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Mycoplasma hyopneumoniae is one of the most challenging respiratory pathogens involved with swine pneumonia worldwide, responsible for a chronic infection with high morbidity, which predisposes secondary bacterial infections in growing and finishing pigs. Advances in diagnostic techniques allowed identification of genetic characteristics associated with high antigenic and proteomic variability among bacterial strains. This study aimed to evaluate the genetic diversity of M. hyopneumoniae strains in lungs with pneumonic lesions obtained from 52 pig farms located in Minas Gerais, one of the largest swine production states in Brazil. Genotyping was performed using multilocus variable number of tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA), targeting two loci encoding P97 and P146 adhesins VNTR. The results showed that this agent is widely disseminated in pig farms and there is a high polymorphism of M. hyopneumoniae variants circulating in the state of Minas Gerais. Different M. hyopneumoniae genotypes are randomly distributed in several regions of the state, with no specific geographic population structure pattern. M. hyopneumoniae association with viral agents was sporadic (3.17% with Influenza A and 1.9% with PCV2). RESUMO: Mycoplasma hyopneumoniae é um dos patógenos respiratórios mais desafiadores envolvidos com pneumonia suína em todo o mundo. É responsável por uma infecção crônica de alta morbidade, que predispõe a infecções bacterianas secundárias nas fases de crescimento e terminação. Avanços nas técnicas diagnósticas permitiram a identificação de características genéticas do agente, associadas à alta variabilidade antigênica e proteômica entre cepas. Este estudo teve como objetivo examinar a ocorrência e diversidade genética de cepas de M. hyopneumoniae em pulmões com lesões pneumônicas em 52 granjas de suínos no estado de Minas Gerais, um dos maiores estados produtores de suínos do Brasil. A genotipagem foi realizada utilizando a técnica de “multilocus variable number of tandem repeat analysis” (VTNR/MLVA), usando dois loci que codificam VNTR das adesinas P97 e P146. Os resultados mