature had a better resolution than the classic BNPAGE technique; with low costs and short-time runs (1-2 hours). As for the effectiveness of surfactants studied to solubilize inner mitochondrial membrane proteins, when used at the same concentration (43.2 mM), the zwitterionic ASB-16 was the best, both accordingly to the total amount of solubilized protein, as for the number of "spots" detected in the two-dimensional electrophoresis, followed by non-ionic Triton X-100. The non-ionic surfactant dodecyl maltoside was used in the 2D electophoresys preparation at lower concentrations (20%) than that recommended in the literature (10% or 195.8 mM) without prejudice in the efficiency of protein solubilization. The results with native gels proved that all the studied surfactants can be used to separate the proteins of MMI, but with different selectivity for each enzymatic complex. This specificity should be better studied in the future, looking for the determination of specific protocols for better isolation of each types of MMI complex Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 La endocitosis es un proceso crucial para todas las células ya que les permite incorporar material desde el espacio extracelular y controlar la disponibilidad de proteínas transmembrana en la membrana plasmática (MP). Después de ser internalizadas por endocitosis las proteínas cargo se transportan a los endosomas y luego a los lisosomas/vacuolas donde son degradadas o pueden ser recicladas de nuevo a la MP siguiendo la vía de transporte retrógrado desde los endosomas al aparato de Golgi, donde son incorporadas nuevamente a la vía secretora. En la levadura, la endocitosis seguida de reciclado a la MP resulta en una distribución polarizada de las proteínas , que se concentran en la membrana de la célula hija. De acuerdo al modelo canónico, la selección de proteínas transmembrana para ser internalizadas por endocitosis mediada por vesículas cubiertas de clatrina involucra la presencia de señales en los dominios citoplásmicos de las proteínas cargo. Estas señales son reconocidas por distintos receptores o adaptadores que forman parte de la cubierta proteica y es mediante esta interacción que las proteínas cargo transmembrana son concentradas en los sitios de la MP donde inicia la endocitosis. En este trabajo de tesis hemos estudiado la influencia de la geometría del dominio transmembrana (TMD) en la endocitosis de proteínas con solo un paso transmembrana. Utilizando TMDs quiméricos mostramos que la geometría del TMD actúa como un determinante de transporte a nivel de la MP. Particularmente, demostramos que un TMD largo con una mitad exoplásmica conformada por aminoácidos voluminosos resulta en una señal de polaridad y endocitosis en Saccharomyces cerevisiae. Una búsqueda bioinformática en el proteoma de este organismo modelo identificó varias proteínas con un hemi- MD exoplásmico largo y voluminoso, lo que nos permitió validar nuestros resultados utilizando TMDs endógenos de levadura. Por otro lado, también demostramos que un hemi- TMD exoplásmico largo y voluminoso es funcional como señal de endocitosis en células de mamífero en cultivo. Además, realizamos diferentes análisis para comprender cómo proteínas con un hemi-TMD exoplásmico largo y voluminoso resultan endocitadas. Encontramos que la internalización de las mismas es afectada de forma indirecta por la ubiquitin ligasa Rsp5. Por otro lado, mostramos que la geometría de los TMD s determina la partición de los mismos a diferentes dominios lipídicos in vivo. La identificación de este novedoso determinante de endocitosis dado por la geometría del TMD muestra una nueva forma mediante la cual las proteínas cargo pueden ser reconocidas e incluidas en la vía endocítica. Esta forma se basa en un principio fundamental diferente de las señales endocíticas previamente conocidas y, por lo tanto, agrega nuevas perspectivas sobre el mecanismo de endocitosis. 2023-06-01 Bigliani, Gonzalo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Ambroggio, Ernesto Esteban. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Aguilar, Pablo S. Universidad de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 Giardia lamblia es un parásito protozoario que coloniza el epitelio intestinal de humanos y otros vertebrados. Las infecciones varían de agudas a crónicas, dependiendo de la susceptibilidad del hospedador y la cepa del parásito. En este trabajo de tesis, mostramos que los subtipos genéticos (ensamblajes) A y B de Giardia lamblia que infectan humanos poseen la capacidad de formar y liberar al medio extracelular vesículas de diferentes tamaños. Además, hemos realizado el primer análisis proteómico de las vesículas extracelulares de ambos ensamblajes y encontramos que, tanto las vesículas de tipo microvesículas como las de tipo exosomas, podrían estar seleccionando el contenido de proteínas conservadas y específicas de G. lamblia. Por otra parte, realizamos una combinación de metodologías que nos permitieron demostrar que G. lamblia secreta al medio extracelular vesículas que son notablemente similares a exosomas de otros tipos celulares en términos de tamaño, forma, densidad y presencia de proteínas típicas. Los resultados obtenidos también mostraron que, a pesar de la falta de cuerpos multivesiculares típicos presentes en el parásito, se pueden formar vesículas de tipo exosomas (tExo) en las vacuolas periféricas (PVs) endo-lisosomales de G. lamblia. Además, análisis ultraestructurales y determinación de la cantidad de tExo liberados mostraron que la actividad ATPasa de la proteína ESCRT Vps4a de G. lamblia y la presencia de la pequeña GTPasa Rab11, son esenciales para la formación de vesículas intraluminares en la PVs y, en consecuencia, para la obtención de tExo en el medio extracelular. También, observamos que la alteración en la función de GlVps4a genera una acumulación inusual de material electrodenso en las PVs, lo que indica que GlVps4p podría estar implicada en el mantenimiento del contenido de estas vacuolas. Los resultados observados, en su conjunto, sugieren que este parásito es capaz de producir diferentes tipos de vesículas extracelulares mediante mecanismos conservados, aunque con características únicas. 2023-06-30 Moyano, Sofía. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Cumino, Andrea Carina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biología; Argentina.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 (P. freudenreichii selvagem, WT) é uma bactéria Gram-positiva usanda na maturação de queijo, que atualmente teve seu potencial probiótico investigado. Em estudos anteriores o consumo dessa bactéria provou exercer efeitos imunomoduladores em modelo murino de colite induzida por agente químico. Parte dos efeitos imunomodulatórios dessa linhagem depende das proteínas da camada S (Slp) à quais podem estar envolvidas na persistência no intestino, adesão às células e muco do hospedeiro ou imunomodulação. Precisamente, a inativação do gene para a proteina SlpB na linhagem P. freudenreichii WT ressultou na linhagem mutante ΔslpB que teve sua capacidade de adesão às células epiteliais in vitro reduzida, em comparação a linhagem parental. Contudo, o efeito imunomodulador da proteína SlpB da linhagem P. Freudenreichii WT não está claro. Dessa forma, fica evidente elucidar o papel anti-inflamatório dessa proteína in vitro e in vivo. Em um ensaio in vitro, a linhagem selvagem de P. freudenreichii reduziu a expressão de citocinas IL-8 (p

Orientador: Andre Luis Berteli Ambrosio Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. Resumo: O piruvato é considerado o ponto central do metabolismo celular, chave para a geração de energia e blocos biossintéticos. Quando a oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico é necessária, o piruvato citosólico deve ganhar acesso à matriz mitocondrial em um processo que se acredita envolver ativamente duas subunidades carreadoras de piruvato mitocondrial (MPC) organizadas em hetero-oligômeros. Desde 2012, quando as identidades moleculares de mamíferos MPC1 e MPC2 (e MPC3 em leveduras) foram finalmente apresentadas, vários estudos in vitro e in vivo revelaram uma interação inesperada entre duas ou mesmo três subunidades de proteínas que definem diferentes conjuntos funcionais, em um contexto metabólicos específicos; estes têm implicações claras na fisiologia da homeostase e em algumas doenças. No entanto, o mecanismo funcional baseado em estrutura de MPC permanece indefinido, apesar dos intensos esforços empregando ferramentas computacionais e técnicas experimentais de última geração. Nesta tese, a produção recombinante de MPC humano, através de uma estratégia de co-expressão, é incialmente descrita; no entanto, não foi observada formação substancial de complexos e, predominantemente, subunidades individuais foram purificadas. Em contraste com MPC1, que co-purifica com uma chaperona de levedura, demonstramos que os homo-oligômeros MPC2 promovem o transporte eficiente do piruvato em proteolipossomos. Os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas do MPC2 assemelham-se aos demonstrados anteriormente para o MPC na literatura. De maneira distinta, a inibição química do transporte é observada apenas para um derivado de tiazolidinediona. O papel de transporte autônomo para MPC2 é validado em células, quando a expressão ectópica de MPC2 humano em levedura sem MPC endógeno estimulou o crescimento e aumentou o consumo de oxigênio celular. A detecção de várias espécies oligoméricas de MPC2 em isolados mitocondriais, proteínas purificadas e bicamadas lipídicas artificiais sugerem complexos funcionais de alta ordem (> 2 subunidades). Mudanças significativas no conteúdo da estrutura secundária de MPC2, conforme sondado por dicroísmo circular de radiação sincrotron, suportam ainda mais a interação entre a proteína e os ligantes. A cristalografia de raios X foi prejudicada pela incapacidade de se obter cristais adequados tanto, por difusão de vapor, quanto em fase cúbica lipídica, apesar da obtenção de condições iniciais promissoras. Por fim, a análise por crio-microscopia eletrônica de MPC2 reconstituído em nanodiscos de copolímeros sintéticos permitiu a proposição de uma montagem estequiométrica para o complexo. Coletivamente, nossos resultados fornecem bases para o papel independente do MPC2 na homeostase e doenças relacionadas ao metabolismo desregulado do piruvato e representam uma rota promissora para a determinação de um modelo atômico de alta resolução para MPC2 humano. Abstract: Pyruvate is considered the central hub in the cellular metabolism, key for the generation of both energy and biosynthetic blocks. When the oxidation of pyruvate by the citric acid cycle is required, cytosolic pyruvate must gain access to the mitochondrial matrix in a process thought to actively involve two mitochondrial pyruvate carrier (MPC) subunits assembled into heterotypic oligomers. Since 2012, when molecular identities of mammalian MPC1 and MPC2 (and MPC3 in yeast) were presented, range of in vitro and in vivo studies has since revealed an unexpected interplay between two or even three protein subunits that define different functional assemblies on a metabolic context-specific basis; these have clear implications on the physiology of homeostasis and diseases. However, the structure-based functional mechanism of MPC remains elusive, despite intensive efforts by different research groups that employ state-of-the-art computational tools and experimental techniques. In this thesis, the recombinant production of human MPC through a co-expression strategy is first described; nevertheless, substantial complex formation was not observed, and predominantly individual subunits were purified. In contrast to MPC1, which co-purifies with a host chaperone, we demonstrated that MPC2 homo-oligomers promote efficient pyruvate transport into proteoliposomes. The derived functional requirements and kinetic features of MPC2 resemble those previously demonstrated for MPC in the literature. Distinctly, chemical inhibition of transport is observed only for a thiazolidinedione derivative. The autonomous transport role for MPC2 is validated in cells when the ectopic expression of human MPC2 in yeast lacking endogenous MPC stimulated growth and increased oxygen consumption. Multiple oligomeric species of MPC2 across mitochondrial isolates, purified protein and artificial lipid bilayers suggest functional high-order complexes. Significant changes in the secondary structure content of MPC2, as probed by synchrotron radiation circular dichroism, further supports the interaction between the protein and ligands. X-ray crystallography was hampered by the inability to grow suitable crystals by vapor diffusion and in lipidic cubic phase, despite the successful obtention of promising hit conditions. Lastly, cryo-electron microscopy analysis of MPC2 reconstituted into synthetic copolymer nanodiscs allowed for the proposition of a stoichiometric assembly. Collectively, our results provide the initial framework for the independent role of MPC2 in homeostasis and diseases related to dysregulated pyruvate metabolism and may represent a promising route for the determination of a high-resolution atomic model for human MPC2. Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES 001 FAPESP 2015/02734-7; 2019/02261-2

Las proteínas de membrana son elementos fundamentales de todas las células conocidas, que representan una cuarta parte de los genes del genoma humano, y desempeñan funciones esenciales en la biología celular. Alrededor del 50% de los medicamentos comercializados actualmente tienen una proteína de membrana como objetivo, y alrededor de un tercio de todos ellos se dirigen a los receptores acoplados a proteína G (GPCR). Las dificultades y limitaciones en el trabajo experimental necesario para los estudios microscópicos de la membrana, así como las proteínas de membrana, impulsaron el uso de métodos computacionales. El alcance de esta tesis es desarrollar nuevas herramientas bioinformáticas para el estudio de las proteínas de membrana y en particular para GPCRs que ayudan a caracterizar sus rasgos estructurales y ayudar a la comprensión de su función. Con respecto a las proteínas de membrana, una piedra angular de esta tesis ha sido la creación de dos bases de datos para las principales clases de proteínas de membrana: una para helices-α (TMalphaDB) y otra para proteínas barriles-β (TMbetaDB). Estas bases de datos son empleadas por una herramienta recientemente desarrollada para encontrar distorsiones estructurales inducidas por motivos específicos de secuencias de aminoácidos (http://lmc.uab.cat/tmalphadb y http://lmc.uab.cat/tmbetadb). También se usaron en la caracterización de las interacciones entre residuos que se producen en la región transmembrana de estas proteínas con el objetivo de favorecer la comprensión de la complejidad y las características diferenciales de las proteínas de membrana. Se encontró que las interacciones que involucran los residuos de Phe y Leu son las principales responsables de la estabilización de la región transmembrana. Además, se analizó la contribución energética de las interacciones entre los aminoácidos que contienen azufre (Met y Cys) y los residuos alifáticos o aromáticos. Estas interacciones normalmente no se tienen en gran consideración a pesar de que pueden formar interacciones más fuertes que las interacciones aromático-aromático o aromático-alifático. Asimismo, la familia de GPCRs, la más importante de proteínas de membrana, ha sido el foco de dos aplicaciones web dedicadas al análisis de conservación de aminoácidos o motivos de secuencia y correlación de pares (GPCR-SAS, http://lmc.uab.cat/gpcrsas) y para incorporar moléculas de agua internas en estructuras de estos receptores (HomolWat, http://lmc.uab.cat/HW). Estas aplicaciones web son estudios piloto que pueden extenderse a otras familias de proteínas de membrana en proyectos futuros. Todas estas herramientas y análisis pueden ayudar en el desarrollo de mejores modelos estructurales y contribuir a la comprensión de las proteínas de membrana. Membrane proteins are fundamental elements for every known cell, accounting for a quarter of genes in the Human genome, they play essential roles in cell biology. About 50% of currently marketed drugs have a membrane protein as target, and around a third of them target G-protein-coupled receptors (GPCRs). The current difficulties and limitations in the experimental work necessary for microscopic studies of the membrane as well as membrane proteins urged the use of computational methods. The scope of this thesis is to develop new bioinformatic tools for the study of membrane proteins and also for GPCRs in particular that help to characterize their structural features and understand their function. In regard to membrane proteins, a cornerstone of this thesis has been the creation of two databases for the main classes of membrane proteins: one for α-helical proteins (TMalphaDB) and another for β-barrel proteins (TMbetaDB). These databases are used by a newly developed tool to find structural distortions induced by specific amino acid sequence motifs (http://lmc.uab.cat/tmalphadb and http://lmc.uab.cat/tmbetadb) and in the characterization of inter-residue interactions that occur in the transmembrane region of membrane proteins aimed to understand the complexity and differential features of these proteins. Interactions involving Phe and Leu residues were found to be the main responsible for the stabilization of the transmembrane region. Moreover, the energetic contribution of interactions between sulfur-containing amino acids (Met and Cys) and aliphatic or aromatic residues were analyzed. These interactions are often not considered despite they can form stronger interactions than aromatic-aromatic or aromatic-aliphatic interactions. Additionally, G-protein coupled receptor family, the most important family of membrane proteins, have been the focus of two web applications tools dedicated to the analysis of conservation of amino acids or sequence motifs and pair correlation (GPCR-SAS, http://lmc.uab.cat/gpcrsas) and to allocate internal water molecules in receptor structures (HomolWat, http://lmc.uab.cat/HW). These web applications are pilot studies that can be extended to other membrane proteins families in future projects. All these tools and analysis may help in the development of better structural models and contribute to the understanding of membrane proteins.

Las proteínas de membrana tienen funciones muy diversas en la célula, desde controlar el tráfico molecular hasta facilitar la transducción de señales. Sin embargo, el estudio de estas proteínas supone todo un reto por sus particulares características fisico-químicas. Su naturaleza hidrofóbica requiere un elevado control durante su síntesis. Uno de los pasos críticos en esta síntesis es la inserción en la bicapa lipídica. Generalmente, este proceso se produce a través de un mecanismo (co-traduccional) acoplado al proceso de traducción. Esta vía co-traduccional ha sido ampliamente estudiada y la maquinaria implicada en el proceso se conoce con bastante profundidad. Sin embargo, algunas proteínas (aquellas que presentan el primer segmento transmembrana lejos del inicio de la proteína) siguen una ruta para su inserción diferente. Esta ruta alternativa, es conocida como post-traduccional, debido a que la inserción en la bicapa se produce tras la traducción de la proteína. Los detalles moleculares de esta vía alternativa están pobremente caracterizados. En la primera parte de esta tesis hemos descrito un procedimiento experimental para identificar proteínas involucradas en la inserción de proteínas de membrana a través de la ruta post-traduccional. Para ello hemos creado una quimera que contiene la nucleasa de Staphylococcus aureus seguida del fragmento transmembrana de Glicoforina A (proteína modelo de membrana) en el extremo carboxilo terminal. Una proteína quimérica idéntica, pero carente del segmento transmembrana fue utilizada como control. A continuación, hemos analizado el interactoma de ambas quimeras utilizando diferentes estrategias experimentales como espectrometría de masas, entrecruzamiento químico, geles de dos dimensiones no reductores/reductores y fraccionamiento celular con la esperanza de encontrar proteínas que se asocien de manera específica a la quimera con segmento transmembrana y que participen en el proceso de inserción de la misma. A continuación, validamos la interacción de dos de las proteínas identificadas (HslU, una proteína con función chaperona y MetH, una proteína implicada en el metabolismo de la metionina) mediante técnicas de cromatografía de exclusión molecular, ensayos de luz dispersada e identificación de los fragmentos entrecruzados. Los datos obtenidos nos han permitido identificar nuevos componentes de la ruta post-traduccional así como analizar la multifuncionalidad del proteoma de E.coli, . Comprender las interacciones entre proteínas facilita información sobre el funcionamiento de las mismas y, entre otras aplicaciones, puede resultar de utilidad para el diseño de fármacos. De hecho, el estudio de las interacciones proteína-proteína entre la célula hospedadora y los virus, ha permitido la identificación de componentes celulares implicados en la infección viral, que pueden ser potenciales dianas para el desarrollo de vacunas o medicamentos con acción antiviral. En esta segunda parte de las tesis, hemos analizado mediante técnicas de espectrometría de masas las proteínas celulares presentes en partículas virales (VLPs) del virus Nipah. Este virus pertenece a la familia Paramyxoviridae, la cual está compuesta por virus con genomas de ssRNA de cadena negativa y envoltura lipídica. Actualmente carecemos de tratamientos específicos contra el virus Nipah, siendo estos una prioridad en la investigación biomédica debido a la alta tasa de mortalidad asociada a la infección y el amplio rango de hospedadores a los que puede afectar. Para identificar las proteínas celulares incorporadas en el virión de Nipah, se generaron VLPs (Virus Like Particles) mediante la transfección de las proteínas virales F, G y M en cultivos celulares humanos. Posteriormente las VLPs producidas fueron purificadas y los componentes celulares asociados a las mismas analizados mediante espectrometría de masas. Nuestros resultados mostraron la presencia de proteínas celulares en las VLPs de Nipah que participaban principalmente en el transporte de proteínas y/o vesículas desde los compartimentos internos hasta la superficie celular. Estas proteínas celulares podrían tener una implicación en el ciclo viral y son por lo tanto potenciales dianas terapéuticas contra el virus Nipah. Membrane proteins perform different functions in the cell, controlling molecular trafficking and facilitating signal transduction. However, the study of these proteins is challenging due to their particular physicochemical characteristics. One critical step in the synthesis of membrane proteins is their insertion into the lipid bilayer. Generally, this process occurs through a co-translational mechanism, where insertion is coupled to the translation process. This co-translational pathway has been widely studied and the machinery involved in the process is well known. However, some proteins follow a different route for insertion which molecular details are poorly characterized. This alternative route is known as post-translational, because the insertion in the bilayer occurs once the protein translation is complete. In the first part of this thesis, we have described an experimental procedure to identify proteins involved in membrane protein insertion through the post-translational route. For this purpose we desinged a chimera containing the Staphylococcus aureus nuclease followed by the transmembrane fragment of Glycoforin A, located at the carboxyl terminal end of the chimera. An identical chimeric protein lacking the transmembrane segment was used as a control. Next, we analyzed the interactome associated with both chimeras using different strategies (mass spectrometry, chemical cross-linking, non-reducing / reducing two-dimensional gels and cell fractionation) with the aim of finding proteins that associate specifically with the chimera containing the transmembrane domain. We identified XXXX proteins interacting with our membrane chimera. Next, we validate the interaction of two of these proteins (HslU, with chaperone function and MetH, involved in methionine metabolism) using molecular exclusion chromatography techniques, light scattering assays and identification of cross-linked peptides within mass spectra. In this work we have identify new components of the post-translational route. However, their precise role on the insertion of Ct anchoring proteins remains elusive. Understanding protein interactions can provide a strong foundation for the complete understanding of cell mechanisms, information that is valuable for drug discovery and development. Identification of the protein-protein interactions between host cells and viruses has allowed the identification of many components involved in viral infection, which may be potential targets for vaccine or drug development. In the second part of the thesis, we analyzed the cellular proteins present in viral particles of the Nipah virus using mass spectrometry techniques. Nipah virus belongs to the family Paramyxoviridae, composed of single-stranded RNA viruses with negative genome polarity and lipid envelope. We currently lack specific treatments against Nipah virus. This virus infects a wide range of animals and causes severe disease and death in people, making it a public health concern. To identify the cellular proteins incorporated in the Nipah virion, VLPs (Virus Like Particles) were generated by transfection of human cells with the viral proteins F, G and M. Next, VLPs produced were purified and the cellular components analyzed by mass spectrometry. We identified 67 host protein in the viral particles. These proteins i participate mainly in the transport of membrane vesicles from internal membranous compartments to the plasma membrane or viceversa. Collectively, our data might contribute to decipher viral budding necessities and particularly to a more profound knowledge of NiV life cycle.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi, es la mayor causa de enfermedad cardíaca y de muertes por problemas cardiovasculares en áreas endémicas localizadas en América Latina. Cada año ocurren aproximadamente 12.000 muertes atribuidas a la severidad de la cardiopatía crónica ocasionada por la enfermedad de Chagas (CCC). Es bien aceptado que tanto la persistencia del parásito como la excesiva respuesta inmune inflamatoria generada por la infección, poseen un rol fundamental en el desarrollo de la CCC. Las vías de señalización Wnt son esenciales para el desarrollo y diversos procesos biológicos. Se ha descripto que las proteínas Wnt son secretadas por macrófagos (Mo) y células dendríticas (CDs) luego de la señalización inducida por receptores TLR y citoquinas pro-inflamatorias. En estas células, la señalización mediada por Wnt / -catenina (canónica) y Wnt / Ca++ está asociada a un perfil tolerogénico, la secreción de citoquinas anti-inflamatorias y la inducción de células T regulatorias (Treg). Además, en los últimos años se ha demostrado que las vías Wnt se encuentran involucradas en la regulación de procesos inflamatorios y que componentes de estas vías son modulados en una gran variedad de patologías cardíacas. En este trabajo de tesis se investigó el rol de las vías de señalización Wnt en la modulación de la respuesta inflamatoria / tolerogénica, el control de la replicación del parásito y el desarrollo de CCC. Se demostró que la infección por Trypanosoma cruzi induce la activación de las vías Wnt / β-catenina y Wnt / Ca++ en Mo y que esta activación es crítica para sostener la replicación parasitaria in vitro, ya que el tratamiento con inhibidores de la vía Wnt / β-catenina o de la secreción de proteínas Wnt limitó la replicación intracelular del parásito. La inhibición resultó en la activación de mecanismos que promueven el control de la replicación intracelular del parásito mediante la inducción de la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, la activación de la enzima IDO y la inhibición de la enzima arginasa. De manera similar, la inhibición farmacológica in vivo de la secreción de proteínas Wnt con IWP-L6, fue capaz de controlar la replicación del parásito y mejorar la sobrevida de ratones B6 infectados. Además, se demostró que el mismo tratamiento promueve la resistencia a la infección y modula la respuesta específica de tipo Th2, característica de ratones BALB/c, hacia una respuesta protectora de tipo Th1 a la vez que disminuye la función supresora de células Treg. Asimismo, Finalmente, el tratamiento in vivo con IWP-L6 previno el desarrollo de la patología cardíaca en los ratones BALB/c infectados. Los hallazgos de esta tesis contribuyen al entendimiento de mecanismos celulares que pág. 9 orquestan diferentes señales que promueven una respuesta inmune efectiva capaz de restringir la replicación parasitaria y prevenir la inmunopatología cardíaca asociada a la enfermedad de Chagas crónica. Estos hallazgos contribuyen aportes para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para ser utilizadas solas o combinadas con otras drogas para el tratamiento de esta infección. 2022

C. difficile, a Gram-positive, spore-forming anaerobic bacterium, is considered the leading cause of antibiotic-associated diarrhea in hospitalized patients worldwide, causing C. difficile infection (CDI). The main virulence factors of C. difficile are toxins A (TcdA) and B (TcdB), but others, such as surface layer proteins (SLPs) and flagellum, have also been described and related to the observed inflammatory responses in the CDI. The objective of this study was to identify these virulence factors and other proteins involved in the pathogenesis of CDI by comparative exoproteomics between the supernatant of a virulent strain, ICC-45, isolated in a hospital in the state of Ceará and to compare it with the strain NAP1/027 (LIBA5756) isolated in Costa Rica. After the growth of the C. difficile strains by an incubation period of 24h at 37ºC in the anaerobic jar, the secreted proteins were obtained and analyzed by the in solution technique that were later processed by the type mass spectrometry Nano-LC ESI-MS / MS coupled to LTQ-Orbitrap. From the analysis in solution, a total of 197 proteins were identified, of which 5 belong exclusively the ICC-45 strain. On the other hand, strains ICC-45 and NAP1/027 (LIBA5756) shared 192 proteins. Of the 192 shared proteins, 26 were selected and categorized into six groups (pathogenicity, antimicrobial resistance, heat shock and oxidative stress, nitric oxide, metabolism and other activities). Several proteins related to virulence factors that contribute positively to the pathogenicity of CDI were identified in greater quantity in the ICC-45 strain supernatant when compared to the strain NAP1/027 (LIBA5756). Among these proteins are TcdA and TcdB, S-layer protein, cell surface protein (Cwp19), cell wall proteins (Cwps), flagellin (FliC) and cysteine protease (Cwp84). In addition, other proteins related to the other categories (antimicrobial resistance, heat shock and oxidative stress, nitric oxide, metabolism and other activities) were also found in a larger quantity in the supernatant of the ICC-45 strain. The exclusive proteins of the ICC-45 strain are involved with the catalytic and binding functions. Among the proteins shared, most of them are linked with the catalytic functions, followed by the binding and toxin functions. Both, proteins unique to the ICC-45 strain and those shared between them, more than half are of cytoplasmic origin. Proteins from strains ICC-45 and NAP1 / 027 (LIBA5756) showed similar physical and functional interactions. The ICC-45 exclusive proteins indirectly interacts with the pathogenicity proteins (TcdA, TcdB, FliC, Cwp84 and SlpA) shared among the strains. In addition, the detection of higher amounts of certain proteins in the ICC-45 strain may have an impact on the pathogenesis and clinical parameters of the disease induced by this strain isolated in Northest of Brazil. C. difficile, bactéria Gram-positiva, anaeróbia formadora de esporos, é considerada a principal causa de diarreia associada ao uso de antibióticos em pacientes hospitalizados no mundo todo, causando a infecção por C. difficile (CDI). Os principais fatores de virulência de C. difficile são as toxinas A (TcdA) e B (TcdB), porém, outros, como, as proteínas de superfície celular (SLPs) e os flagelos, também já foram descritos e relacionados às respostas inflamatórias observadas na CDI. O objetivo desse estudo foi identificar esses fatores de virulência e outras proteínas envolvidas com a patogênese da CDI por meio da exoproteômica comparativa entre o sobrenadante de uma cepa virulenta, a ICC-45, isolada em um hospital cearense e comparála com a cepa NAP1/027 (LIBA5756) isolada na Costa Rica. Após o crescimento das cepas de C. difficile por um período de incubação de 24 h a 37 ºC em jarra de anaerobiose, as proteínas do sobrenadante foram obtidas e analisadas por meio da técnica em solução (in solution) que posteriormente foram analisadas pela espectrometria de massas do tipo NanoLC ESI-MS/MS acoplado a LTQ-Orbitrap. A partir da análise in solution, foram identificadas um total de 197 proteínas, sendo que 5 delas pertencem exclusivamente a ICC-45. Por outro lado, as cepas ICC-45 e NAP1/027 (LIBA5756) compartilharam 192 proteínas. Das 192 proteínas compartilhadas, foram selecionadas 26 e categorizadas em seis grupos (patogenicidade, resistência a antimicrobianos, choque térmico e estresse oxidativo, óxido nítrico, metabolismo e outras atividades). Várias proteínas referentes aos fatores de virulência e que contribuem positivadamente para a patogenicidade da CDI, foram identificadas em maior quantidade no sobrenadante da cepa ICC-45 quando comparada a cepa NAP1/027 (LIBA5756). Entre essas proteínas, estão as TcdA e TcdB, proteína de camada S (S-layer), proteína de superfície celular (Cwp19), proteínas de parede celular (Cwps), flagelina (FliC) e cisteína protease (Cwp84). Além dessas, outras proteínas referentes as demais categorias (resistência a antimicrobianos, choque térmico e estresse oxidativo, óxido nítrico, metabolismo e outras atividades) também foram encontradas em quantidade maior no sobrenadante da cepa ICC-45. No que tange especificamente as funções moleculares e a localização subcelular, as proteínas exclusivas da cepa ICC-45 estão envolvidas com as funções catalíticas e de ligação. Já com relação às proteínas compartilhadas entre as cepas mencionadas, a maior parte delas estão ligadas com as funções catalíticas, seguida das de ligação e de toxina. Mais da metade das proteínas exclusivas da cepa ICC-45 e das compartilhadas entre elas são de origem citoplasmática. As proteínas das cepas ICC-45 e NAP1/027 (LIBA5756) apresentaram interações físicas e funcionais semelhantes. As proteínas exclusivas da cepa ICC-45 interagem indiretamente com as proteínas de patogenicidade (TcdA, TcdB, FliC, Cwp84 e SlpA) compartilhadas entre as cepas. Esses dados sugerem uma semelhança entre a cepa ICC-45 e a cepa NAP1/027 (LIBA5756), considerada hipervirulenta. Além disso, a detecção de maiores quantidades de determinadas proteínas na cepa ICC-45 pode ter um impacto na patogênese e parâmetros clínicos da doença induzida por essa cepa isolada no Nordeste do Brasil.

Mycobacterium tuberculosis is considered one of the most successful pathogens in the history of mankind, having caused 1.7 million deaths in 2016. The amount of resistant and extensively resistant strains has increased; BCG has been the only vaccine to be produced in more than 100 years though it is still unable to prevent the disease’s most disseminated form in adults; pulmonary tuberculosis. The search is thus still on-going for candidate antigens for an antituberculosis vaccine. This paper reports the use of a logical and rational methodology for finding such antigens, this time as peptides derived from the Rv3587c membrane protein. Bioinformatics tools were used for predicting mycobacterial surface location and Rv3587c protein structure whilst circular dichroism was used for determining its peptides’ secondary structure. Receptor-ligand assays identified 4 h igh a ctivity b inding p eptides (HABPs) binding specifically to A549 alveolar epithelial cells and U937 monocyte-derived macrophages, covering the region between amino acids 116 and 193. Their capability for inhibiting Mtb H37Rv invasion was evaluated. The recognition of antibodies from individuals suffering active and latent tuberculosis and from healthy individuals was observed in HABPs capable of avoiding mycobacterial entry to host cells. The results showed that 8 HABPs inhibited such invasion, two of them being common for both cell lines: 39265 (155VLAAYVYSLDNKRLWSNLDT173) and 39266 (174APSNETLVKTFSPGEQVTTY192). Peptide 39265 was the least recognised by antibodies from the individuals’ sera evaluated in each group. According to the model proposed by FIDIC regarding synthetic vaccine development, peptide 39265 has become a candidate antigen for an antituberculosis vaccine.

En els últims 20 anys, la caracterització de proteines de membrana ha esdevingut un camp interessant per el disseny de fàrmacs però, la falta d’informació del seu mecanisme d’acció i estructura fa encara més difícil buscar noves dianes terapèutiques. Per tant, estudiar l’estructura i el mecanisme d’acció de proteines de membrana acceleraria la recerca de nous fàrmacs i les seves implicacions mèdiques. El projecte de tesis presentat aquí està centrat en explorar les característiques del transprotador de glucosa humà (hSGLT1). Aquest transportador està implicat en la absorció de glucosa intestinal i està relacionat directament amb diferents enfermetats com: glucosa galactose malabsorbation (GGM), diabetis i l’enfermetat d’Alzheimer. El mecanisme de funcionament d’aquest transportador esta parcialment caracteritzat malgrat que algunes característiques encara no estan clares i s’estan estudiant. No obstant, l’estructura tridemensional del transport no esta descrita i, actualment, és el màxim objectiu pel que fa a entendre com funciona el seu mecanisme i que permetria buscar més fàcilment i efectivament nous fàrmacs. Inicialment, per tal d’obtenir un cristall de proteïna per poder resoldre la seva estructura, es necessiten un gran número de pasos previs. Primer, la proteina d’interest ha de ser expressada en un sistema recombinant correctament i, les proteïnes de membrana no són fàcils d’expressar en tots els sistemes d’expressió. En segon lloc, les proteïnes de membrana humanes son encara més complicades d’expressar perquè es necessari treballar en un sistema d’expressió eucariote o, sinó, es molt probable que s’obtingui una proteïna funcionalment inactiva. hSGLT1 ha sigut obtingut recombinant només un cop per un sistema eucariote de llevat: Pichia pastoris. Aquest llevat ha sigut utilitzat en els últims 10 anys per expressar proteines de membrana perque, a diferència d’altres llevats, com Saccharomyces cerevisae, pot crèixer molt més i, per tant, obtenir molta més proteïna. Una altre avantatge d’aquest sistema d’expressió és l’estabilitat dels clons de P. pastoris ja que implica més reproducibilitat en l’expressió. Tot i així, algunes desavantatges presenta aquest sistem que s’han de superar per tal d’obtenir bons nivells d’epressió, com per exemple, la selecció de clons. Degut a tot aixó, el projecte que es presenta aquí esta basat inicialment amb els treballs previs realitzats amb P. pastoris. Aquesta tesis esta centrada en l’expressió, purificació i caracterització del transportador de glucosa humà (hSGLT1) expressat en un sistema d’expressió heteroluga de llevat (P.pastoris). Inicialment, dos vectors es van dissenyar: Un que expressa hSGLT1 fusionat amb eGFP i l’altre que no (WT). El constructe que expresa la proteina fusionada amb eGFP es va utilitzar per monotiroritzar l’expressió de manera més fàcil i ràpida i que, per tant, permet optimitzar les condicions d’expressió, com per exemple: temps d’inducció, temperature, medis.etc. Les proteines de membrana necessiten ser extrete de la membrana per poder-les purificiar i, per tant, es requereix de detergent. El constructe amb eGFP es va utilitzar també per buscar quin detergent era més òptim per extreure la proteïna. Tot i així, tots ambdós costructes (WT i eGFP) es van purificar i aïllar correctament però només el producte WT es va utilitzar per els següents experiments estructurals. Malgrat les dificultats de reproduir el que s’havia descrit anteriorment, la proteina finalment es va aconseguir sotmetre a assaijos de funcionalitat. L’assaig de binding es va fer a partir d’una tècnica inusual: voltage-clamp in planar lipid membranes. Aquesta tècnica permet mesurar transport (funció) del transportador sense la necessitat d’incorporarar-la en liposomes. La conclusió final que es pot extreure en aquest treball es que hSGLT1 es pot purificar correctament i que, per tant, obre un gran ventall de possibilitats en un futur, com per exemple, cristalitzar la proteina per tal de resoldre la seva estructura i el seu mecanisme., In the last 20 years, the characterization of membrane protein has become an interesting field for drug design but, the lack of information regarding their mechanism of action makes it even harder to screen for new drug targets. Therefore, studying the structure and mechanism of action of membrane proteins should accelerate the research of new drugs and its medical implications. The project presented here is focused on exploring the features of a human sodium glucose co-transporter (hSGLT1). This transport is involved in absorbing and reabsorbing the glucose in the intestine and it’s linked and directly involved in some diseases like: glucose galactose malabsorbation (GGM), diabetes and even some mental diseases like Alzheimer’s diseases. The mechanism of action of this transporter is partially understood although some features are still under debate and unclear. However, the 3D structure of this transporter is unknown and it’s an end goal for elucidating the mechanism of action of the transporter which will allow screening easily more effective drugs. In order to be available to crystalize a membrane protein for its structure, a huge number of initial steps are necessary. First, the protein of interest must be expressed in a recombinant system satisfactorily and, membrane proteins are not easily expressed in all expression systems. Second, human membrane proteins are even harder to express because it’s necessary to work with a non-prokaryote expression system or, otherwise, it is very likely to obtaining in the end a non-functional protein. It has been described, only once, that hSGLT1 could be expressed in a eukaryotic yeast expression system: Pichia pastoris. This yeast has been used a lot in the last 10 years for expressing membrane proteins successfully because, unlike Saccharomyces cerevisae, it can grow much more and therefore obtain more protein in the end. Another advantage is the stability of the expression clones of P. pastoris which eventually leads to a more reproducible result. Although, some disadvantages must be overcome at the same time to have good expression levels like, for example, the clone selection. Because of all of this, the project presented here was initially based on this previous work done in P. pastoris. This thesis is focused on the expression, purification and characterization of hSGLT1 expressed in a yeast heterologous expression system (P.pastoris). Initially, two vectors were design: One expressing hSGLT1 fused to eGFP and another construct without eGFP. The eGFP construct was used to monitorize the protein expression faster and easier which allows optimizing the protein expression by screening for best expression conditions like: induction time, temperature, media and more. Membrane proteins required to be extracted from the membrane in order to purify them and, to do so; a detergent is required. The eGFP fused protein was also used to screen which detergent is more suitable for protein extraction too. Although, both expression product (non-GFP and GFP) were purified and isolated only the WT hSGLT1 was used for further analysis. Despite the difficulties to reproduce what was described before, the protein was eventually subjected to a binding assay. The binding assay was done with an unusual technique which is: voltage-clamp in planar lipid membranes. This technique allowed to measure transport (functionality) of the protein without the need to be incorporated in a liposomes. The main conclusion extracted in this work is that a functional hSGLT1 can be purified which allows a wide number of possibilities in the future like crystallization for elucidating the structure and mechanism of the protein.

Detection of methylated free-circulating DNA (mfcDNA) for hyperplastic polyposis 1 (HPP1) in blood is correlated with a poor prognosis for patients with metastatic colorectal cancers (mCRC). Here, we analyzed the plasma levels of HPP1 mfcDNA in mCRC patients treated with a combination therapy containing a fluoropyrimidine, oxaliplatin and bevacizumab to test whether HPP1 mfcDNA is a suitable prognostic and response biomarker. From 467 patients of the prospective clinical study AIO-KRK-0207, mfcDNA was isolated from plasma samples at different time points and bisulfite-treated mfcDNA was quantified using methylation specific PCR. About 337 of 467 patients had detectable levels for HPP1 mfcDNA before start of treatment. The detection was significantly correlated with poorer overall survival (OS) (HR = 1.86; 95%CI 1.37-2.53). About 2-3 weeks after the first administration of combination chemotherapy, HPP1 mfcDNA was reduced to non-detectable levels in 167 of 337 patients. These patients showed a better OS compared with patients with continued detection of HPP1 mfcDNA (HR HPP1(sample 1: pos/ sample 2: neg) vs. HPP1(neg/neg) = 1.41; 95%CI 1.00-2.01, HPP1(neg,pos/pos) vs. HPP1(neg/neg) = 2.60; 95%CI 1.86-3.64). Receiver operating characteristic analysis demonstrated that HPP1 mfcDNA discriminates well between patients who do (not) respond to therapy according to the radiological staging after 12 or 24 weeks (AUC = 0.77 or 0.71, respectively). Detection of HPP1 mfcDNA can be used as a prognostic marker and an early marker for response (as early as 3-4 weeks after start of treatment compared with radiological staging after 12 or 24 weeks) to identify patients who will likely benefit from a combination chemotherapy with bevacizumab. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Sphingolipidoses comprise the most prevalent group of lysosomal storage disorders. The most frequent is Gaucher disease (GD), where it occurs the storage of the glycosphingolipid glucosylceramide (GlcCer) due to a deficiency in the enzyme glucocerebrosidase (GCase). GD is a multi-systemic disorder affecting most organs, resulting in cytopenia, hepatosplenomegaly and skeletal abnormalities. Only recently, lysosomal integral membrane protein, type 2 (LIMP-2) has been identified as the receptor involved in the intracellular sorting and trafficking of the enzyme GCase to lysosomes. Deficiency of LIMP-2 causes Action Myoclonic-Renal Failure (AMRF), which clinically differs from GD. AMRF patients present renal dysfunction and failure, myoclonic epilepsy and ataxia with progressive neurological impairment . N/A

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 Los gangliósidos, una gran familia de glicoesfingolípidos ácidos, se componen de un segmento hidrofóbico, la ceramida, y un oligosacárido mono o polisialilado de longitud y composición variable. En las células, los gangliósidos se encuentran principalmente en la hemicapa externa de la membrana plasmática a la cual se insertan a través del residuo ceramida exponiendo el oligosacárido hacia el medioambiente extracelular. Estos glicolípidos han sido implicados en numerosos procesos fisiológicos que incluyen, crecimiento, diferenciación, migración y apoptosis entre otros, a través de la modulación de la actividad de receptores de membrana y de interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Además de su rol fisiológico, los gangliósidos también han sido asociados a un amplio espectro de procesos patológicos siendo receptores de virus, toxinas, lectinas y anticuerpos. Durante el presente trabajo de tesis se abordó el estudio de la unión y comportamiento endocítico de diferentes anticuerpos anti-glicolípidos (AGAb), particularmente de inmunoglobulinas que reconocen a los gangliósidos GD1a y GM1 en varias líneas celulares en cultivo. En primera instancia se caracterizó la unión, endocitosis y destino intracelular de diferentes anticuerpos monoclonales de isotipo IgG que unen con alta afinidad al gangliósido GD1a en células epiteliales derivadas de ovario de hámster chino (CHO-K1) y en células derivadas de neuroblastoma murino (Neuro-2a). Luego de unirse a membrana plasmática, una fracción minoritaria de un anticuerpo anti-GD1a (Ab1-GD1a) fue rápidamente endocitada a 37°C en células epiteliales mediante un mecanismo independiente de dinamina-2 y dependiente de Arf-6 colocalizando en una región yuxtanuclear principalmente con marcadores de endosomas de reciclado. Mientras que la cantidad asociada a la fracción celular fue mínima (20-25%) una fracción mayoritaria del anticuerpo inicialmente unida a membrana plasmática, fue recuperada en el medio de cultivo. Este anticuerpo permaneció principalmente localizado en la superficie celular en experimentos de endocitosis a 16°C, contrastando con la eficiente endocitosis de la proteína transferrina y de otro complejo gangliósido-anticuerpo (GD3-R24) a esta temperatura. Esta evidencia experimental sugiere la presencia de mecanismos selectivos de internalización celular de complejos gangliósidos-anticuerpos. Para determinar si la unión a membrana, endocitosis y destino intracelular es una característica compartida por los anticuerpos anti-GD1a, se incluyó en el estudio otro anticuerpo monoclonal anti-GD1a de diferente isotipo (Ab2-GD1a). Los resultados obtenidos muestran una mínima endocitosis de este anticuerpo en células epiteliales que involucra un mecanismo dependiente de Arf-6, junto con una drástica y rápida reducción de los niveles totales de Ab2-GD1a y localización del anticuerpo endocitado en una región yuxtanuclear. Esto indica un comportamiento comparable de ambos anticuerpos que reconocen GD1a sugiriendo que comparten procesos similares de unión y endocitosis en células epiteliales. Ab2-GD1a se une eficientemente a la superficie de células derivadas de neuroblastoma y se registra un moderado descenso de los niveles totales del anticuerpo comparado con la drástica reducción observada en las células epiteliales. Esto sugiere que el procesamiento endocítico de los anticuerpos anti-GD1a analizados también depende del tipo celular. Los estudios de unión y endocitosis fueron también investigados para un anticuerpo monoclonal contra el gangliósido GM1 (Ab2-GM1). Este anticuerpo se unió eficientemente a la membrana plasmática de células CHO-K1 y una fracción mayoritaria (60-70%) fue rápidamente endocitada a 37°C y acumulada en un compartimiento yuxtanuclear contrastando con la mínima endocitosis descripta para los anticuerpos que reconocen GD1a. Además, los niveles de Ab2-GM1 permanecieron inalterados y principalmente asociados a la membrana plasmática cuando los experimentos de endocitosis se realizaron a 37°C en células Neuro-2a, contrastando con lo observado para los anticuerpos anti-GD1a en esta línea celular. Por lo tanto, se observó que bajo idénticas condiciones experimentales, el tiempo de residencia en membrana plasmática y la fracción endocitada de anticuerpos anti-GD1a y anti-GM1 fueron notoriamente diferentes. En su conjunto, los datos experimentales sugieren que el comportamiento endocítico y procesamiento celular de cada anticuerpo anti-gangliósido puede variar en función del tipo de anticuerpo y del tipo celular, lo cual representa un aspecto clave a considerar en el estudio de sus roles patogénicos en neuropatías así como también en su uso como herramientas terapéuticas. Los gangliósidos son sintetizados por un conjunto de enzimas glicosiltransferasas y sialiltransferasas residentes de retículo endoplásmico (RE) y del complejo de Golgi. Éstas enzimas, en muchos casos organizadas como complejos multienzimáticos, utilizan como sustrato de partida ceramida (Cer) e incorporan monosacáridos de forma secuencial de manera que el producto de una enzima es sustrato de la siguiente en la vía biosintética (Fig. I-1). Como parte de este trabajo de tesis se caracterizó por primera vez la expresión, localización subcelular y modificaciones postraduccionales de la sialiltransferasa humana ST3Gal-II. Ésta es la principal enzima responsable de la biosíntesis in vivo del gangliósido GD1a a partir de GM1, ambos gangliósidos blanco de los anticuerpos anti-glicolípidos estudiados en la segunda parte de esta tesis. II es una proteína transmembrana tipo-II con un corto segmento citoplasmático N-terminal, un fragmento transmembrana y un gran dominio C-terminal orientado hacia el lumen del complejo de Golgi que contiene el sitio catalítico. La secuencia primaria de aminoácidos revela dos sitios potenciales de N-glicosilación, asparagina 92 y asparagina 211 (Asn92 y Asn211). Mediante ensayos bioquímicos, farmacológicos, de microscopía confocal y mutagénesis sitio dirigida se caracterizó la expresión, localización subcelular, ocupación y relevancia de los sitios de N-glicosilación en la localización y actividad in vitro de la enzima. ST3Gal-II se localiza en el complejo de Golgi de células CHO-K1 con predominio en compartimientos proximales y se expresa en similar proporción de monómero y dímero sensible al tratamiento con agentes reductores. La enzima se encuentra N-glicosilada principalmente en Asn211 y el glicano no es del tipo complejo, sino que contiene una alta proporción de residuos de manosa. La presencia del N-glicano en dicha posición es necesaria para la salida de la enzima del RE y su transporte y localización en el complejo de Golgi. La carencia del N-glicano en posición 211 influencia de manera negativa la actividad sialiltransferasa in vitro utilizando como aceptor un gangliósido (GM1) o una glicoproteína (asialofetuina), mientras que la falta del mismo en la posición 92 no afecta la actividad hacia la glicoproteína e influencia de manera positiva la actividad hacia el gangliósido. Una versión quimérica conteniendo el dominio N-terminal (NtD) de ST3Gal-II (aminoácidos 1-51) fusionada a la proteína fluorescente mCherry (ST3Gal-II-1-51-mCherry) se expresa en células CHO-K1 y se localiza en el complejo de Golgi. Esto sugiere que el NtD es necesario para el transporte desde el RE y retención de ST3Gal-II en el complejo de Golgi. Además, indicaría que el dominio C-terminal de ST3Gal-II depende de la N-glicosilación para alcanzar un estado conformacional óptimo de plegamiento que le permita salir del RE para localizarse adecuadamente en el aparato de Golgi, probablemente como un requerimiento del control de calidad de plegamiento de proteínas en RE, pero no sería un requerimiento excluyente para la retención de la enzima en el complejo de Golgi. Asimismo, el residuo cisteína presente en el NtD de ST3Gal-II tendría un rol en la formación y estabilización de la forma dimérica. Ruggiero, Fernando Miguel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Cuadra, Gabriel Ricardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. D´Alessio, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina.

La célula es la unidad básica estructural y funcional de la vida y todas las células están rodeadas y delimitadas por sus membranas biológicas. Las membranas juegan un papel crucial en la existencia de las células delimitándolas y conectándolas con su entorno. Las membranas biológicas están formadas principalmente por lípidos y proteínas. Mientras que los lípidos forman una bicapa que impide la difusión libre de la mayoría de moléculas e iones, las proteínas controlan el tráfico molecular y el flujo de información a través de la membrana. A estas proteínas insertadas en la membrana biológica se les denomina proteínas de membrana, caracterizadas por la presencia de regiones adaptadas para insertarse, plegarse y funcionar en el complejo entorno de las membranas. La adecuada inserción, plegamiento y orientación en la membrana son esenciales para el correcto funcionamiento de las proteínas de membrana. Esta tesis se centra en los dominios transmembranos de las proteínas helicoidales de membrana, un tipo de moléculas que comprenden entre el 20 y el 30% de todos los genes en la mayoría de los genomas secuenciados. Sin embargo, debido a la complejidad del entorno en el que viven, nuestro conocimiento sobre las proteínas de membrana está aún muy lejos del de las proteínas solubles. La gran mayoría de las proteínas helicoidales de membrana se insertan de manera co-traduccional en la membrana del retículo endoplasmático a través de un canal contínuo entre el ribosoma y el translocón. La eficacia de la inserción en la membrana depende de la composición de aminoácidos, la longitud de la hélice y la posición de los aminoácidos dentro de la hélice. Recientes avances en la determinación de estructuras de proteínas de membrana permiten el análisis de las principales características de los aminoácidos en segmentos transmembrana (TM) en comparación con los aminoácidos de helices de proteínas solubles en agua. En esta Tesis, se introdujo un análisis a gran escala de las tendencias de los aminoácidos utilizando un conjunto de datos de 170 estructuras de proteínas integrales de membrana obtenidas de la base de datos MPTopo y 930 estructuras de proteínas helicoidales solubles en agua obtenidas del Protein Data Bank. También examinamos la distribución de residuos a lo largo de las hélices TM incluidas en nuestra base de datos. A continuación, realizamos un análisis computacional de la composición y localización de los residuos de aminoácidos en esta base de datos para generar un extenso conjunto de secuencias diseñadas con distribuciones naturales de aminoácidos, de las cuales se calculó el valor predicho (teórico) de inserción en membranas. Finalmente, utilizando un sistema de traducción in vitro en presencia de membranas biológicas, validamos experimentalmente nuestras predicciones analizando su capacidad de inserción en membranas biológicas. Los hallazgos de esta Tesis, junto con estrategias conocidas para el control de la topología, pueden allanar el camino en el diseño de novo de proteínas de membrana. The cell is the basic structural and functional unit of life and all cells are surrounded and delimited by their biological membranes. Membranes play a crucial role in the existence of cells by isolating from and connecting with their environment. Biological membranes are mainly formed by lipids and proteins. Whereas lipids form a bilayer that prevents free diffusion of most molecules and ions, proteins control molecular trafficing and information flow across the membrane. These proteins embedded within biological membrane are called membrane proteins, characterized by the presence of sequence regions adapted to insert, fold and function in the complex environment of membranes. Proper insertion, folding and orientation into the membrane are essential for the correct function of membrane proteins. This thesis is focus on the transmembrane domains of α-helical membrane proteins, a type of molecules that comprise 20-30% of all genes in most sequenced genomes. However, due to the complexity of the environment in which they live, our knowledge about membrane proteins is still far away from that of soluble proteins. The great majority of helical membrane proteins are inserted co-translationally into the ER membrane through a continuous ribosome-translocon channel. The efficiency of membrane insertion depends on transmembrane (TM) helix amino acid composition, the helix length and the position of the amino acids within the helix. Recent advances in high-resolution structure determination of membrane proteins enable now the analysis of the main features of amino acids in transmembrane (TM) segments in comparison with amino acids in water-soluble helices. In this Thesis, we introduced a large-scale analysis of amino acid propensities using a data set of 170 structures of integral membrane proteins obtained from MPTopo database and 930 structures of water-soluble helical proteins obtained from the Protein Data Bank. We also examined the distribution of residues along the TM helices included in our database. Next, we conducted a computational analysis of the composition and location of amino acid residues in this database to obtain an extensive set of designed polypeptide segments with naturally occurring amino acid distributions. Finally, using an in vitro translation system in the presence of biological membranes, we experimentally validated our predictions by analyzing its membrane integration capacity. Coupled with known strategies to control membrane protein topology, the findings of this Thesis may pave the way to de novo membrane protein design.

Orientador: Andréa Dessen de Souza e Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A parede celular desempenha uma função essencial na manutenção da sobrevivência bacteriana, prevenindo a lise osmótica e conferindo rigidez e formato à célula. As enzimas envolvidas na biossíntese de seu componente central, o peptideoglicano, são potenciais alvos para novos fármacos. Além disto, a maior parte desta via metabólica é bem caracterizada estrutural e funcionalmente. Uma das exceções consiste na etapa de translocação do substrato precursor lipídeo II. As proteínas que medeiam essa atividade celular são chamadas, genericamente, de flippases. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi a caracterização estrutural e funcional da proteína RodA, uma proteína de membrana, com papel de flippase, e que participa dos processos de translocação do lipídeo II no alongamento celular, sendo parte do complexo multiproteico denominado de elongasome. Adicionalmente, este estudo também abordou o entendimento estrutural das proteínas quiméricas (Flippase-PBPs), que contêm tanto a função enzimática da flippase quanto a função enzimática da Penicillin Binding Protein (PBP). A maior parte deste trabalho de doutoramento foi realizada no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Campinas- SP, contudo, uma parte do estudo foi realizado no Institut de Biologie Structurale (IBS), em Grenoble, na França. Nossa abordagem experimental consistiu na expressão das proteínas em sistemas de expressão bacterianos e do tipo cell-free, na purificação e seleção dos detergentes apropriados para a solubilização das proteínas de membrana, na caracterização hidrodinâmica por ultra centrifugação analítica (AUC) e espalhamento de luz dinâmico (DLS), na cristalização (in surfo e in cubo) e na caracterização da atividade enzimática da RodA em relação à atividade de flippase e de GTase. Os resultados obtidos mostraram a eficiência do cell-free em expressar as proteínas e, adicionalmente, mostraram que este tipo de sistema acarreta em protocolos de purificação mais simples quando comparados a protocolos desenvolvidos com base em sistemas bacterianos de expressão. A caracterização da Flippase-PBP complexada com detergentes mostrou que ela é monomérica e estimou, numericamente, seu raio hidrodinâmico e seu quociente friccional. A cristalização in cubo foi implementada como técnica principal de cristalização e ensaios iniciais foram realizados com a RodA e com a Flippase-PBP. Os resultados da caracterização funcional da RodA (E. coli e B. subtilis) serão publicados em breve e demonstraram a ação enzimática desta proteína no que tange à translocação do lipídeo II e à ação catalítica de transglicosilação Abstract: The cell wall plays an essential role in the maintenance of bacterial survival, preventing osmotic lysis and providing rigidity and shape to the cell. The enzymes involved in the biosynthesis of its central component, the peptidoglycan, are potential targets for novel pharmaceuticals. In addition, most of this metabolic pathway is well-characterized structurally and functionally. One of the exceptions consists of the translocation step of the precursor substrate named lipid II. The proteins that mediate this cellular role are designated, generically, as flippases. In this sense, the objective of this work was the structural and functional characterization of the RodA protein, a membrane protein that participates in the process of lipid II translocation during the cell elongation, being part of the multi-protein complex called the elongasome. Additionally, this study also addressed the structural understanding of the chimeric proteins (Flippase-PBPs), which contain the enzymatic functions of both flippase and Penicillin Binding Protein (PBP). Most of the doctoral work described here was performed at the Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Campinas, Brazil; nevertheless, one part of the study was carried out at the Institut de Biologie Structurale (IBS), Grenoble, France. In terms of the methodologies, our approach consisted in protein expression using bacterial- and cell-free-based systems, purification and selection of detergents suitable for the solubilization of the membrane proteins, hydrodynamic characterization through analytical ultracentrifugation and dynamic light scattering, crystallization (in surfo and in cubo), and characterization of the enzymatic activity concerning the flippase and GTase activities of RodA. The results thus obtained showed the efficiency of the cell-free system in expressing the proteins and, additionally, showed that this type of system leads to simpler purification protocols when compared to protocols developed with bacterial expression systems. The characterization of the Flippase-PBP-detergent complex demonstrated that it is monomeric and numerically estimated the values for its hydrodynamic radius and its frictional quotient. The crystallization in cubo was implemented as the main crystallization technique and initial trials were performed with RodA and Flippase-PBP. The results of the functional characterization of RodA (E. coli and B. subtilis) will be published shortly and demonstrate the enzymatic action of this protein with regard to the translocation of lipid II and the catalytic action of transglycosylation Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/22681-0

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016 La glicosilación de proteínas es la modificación postraduccional más abundante en las células. La biosíntesis de glicanos, a diferencia de la síntesis de ADN, se lleva a cabo de manera independiente de un templado. Los mecanismos que controlan y resguardan la fidelidad de los glicanos aún son poco conocidos. El objetivo general de esta tesis es contribuir al conocimiento de los mecanismos de regulación de glicosiltransferasas que inician la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc. La glicosilación de tipo O-GalNAc es iniciada por la familia de polipeptidil N-acetilgalactosaminil transferasas (ppGalNAc-Ts) constituída por 20 miembros, los cuales incorporan un residuo de N-acetilgalactosamina sobre residuos serina/treonina (αGalNAc-Ser/Thr) de un polipéptido aceptor. Estas glicosiltransferasas son proteínas de membrana tipo II que presentan en su porción luminal un dominio catalítico y en el extremo carboxilo terminal un dominio tipo lectina con un plegamiento característico de tipo β-trefoil. Uno de los objetivos específicos de esta tesis fue estudiar la influencia de estos dominios tipo lectina en la actividad enzimática de glicosiltransferasas que inician la glicosilación de tipo O-GalNAc. En primer lugar, se demostró que los dominios lectina de ppGalNAc-T3 y T4 (T3lec y T4lec) inhiben la actividad enzimática de las isoformas ppGalNAc-T2 y T3. Este efecto inhibitorio pudo ser corroborado in vivo utilizando la línea celular CHO ldlD. Los resultados mostraron que se trata de una interacción proteína-proteína en donde el dominio lectina de una ppGalNAc-T interacciona con el dominio catalítico de otra isoforma. A su vez, tanto T3lec como la enzima ppGalNAc-T3 (incluyendo el dominio catalítico y lectina) fueron capaces de activar la actividad de C1GalT, enzima que cataliza la incorporación de galactosa sobre αGalNAc-Ser/Thr. Esto pone de manifiesto el rol regulatorio diferencial de los dominios lectina sobre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en esta biosíntesis de glicanos. Por otro lado, la acetilación de lisinas está emergiendo como un mecanismo de control postraduccional cada vez más frecuente que puede ocurrir en todos los compartimentos subcelulares. Múltiples glicosiltransferasas residentes en Golgi se han informado como enzimas blanco de la acetilación entre ellas las isoformas ppGalNAc-T2 y T9. Por eso, la segunda parte de esta tesis está abocada a estudiar el efecto de la acetilación de lisinas sobre las propiedades biológicas de las ppGalNAc-Ts. En particular, se focalizó en el efecto de una mutación puntual que simula acetilación en la K626 localizada en un motivo estructural conservado (QKW) del dominio lectina de ppGalNAc-T3. Esta mutación (K626Q) disminuyó la actividad catalítica de la enzima y su capacidad de interacción con glicanos de tipo O-GalNAc. En ensayos de interacción con el glicopéptido (MUC1-αGalNAc) y péptidos derivados de mucinas, la mutante incrementó su unión a los mismos en presencia de glicósidos de GlcNAc. En conclusión, ambos mecanismos de regulación estudiados en la presente tesis muestran al plegamiento β-trefoil de los dominios lectinas de ppGalNAc-Ts como estructura clave para la regulación de la glicosilación de tipo O-GalNAc dadas sus propiedades de interacción con múltiples moléculas. Lorenz, Virginia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Chiabrando, Gustavo Alberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Nores, Gustavo Alejandro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Nicotra, Viviana Estela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Iglesias, Alberto Alvaro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina.

Las proteínas de membranas corresponden a una fracción significativa, entre un 20-30%, del proteoma eucariota y están implicadas en una variedad de funciones celulares. Sin embargo, muchas veces su estudio es complicado, con respecto a sus contrapartes citoplasmáticas, debido principalmente a su naturaleza hidrofóbica. En el presente trabajo se caracterizó a Rot1, una proteína de membrana esencial de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína posee un dominio transmembrana (TM) en su extremo C-terminal necesario tanto para anclarse a la membrana del retículo endoplásmico (RE) como para la función de la proteína, la cual se desconoce, aunque se ha visto relacionada con diferentes procesos celulares como el metabolismo de la pared celular o el control del ciclo celular. Aquí, se determinaron los residuos esenciales dentro del dominio TM, importantes para que la proteína funcione correctamente, así como las regiones de la proteína implicadas en su proceso de señalización al RE y su mecanismo de degradación. Además, se propuso la realización de una búsqueda de posibles proteínas que interaccionen con Rot1, para intentar establecer a nivel molecular la función que cumple Rot1 en S. cerevisiae.

Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica Actualmente a proteómica é uma ferramenta muito utilizada na análise das diferenças na expressão de genes em estirpes bacterianas. Há muitos anos que Staphylococcus aureus tem sido reconhecido como um importante agente patogénico responsável por doenças humanas. A dificuldade no tratamento e o surgimento constante de múltiplas resistências a antibióticos têem feito deste organismo um importante foco de estudo. Para investigar este patógeno foram determinados, através de técnicas de electroforese bidimensional e técnicas de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa, três proteomas diferentes de uma estirpe clínica de S. aureus resistente à meticilina (MRSA). Recorrendo à técnica 2-DE para obtenção do proteoma citoplasmático, foram excisados um total de 105 spots, nos quais, por correlação com as bases de dados de bioinformática, permitiram a identificação de 227 proteínas. No proteoma da superfície celular exposta foram identificadas 236 proteínas, assim como no proteoma extracelular foi possível identificar 99 proteínas. Identificaram-se proteínas relacionadas com funções-base da célula, mas também proteínas relacionadas com virulência e patogenicidade, tais como a catalase e a proteína isdA, principal responsável pela infecção em S. aureus, e proteínas relacionadas com a resistência aos antibióticos como as proteínas de membrana PBP. As duas classes com mais proteínas identificadas foram a glicólise, no proteoma intracelular, e a tradução nos outros proteomas da membrana celular exposta e extracelular, reflectindo assim um metabolismo activo. Estes resultados revelam a importância da proteómica no desenvolvimento do conhecimento da expressão proteica da estirpe de MRSA, microrganismo este com diversos e importantes mecanismos de resistência e patogenicidade. Este mapa proteómico global permite uma melhor compreensão deste agente patogénico, fornecendo assim novos dados para bancos de dados de proteínas. Proteomics is presently a powerful tool to analyze the differences in gene expression in bacterial strains. For many years Staphylococcus aureus has been recognized as an important pathogen and responsible for human diseases. The difficulty in treatment and constant new appearance of multiple antibiotic resistance has made this organism an important focus of study. To investigate this pathogen three different proteomes of a methicillinresistant clinical strains S. aureus (MRSA) were determined by techniques of twodimensional electrophoresis and liquid chromatography-mass spectrometry. Using 2-DE for cellular proteome were excised 105 spots, in which, for correlation with bioinformatics databases, we identified 227 proteins. Considering the exposed cell surface proteome and the exoproteome, 236 and 99 proteins were identified respectively. Proteins related to basic cell functions were found, but also proteins related to virulence and pathogenicity, like catalase and isdA, main responsible for S. aureus infection, and proteins related to antibiotic resistance membrane proteins PBP. The two classes with more proteins identified were glycolysis in the intracellular proteome and translation in the othe exposed cell membrane and exoproteome, this reflects an active metabolism. These results highlight the importance of proteomics to development knowledge of protein expression of MRSA, this microorganism with several important mechanisms of resistance and pathogenicity. This global proteomics allows a better understanding of this pathogen, also providing new data for proteins databases.

In 2014, the scientific community celebrated the impact crystallography has had on fundamental and applied science, and the ground-breaking discoveries that have gifted us with vision into the molecular and nano-worlds. UNESCO has declared 2015 as the International Year of Light, so now is perhaps a well timed moment to reflect on the role synchrotrons play in the field. Access to synchrotron radiation has revolutionized our ability to explore the properties, interactions and structure of materials, and broadened our understanding in diverse scientific arenas ranging from our cultural heritage, to nano-technology and new materials, to cellular systems and drug discovery. The range of potential synchrotron applications and fields of interest is enormous and beyond the scope of any single article, so my aim here, is simply to provide a snapshot filtered through the lens of biological crystallography. We will look back at how synchrotrons developed into the state-of-the-art facilities we see today, how beamlines adapted to the quickening brought on by the introduction of high throughput techniques at the turn of the millennium, and forward to some of the new directions and technologies that are transforming modern light sources and crystallography., La comunidad científica celebró en 2014 el impacto que la cristalografía ha tenido sobre la ciencia fundamental y aplicada, así como los de descubrimientos relevantes que nos han proporcionado una visión del mundo a escala molecular y nanométrica. La UNESCO ha declarado 2015 como el Año Internacional de la Luz por lo que quizás es un buen momento para reflexionar sobre el papel que han jugado y juegan los sincrotrones en esta ciencia. El acceso a la radiación sincrotrón ha revolucionado nuestra capacidad para explorar las propiedades, interacciones y estructura de materiales, así como ampliado nuestro conocimiento en distintos contextos científicos, desde el patrimonio cultural a la nanotecnología y nuevos materiales, hasta la exploración de sistemas celulares y búsqueda de fármacos. El rango de potenciales aplicaciones de los sincrotrones y sus campos de interés es vasto y queda fuera del alcance de un único artículo por lo que la intención del autor es la de proporcionar una imagen de los sincrotrones obtenida a través del filtro de la cristalografía macromolecular. Echaremos la vista atrás para ver cómo los sincrotrones han ido evolucionado hasta llegar a las actuales instalaciones en donde las líneas de trabajo asociadas a los mismos se están adaptado rápidamente a la introducción de las técnicas de alto rendimiento en el cambio del milenio; pero también miraremos hacia el futuro, hacia las nuevas tendencias y tecnologías que ya están transformando las actuales instalaciones y la misma cristalografía.

A panel of 13 monoclonal antibodies (MAbs) that react against outer membrane proteins of Salmonella Enteritidis was obtained. Two MAbs were classified as IgM, six were IgG2a, three were IgG3 and one was of the IgG2b isotype. The reactivity of the MAbs against different serovars of Salmonella enterica and other bacteria was investigated using an indirect ELISA. Five MAbs reacted only against Salmonella Enteritidis. Two MAbs presented crossed reactions with thermo-extracted antigens of Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii and Enterobacter aerogenes. MAb 424H presented wide spectrum of reactivity, detecting antigens of Salmonella belonging to serogroups B, C, D, E and G. The detection limit of different serovars of Salmonella in a indirect ELISA with MAb 424H varied from 1.0 x 10(4) CFU/mL for Salmonella London to 1.4 x 10(6) CFU/mL for Salmonella Gallinarum and Salmonella Typhimurium. Evaluation of the performance of the ELISA with MAb 424H in the detection of Salmonella in samples of chicken meat artificially contaminated revealed that the ELISA was able to detect all serovars after sample enrichment using two levels of contamination. Samples of chicken meat not artificially contaminated analysed in parallel were negative for Salmonella in both the conventional and the ELISA methods.Foi obtido um painel de 13 anticorpos monoclonais que reagem com proteínas de membrana externa de Salmonella Enteritidis. Dois MAbs foram classificados como IgM, 6 foram do isotipo IgG2a, três foram do isotipo IgG3 e um do isotipo IgG2b. A reatividade dos anticorpos monoclonais (MAbs) com diferentes sorovares de Salmonella e outras bactérias foi investigada através de um ELISA indireto. Cinco MAbs reagiram apenas com Salmonella Enteritidis. Dois MAbs apresentaram reação cruzada com antígenos termoextraídos de Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii e Enterobacter aerogenes. O MAb 424H apresentou amplo espectro de reatividade, detectando antígenos de Salmonella pertencentes aos sorogrupos B, C, D, E, e G. O limite de detecção de diferentes sorovares de Salmonella em um ELISA indireto com o MAb 424H variou de 1,0 x 10(4) UFC/mL para Salmonella London a 1,4 x 10(6) UFC/mL para Salmonella Gallinarum e Salmonella Typhimurium. A avaliação do desempenho do ELISA indireto com o MAb 424H na detecção de diferentes sorovares de Salmonella em amostras de carne de frango, mostrou ser possível detectar todos os sorovares após o enriquecimento das amostras, nos três níveis de contaminação utilizados. A análise de alíquotas de amostras de carne de frango não contaminadas artificialmente, feita em paralelo, foi negativa para Salmonella tanto no método convencional quanto no ELISA.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015 La proteína StarD7 (START domain containing 7) pertenece a la superfamilia de proteínas con dominio START, que se caracteriza por unir y/o transportar moléculas lipofílicas, participando en el transporte, metabolismo y señalamiento intracelular lipídico. Mutaciones de alguno de los genes que codifican para estas proteínas con dominio START y/o modificaciones en la expresión están asociadas a procesos patológicos, desórdenes genéticos, enfermedades autoinmunes y tumores. En este trabajo de tesis se realizaron diferentes aproximaciones experimentales a los fines de comprender el rol de StarD7 en la fisiología celular. Se utilizaron modelos de líneas celulares trofoblásticas derivadas de coriocarcinoma (JEG-3 y BeWo), la línea HTR8/SVneo derivada de tejido placental de primer trimestre y otras líneas celulares epiteliales. Inicialmente se realizó en la línea celular JEG-3 un análisis global de la expresión de transcriptos evaluando el efecto del silenciamiento de StarD7. Los resultados demostraron expresión diferencial de un gran número de genes, entre estos: Cnx43, TWIST1, MBD2, TGFRII, ABCG2, THSD7A, SMURF2, KDELC1 y NID1 fueron validados mediante qRT-PCR. Estos hallazgos podrían conducir a identificar genes candidatos dependientes de StarD7 probablemente relacionados a su función celular. Se demostró, en todas las líneas celulares silenciadas con siRNA contra StarD7, una disminución en los niveles del transcripto y la proteína ABCG2 (ATP binding cassette subfamily G member 2) el cual codifica para un transportador de eflujo de lípidos/xenobióticos. Por el contrario se observó que la sobre-expresión de StarD7 aumenta los niveles proteicos de ABCG2, indicando una correlación positiva entre ambas proteínas. Además, las células deficientes de StarD7 presentaron una menor actividad del transportador y mayor susceptibilidad a la droga antineoplásica mitoxantrona. Ensayos de inmunofluorescencia y de microscopía electrónica en células silenciadas contra StarD7 revelaron fragmentación del aparato de Golgi con una marcada alteración en las estructuras subcelulares: con retículo endoplásmico (RE) dilatado, desorden en el sistema de endomembranas y numerosas mitocondrias con morfología anormal localizadas alrededor del núcleo. Estos resultados se acompañaron con una disminución en la biosíntesis de novo de fosfolípidos y cambios en la expresión de proteínas y genes involucrados en la respuesta de estrés del RE. Adicionalmente se demostró que las células silenciadas fueron más sensibles a una injuria estresora con una mayor producción de especies reactivas del oxígeno e incremento en los niveles de la enzima antioxidante hemo oxigenasa-1. Además, se observó que la depleción de StarD7 conduce a una disminución en la proliferación y migración celular, aumentando la adhesión celular. A su vez, en las líneas de origen trofoblástico JEG-3 y BeWo se observó un incremento en la diferenciación celular. Finalmente, ensayos de inmunoprecipitación de proteínas de células que sobre-expresan StarD7 y análisis de espectrometría de masa, permitieron identificar algunas proteínas que interactuarían con StarD7. Entre estas posibles moléculas se ubican ubiquitin ligasas tipo Cul3, proteínas adaptadoras de Cul3 (con dominios KLHL, BTB o KELCH, sugiriendo que StarD7 podría regular la actividad de Cul3. Adicionalmente StarD7 interactuaría con el complejo argonauta GW182 (TNRC6A y B). En resumen en este trabajo de tesis se ha demostrado que la proteína transportadora de lípidos StarD7 participa y contribuye a mantener tanto la homeostasis intracelular así como los procesos fisiológicos fundamentales de proliferación, migración y diferenciación celular. Estos hallazgos fueron confirmados en diferentes líneas epiteliales tanto de origen trofoblástico como no trofoblástico sugiriendo que StarD7 tiene un rol funcional conservado. Flores Martín, Jésica Belén. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Sánchez, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Borioli, Graciela A. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Caputto, Beatriz Leonor. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Jawerbaum, Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina.

Paracoccidioides spp. representa um gênero de fungos termodimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais comum na América Latina. Durante o processo infeccioso proteínas localizadas em membranas celulares são responsáveis por muitos processos essenciais para a sobrevivência do patógeno, como transporte de nutrientes, adesão, sinalização e produção de energia. Basicamente membranas celulares são constituídas de uma bicamada lipídica com proteínas associadas. As proteínas de membranas associam-se a bicamada lipídica através de domínios transmembrana, por adição de uma modificação pós traducional e por meio de interações eletrostáticas. Portanto, o conhecimento da constituição proteica das membranas de Paracoccidioides sp. permite entender alguns dos processos desenvolvidos pelo fungo para sobrevivência dentro do hospedeiro. Desta forma o presente trabalho teve como objetivo à determinação da metodologia para obtenção de proteínas de membranas e a consequente descrição dessas proteínas. Para este fim, duas técnicas de separação e identificação de proteínas foram empregadas. A primeira metodologia baseava-se em eletroforese bidimensional e espectrometria de massas onde o extrato proteico de membranas foi obtido após duas etapas de ultracentrifugação e a segunda metodologia utilizava cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, para esta metodologia três protocolos foram empregados no intuito de obter extratos proteicos de membranas. O primeiro protocolo emprega ultracentrifugação e o segundo e terceiro protocolo empregava ultracentrifugação/sonicação e ultracentrifugação combinado com elevação do pH respectivamente. Após as etapas de padronização do protocolo, o extrato proteico de membranas foi obtido através de ultracentrifugação e solubilização com carbonato de sódio em pH elevado. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada para confirmar a qualidade da amostra enriquecida com a fração de membranas de Paracoccidioides sp.. Posteriormente o extrato proteico de membranas proveniente da metodologia padronizada foi submetido à digestão tríptica e analisado por NanoUPLC-MSE. Análises in silico das proteínas identificadas foram realizadas a fim de se determinar a localização destas proteínas e possíveis associações com as membranas. Do total de proteínas identificadas cento e trinta e três proteínas foram classificadas como pertencentes a membranas celulares de Paracoccidioides sp., oitenta e oito proteínas apresentaram ao menos um domínio transmembrana e treze proteínas, além de domínio transmembrana apresentaram um peptídeo sinal na porção N-terminal da proteína. Diferentes formas de associação com as membranas de Paracoccidioides sp. foram identificadas neste trabalho, incluindo domínio transmembrana, âncora de GPI, prenilação, palmitoilação e miristoilação. A maioria das proteínas integrais de membrana identificadas no proteoma já foram anotadas no genoma deste fungo. Juntos estes resultados demonstram o estabelecimento de um protocolo experimental para a extração de proteínas de membranas de Paracoccidioides spp., bem como identificam as proteínas de frações de membranas do fungo. Paracoccidioides spp. represents thermodimorphic fungi that cause paracoccidioidomycosis, the most widespread systemic mycosis in Latin America. During the establishment of the infection, proteins located in cell membranes are responsible for many essential processes for pathogen survival as transport of nutrients, accession, signaling and energy production. Cell membranes are basically composed of a lipid bilayer with proteins associated. The proteins can be associated with the membrane through transmembrane domains, posttranslational added modifications or through electrostatic interactions. Therefore the knowledge of the constitution of the proteins of membranes is important to understand some processes developed by Paracoccidioides sp. for its growth and survival within the host. To this end, two techniques of separation and identification of proteins were employed. The first methodology used two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry, where the extract of membranes proteins was obtained after steps of ultracentrifugation and the second methodology used liquid chromatography coupled with mass spectrometry, to this methodology three protocols were employed to obtain the extract of membranes proteins. The first methodology employed ultracentrifugation, and the second e third methodology used ultracentrifugation/sonication and ultracentrifugation with elevation of pH respectively. After these steps, the extract of membranes proteins was obtained through of ultracentrifugation and elevation of pH with sodium carbonate. Transmission Electron Microscopy (TEM) was performed to confirm the quality of the sample, a fraction enriched in cell membranes of Paracoccidioides sp.. Posteriorly the proteins obtained by standard methodology were subjected to tryptic digestion and analyzed by NanoUPLC-MSE.. In silico analyzes of the identified proteins were performed to determine the location and possible association of the proteins with the cell membranes. From total of proteins identified, one hundred thirty -three proteins were identified as belonging the cell membranes of Paracoccidioides sp.. Eighty-eight proteins showed at least one transmembrane domain and thirteen identified proteins showed a signal peptide at the N-terminus, beyond the transmembrane domain. Different forms of association of the proteins with membranes of Paracoccidioides sp. were detected, including domain transmembrane, GPI anchor, prenylation, myristoylation, palmitoylation. The most of the of integral membrane proteins identified in proteome were annotated in the genome of Paracoccidioides sp. Together these results show the establishment of an experimental protocol for the extraction of membranes proteins of Paracoccidioides spp., as well identify proteins from membrane fractions this fungus. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Las membranas celulares son estructuras dinámicas complejas decomposición bioquímica muy diversa. Las interacciones específicas lípidolípidoy lípido-proteína pueden generar dominios estables o transientes decomposición y función biológica diferenciales. En este trabajo, abordamos el estudio de la regulación de la actividadde una proteína integral de membrana, la bomba de calcio de membranaplasmática (PMCA) por anfifilos que integran el sistema en el cual se lareconstituye. En micelas de lípidos y detergente, pudimos verificar que laactividad depende de la proporción relativa de estas especies y postulamosun modelo que explica esta dependencia en base al intercambio de anfifilosa nivel del dominio transmembrana. El análisis realizado con diversosmétodos espectroscópicos mostró que los cambios estructurales asociados ala activación por lípidos serían sutiles pero suficientes para transducir unaseñal de activación al dominio citoplasmático de PMCA. Utilizandoespectroscopía de correlación de fluorescencia y la sonda fluorescente Laurdan observamos que la actividad depende además de la fluidez delentorno y del tamaño de las micelas. Para extender este estudio al entornonatural de las proteínas -la membrana celular- evaluamos diversas sondasfluorescentes y pudimos determinar que la sonda C-Laurdan permiteestudiar por microscopía confocal la organización de membranasbiológicas. Cellular membranes are dynamic complex structures with a highlydiverse biochemical composition. Specific lipid-lipid and lipid-proteininteractions can generate transient or stable domains of particularcomposition and biological function. In this work, we study the regulation of the activity of an integralmembrane protein, the plasma membrane calcium pump (PMCA), byphospholipids that make up the reconstitution system. Working in a mixed micelles lipid/detergent system, we verify thatthe activity depends on the relative proportion of these species and weposited a model that explains this relationship by the exchange betweenamphiphiles at the protein transmembrane domain. The analysis performedby spectroscopic methods showed that the structural changes associatedwith the activation by lipids are subtle but enough to transduce anactivation signal to the cytoplasmic domain of PMCA. Using fluorescencecorrelation spectroscopy and the fluorescent probe Laurdan, we observedthat the activity is also related to micelle size and the fluidity of the proteinlipidic microenvironment. To extend this study to the natural environmentof the protein –the cellular membrane- we assayed the performance ofseveral fluorescent probes and we could determine that the probe CLaurdanallows studying the organization of biological membranes byconfocal microscopy. Fil: Dodes Traian, Martín Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Orientador: Lúcia Elvira Alvares Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A correta padronização do corpo do embrião requer a atividade de diferentes vias de sinalização. Dentre elas, uma que se destaca é via de sinalização Wnt de polaridade celular planar (Wnt/PCP), que é responsável pelo controle da polaridade celular e pela organização celular de diversos tecidos nos animais. Uma vez interrompida, a via Wnt/PCP pode causar falhas no fechamento do tubo neural, provocando defeitos congênitos. Em seres humanos, mutações em componentes-chave da via Wnt/PCP como as proteínas codificadas pelos genes Vangl1 e Vangl2 têm sido associadas à graves malformações geradas por falhas no fechamento do tubo neural. Estruturalmente, ambos os genes Vangl1 e Vangl2 codificam proteínas de superfície transmembranares, essenciais para o desenvolvimento apropriado do embrião. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização do padrão de expressão dos genes Vangl1 e Vangl2 durante a embriogênese de Gallus gallus. Ensaios de hibridação in situ em embrião inteiro (whole mount) e cortes em vibratómo foram realizados com a finalidade de estabelecer temporal e espacialmente o padrão de expressão dos genes Vangl1 e Vangl2. Como resultado, observou-se que estes genes são expressos durante as etapas de gastrulação, neurulação e no início da organogênese do desenvolvimento embrionário de Gallus gallus. No início da gastrulação, os genes Vangl1 e Vangl2 possuem domínios de expressão comuns nos embriões de galinha, uma vez que ambos são expressos na linha primitiva, nódulo de Hensen e crescente cardiogênico. Contudo, nossos dados revelaram particularidades na expressão destes genes, uma vez que há uma predominância dos transcritos de Vangl1 na região posterior da linha primitiva, enquanto Vangl2 apresenta uma expressão uniforme ao longo desta estrutura. Em adição, enquanto Vangl1 é expresso na notocorda e em toda a extensão do nódulo de Hensen, Vangl2 é expresso no entorno desta estrutura. Ao longo da neurulação e na organogênese inicial, ambos os genes Vangl são expressos de maneira similar, em domínios que abrangem a placa, as pregas e o tubo neural. Outros importantes domínios de expressão dos Vangl correspondem às vesículas ópticas e óticas, às vesículas encefálicas particularmente na região das flexuras encefálicas, aos diferentes tipos de mesoderma (paraxial, intermediário e lateral) e ao assoalho da faringe. Ao comparar os resultados obtidos por hibridação in situ em galinha ao um levantamento bibliográfico sobre outros vertebrados, observou-se uma sobreposição dos domínios-chave de expressão nos diferentes organismos, demonstrando a conservação filogenética da atividade destes genes e sugerindo uma possível conservação funcional. Desta forma, nossos dados sugerem que os genes Vangl desempenham um importante papel no desenvolvimento embrionário de aves, possivelmente coordenando os movimentos morfogenéticos durante a gastrulação, bem como a formação da placa neural e posterior dobramento e fechamento do tubo neural, além de outros processos da embriogênese de aves Abstract: The correct patterning of the embryo's body requires the activity of different signaling pathways. Among them, one that stands out is the Wnt Planar Cell Polarity Signaling Pathway (Wnt/PCP), which is responsible for controlling the cell polarity and cellular organization of many tissues in animals. Failures in the Wnt/PCP signaling can cause neural tube birth defects. In humans, mutations in key components of the Wnt/PCP as the Vangl1 and Vangl2 molecules were identified in patients with neural tube defects. Structurally, both Vangl1 and Vangl2 genes encode transmembrane surface proteins similar, which are essential to proper development. The present study aimed to characterize the expression pattern of Vangl1 and Vangl2 genes during embryogenesis in Gallus gallus. Whole-mount in situ hybridization assays and vibratome sectioning of embryos were conducted in order to establish the spatial and temporal expression pattern of Vangl1 and Vangl2 genes. Our results showed that these genes are expressed during gastrulation, neurulation and early organogenesis in Gallus gallus. At the onset of Gastrulation, Vangl1 and Vangl2 genes have common areas of expression in chicken embryos, since both are expressed in the primitive streak, Hensen's node and cardiogenic crescent. However, our data showed particularities in the expression of these genes, since there is a predominance of Vangl1 transcripts in the posterior region of the primitive streak while Vangl2 has a uniform expression throughout that structure. In addition, while Vangl1 is expressed in the notochord and in the full length of the Hensen's node, Vangl2 is expressed only around this structure. Throughout neurulation and early organogenesis, both Vangl genes are expressed in a similar manner on the neural plate, neural groove, neural folds and in the neural tube. Other important areas of Vangl expression correspond to optical and otic vesicles, the brain vesicles, the different types of mesoderm (paraxial, intermediate and lateral) and the floor of the pharynx. By comparing the chicken expression of Vangl genes with other vertebrates, we notice that there are overlapping expression patterns among key areas among different organisms, showing a phylogenetic conservation of expression domains and suggesting a possible functional conservation. Overall, our data suggests that Vangl genes play an important role in embryonic development of bird, possibly by coordinating the morphogenetic movements during gastrulation, as well as the formation of neural tube, among other processes during the birds embriogenesis Mestrado Biologia Celular Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Marcelo Lancellotti Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Haemophilus influenzae é uma bactéria causadora de doenças tipicamente associadas ao trato respiratório superior e inferior. Tal bactéria é classificada em linhagens capsuladas e não capsuladas - as não tipadas. As grandes responsáveis por patogenias mais severas são as capsuladas, especialmente as do sorotipo b, a existência de uma vacina para somente esse sorotipo, faz com que ocorra uma emergência de casos com H. influenzae não tipado - NTHi. A crescente resistência a antibióticos dessa bactéria está associada à plasmídios de resistência, bem como sua competência natural. A presença desses patógeno é maior em países nos quais não existe acesso a vacina, devido ao alto custo da mesma, que acabam utilizando antibióticos mais acessíveis como o cloranfenicol no tratamento. Esse trabalho estudou a transferência horizontal do gene ompP2 em diversas cepas de H. influenzae com a ajuda de nanopartículas de óxido de grafeno. Essas nanopartículas mimetizam uma atmosfera rica em partículas suspensas como as grandes cidades e zonas de agricultura precoce, já que, nesses locais ocorrem com maior frequência mutações e adaptações desse patógeno. Quando as nanopartículas encontravam-se no meio de cultura, verificou-se um aumento da taxa de transformação dessas bactérias. Assim como uma modificação no padrão de adesão celular das bactérias mutadas quando comparadas com as selvagens em linhagens celulares distintas e expostas ao antibiótico de resistência, levando a um aumento da taxa de adesão das cepas mutadas com relação às cepas selvagens. Como esse gene é e de possível aquisição entre cepas de H. influenzae em seu ambiente natural seria possível utilizá-lo para obtenção de uma proteína recombinante, com possível antigenicidade. Uma vez que a taxa de adesão aumenta com a presença do mesmo, levando a uma possível nova vacina que também protegeria contra cepas não tipadas e não somente capsuladas Abstract: Haemophilus influenzae is a bacteria that causes diseases typically associated with the upper and lower respiratory tract. Their strains are divided in capsulated and non-capsulated - the non typable. The major responsible for more severe cases are the capsulated types, specially the b type. The existence of a vaccine for the serotype b, allows the emergence of cases of non typable H. influenzae - NTHi. The growing resistance is associated with resistance plasmids, and with its natural competence, that enables the bacteria to acquire DNA fragments between it's' species. Since this pathogen is common in countries that there is no access to this vaccine, therefore the use of accessible and cheaper antibiotics, such as chloramphenicol for treatment is. This work studied the horizontal transference of the ompP2 gene from multiresistant strains of H. influenzae, with the aid of grafen oxide nanoparticles, that mimesis an atmosphere rich in suspended particles, such as great urban areas and ancient agricultural zones. In these environments a great frequency in mutation and adaptations of these bacteria is verified. When we look at the adhesion patterns of these bacteria we can see that it is modified when they are mutated and exposed to the resistance antibiotic. Leading to an augmentation of the adhesion patterns when we compare to the wild strains. Since this gene was present in all strains and it was of easy acquisition between strains, it would be possible to use it to obtain a recombinant protein with likely antigen properties. Because the adhesion tax enhances with the presence of this gene. Leading to a possible new vaccine target, for NTHi and capsulated strains also Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Context Alcoholic liver disease (ALD) is generally associated with iron overload, which may contribute to its pathogenesis, through increased oxidative stress and cellular damage. There are conflicting reports in literature about hemochromatosis (HFE) gene mutations and the severity of liver disease in alcoholic patients. Objectives To compare the prevalence of mutations in the hemochromatosis (HFE) gene between patients with ALD and healthy controls; to assess the relation of HFE mutations with liver iron stores and liver disease severity. Methods Liver biopsy specimens were obtained from 63 ALD patients (during routine treatment) and 52 healthy controls (during elective cholecystectomy). All individuals underwent routine liver function tests and HFE genotyping (to detect wild-type sequences and C282Y, H63D, S65C, E168Q, E168X, V59M, H63H, P160delC, Q127H, Q283P, V53M and W164X mutations). Associations between HFE mutations and risk of excessive liver iron stores, abnormal serum ferritin, liver fibrosis, or necroinflammatory activity were assessed by multivariate logistic regression analysis. Results ALD patients had significantly higher serum ferritin and transferrin saturation than controls (both P Contexto A doença hepática alcoólica (DHA) está geralmente associada à sobrecarga de ferro, que pode contribuir para a sua patogênese, através do aumento do estresse oxidativo e dano celular. As descrições existentes na literatura sobre a associação entre mutações HFE e a gravidade da DHA nem sempre são concordantes. Objetivos Comparar a prevalência de mutações HFE entre um grupo de pacientes com DHA e uma população de controle. Avaliar a relação entre mutações HFE e os depósitos de ferro hepático. Avaliar se a presença dessas mutações está associada com a gravidade da DHA. Métodos Compararam-se 63 pacientes com DHA que efetuaram biopsia hepática com 52 controles saudáveis. A genotipagem HFE (wild type, C282Y, H63D, S65C, E168Q, E168X, V59M, H63H, P160delC, Q127H, Q283P, V53M, W164X) e uma avaliação laboratorial de rotina (incluindo cinética do ferro) foram feitos em todos os indivíduos. Realizou-se regressão logística multivariada nos casos para avaliar se a presença de mutações HFE estava relacionada com risco aumentado de depósitos de ferro hepático aumentados, ferritina sérica anormal, fibrose hepática significativa ou atividade necroinflamatória. Resultados Os pacientes apresentaram ferritina sérica e saturação da transferrina mais elevadas que os controles, mas não existiram diferenças significativas na distribuição de mutações HFE entre pacientes e controles. Considerando apenas os pacientes, o risco relativo de estes apresentarem pelo menos uma mutação HFE e depósitos de ferro hepático significativos foi de 17.23 (CI 95% 2.09-142.34, P = 0.008). Contudo, a presença de pelo menos uma mutação HFE não esteve associada ao risco significativamente aumentado de fibrose ou atividade necroinflamatória significativas. O fator mais determinante para apresentar ferritina sérica acima do normal foi a presença de alcoolismo ativo, com risco relativo de 8.87 (CI 95% 2.11-34.78, P = 0.003). Conclusões Não existiram diferenças na distribuição de mutações HFE entre pacientes com DHA e controles normais. Nos pacientes, o achado de pelo menos uma mutação HFE aumentou o risco de ter depósitos de ferro hepático mais elevados, mas não para ter fibrose ou atividade necroinflamatória significativas.

A promoção do crescimento vegetal pelos ácidos húmicos tem sido atribuída a ações similares a hormônios, devido à promoção do desenvolvimento e proliferação das raízes, resultando numa absorção mais eficiente de água e nutrientes. O objetivo deste trabalho foi analisar as mudanças na arquitetura radicular em plântulas de milho e no perfil de proteínas da membrana plasmática (MP) promovidas pelo tratamento com ácidos húmicos (AH) isolados de vermicomposto (20mg C L-1). O efeito da adição de ácido cítrico (AC), importante ácido orgânico presente nos exudados radiculares, sobre a bioatividade destes AH também foi investigada. Foram analisados o comprimento da raiz principal, o número de sítios de mitose, o número e comprimento de raízes laterais e a área radicular total. Para a análise do perfil protéico, vesículas da MP de células de raízes foram obtidas por fracionamento celular e as proteínas analisadas por eletroforese uni (1D) e bidimensional (2D). Observou-se que a adição de AC (0,005mM) aos AH estimularam a promoção do crescimento das raízes laterais (126%), da área radicular (58%) e do número de raízes laterais (55%) em relação às plantas controle. A atividade da bomba de H+ da membrana plasmática, analisada como marcador bioquímico de indução do mecanismo do crescimento ácido, também foi significativamente estimulada (374%) pela solução húmica suplementada com AC. O perfil protéico da MP revelou uma supressão da expressão das proteínas nesta membrana, induzida pelo tratamento com AH e, na presença de AC, esse efeito foi ainda mais evidente. Os resultados obtidos corroboram o mecanismo proposto para a bioatividade de AH no qual a ação de ácidos orgânicos exudados pelas plantas, tais como o AC, promove o rompimento da associação supramolecular dessas substâncias, tornando as moléculas bioativas presentes nos agregados húmicos mais acessíveis aos receptores celulares das raízes.

A promoção do crescimento vegetal pelos ácidos húmicos tem sido atribuída a ações similares a hormônios, devido à promoção do desenvolvimento e proliferação das raízes, resultando numa absorção mais eficiente de água e nutrientes. O objetivo deste trabalho foi analisar as mudanças na arquitetura radicular em plântulas de milho e no perfil de proteínas da membrana plasmática (MP) promovidas pelo tratamento com ácidos húmicos (AH) isolados de vermicomposto (20mg C L-1). O efeito da adição de ácido cítrico (AC), importante ácido orgânico presente nos exudados radiculares, sobre a bioatividade destes AH também foi investigada. Foram analisados o comprimento da raiz principal, o número de sítios de mitose, o número e comprimento de raízes laterais e a área radicular total. Para a análise do perfil protéico, vesículas da MP de células de raízes foram obtidas por fracionamento celular e as proteínas analisadas por eletroforese uni (1D) e bidimensional (2D). Observou-se que a adição de AC (0,005mM) aos AH estimularam a promoção do crescimento das raízes laterais (126%), da área radicular (58%) e do número de raízes laterais (55%) em relação às plantas controle. A atividade da bomba de H+ da membrana plasmática, analisada como marcador bioquímico de indução do mecanismo do crescimento ácido, também foi significativamente estimulada (374%) pela solução húmica suplementada com AC. O perfil protéico da MP revelou uma supressão da expressão das proteínas nesta membrana, induzida pelo tratamento com AH e, na presença de AC, esse efeito foi ainda mais evidente. Os resultados obtidos corroboram o mecanismo proposto para a bioatividade de AH no qual a ação de ácidos orgânicos exudados pelas plantas, tais como o AC, promove o rompimento da associação supramolecular dessas substâncias, tornando as moléculas bioativas presentes nos agregados húmicos mais acessíveis aos receptores celulares das raízes. The plant growth stimulation by humic acids (HA) has been attributed to a hormone-like effect as promoting the root development and proliferation, resulting in a more efficient water and nutrient absorption. This research aims to investigate how the humic acids isolated from vermicompost (20mg L-1) can modify the root architecture and the plasma membrane (PM) protein patterns in maize roots. It was also analyzed the effect of the citric acid (CA), an organic acid present in root exudates. The changes induced in the corn root system were estimated by measuring the taproot length, the amount of root mitotic sites and lateral roots, and the total root area. Plasma membrane vesicles were purified by cell fractionation and the protein patterns were analyzed by uni (1D) and bidimensional (2D) electrophoresis. The results show that the HA in solution with CA (0.005mM) increases the lateral root growth promotion (126%), the root area (58%), and the number of lateral roots (55%). The activity of the plasma membrane H+ pump, analyzed as a marker of the induction of the acid growth mechanism, was also enhanced (374%) by the humic solution supplemented with CA. Expression of several plasma membrane proteins was inhibited when plants were treated with HA and this effect was more pronounced upon CA supplementation. The obtained results corroborate the proposed mechanism for the HA bioactivity, by which under the action of root-exuded organic acids, such as CA, a disruption of the HA macrostructure is promoted releasing bioactive molecules presented in the humic aggregates, which becomes more accessible to the root cell receptors.

Todas las células, ya sean bacterias, arqueas o eucariotas están delimitadas por membranas. Las membranas biológicas están compuestas principalmente por lípidos estructurados en dos monocapas enfrentadas, por lo que también se les denomina bicapas lipídicas. La membrana, además de definir los límites tanto celulares como organulares y establecer una barrera al tráfico de moléculas de unos compartimentos a otros posee otras funciones importantes para la supervivencia celular, como el transporte selectivo, la producción de la mayoría de energía requerida para los procesos catalíticos y la transducción de señales. 618/5000 All cells, whether bacteria, archaea or eukaryotes are bounded by membranes. Biological membranes are composed mainly of structured lipids in two facing monolayers, so they are also called lipid bilayers. The membrane, in addition to defining both cellular and organ limits and establishing a barrier to the traffic of molecules from one compartment to another, has other important functions for cell survival, such as selective transport, energy production required for catalytic processes and signal transduction.

Este trabalho teve como objetivo caracterizar o perfil das proteínas da membrana externa (PMEs) da Leptospira interrogans sorovariedades Hardjobovis, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Wolffi; produzir e testar a proteína LipL32 frente ao soro de animais naturalmente infectados.Foram utilizadas técnicas de extração da membrana externa com Triton X114 e precipitação das proteínas com acetona, clonagem e subclonagem do gene LipL32, otimização do gene LipL32 para códons próprios da E. coli, construção do gene LipL32 de forma sintética,produção da proteína LipL32 e testes Western blot com a proteína recombinante LipL32. Na eletroforese com gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes as bandas de massa molecular iguais a 22, 29, 32, 36, 41 e 48 KDa apresentaram-se como os principais componentes das PME das quatro sorovariedades testadas. Nos testes de Western blot as bandas com massas moleculares iguais a de 22, 29, 32, 41, 48, 52 e 75 KDa reagiram em todas as sorovariedades testadas. A expressão do gene sintético LipL32 foi realizada com sucesso, porém não foram obtidos níveis de expressão satisfatórios. A proteína LipL32recombinante foi reagente em todos os testes de Western blot realizados. This work aimed to study the profile of outer membrane proteins (OMPs) of Leptospira interrogans serovars Hardjobovis, Icterohaemorrhagiae, Pomona and Wolffi, express a sintetic gene LipL32 and test the LipL32 protein front of serum from naturally infected bovine. Techniques were used to extract the outer membrane with Triton X114 and precipitationwith acetone, cloning and subcloning of the gene LipL32, optimization of the LipL32 gene for expression in E. coli, construction of the LipL32 synthetic gene, expression and testing of the LipL32 protein in Western blot. In SDS-PAGE bands of molecular mass to 22, 29, 32, 36, 41 and 48 kDa proved to be the major components of outer membrane proteins of the four serovars tested. In the Western blot bands with molecular mass to 22, 29, 32, 41, 48, 52 and 75 kDa reacted in all the serovars tested. The LipL32 protein expression from synthetic gen was successful but did not achieve high levels of expression. Protein LipL32 was reactive in allWestern blot tests performed.

Cerebrovascular and cardiovascular diseases are the leading causes of death and disability worldwide. They are complex disorders resulting from the interplay of genetic and environmental factors, and may share several susceptibility genes. Several recent studies have implicated variants of the Kalirin (KALRN) gene with susceptibility to cardiovascular and metabolic phenotypes, but no studies have yet been performed in stroke patients. KALRN is involved, among others, in the inhibition of inducible nitric oxide synthase, in the regulation of ischemic signal transduction, and in neuronal morphogenesis, plasticity, and stability. The goal of the present study was to determine whether SNPs in the KALRN region on 3q13, which includes the Ropporin gene (ROPN1), predispose to ischemic stroke (IS) in a cohort of Portuguese patients and controls. We genotyped 34 tagging SNPs in the KALRN and ROPN1 chromosomal region on 565 IS patients and 517 unrelated controls, and performed genotype imputation for 405 markers on chromosome 3. We tested the single-marker association of these SNPs with IS. One SNP (rs4499545) in the ROPN1-KALRN intergenic region and two SNPs in KALRN (rs17286604 and rs11712619) showed significant (P < 0.05) allelic and genotypic (unadjusted and adjusted for hypertension, diabetes, and ever smoking) association with IS risk. Thirty-two imputed SNPs also showed an association at P < 0.05, and actual genotyping of three of these polymorphisms (rs7620580, rs6438833, and rs11712039) validated their association. Furthermore, rs11712039 was associated with IS (0.001 < P < 0.01) in a recent well-powered genomewide association study (Ikram et al. 2009). These studies suggest that variants in the KALRN gene region constitute risk factors for stroke and that KALRN may represent a common risk factor for vascular diseases.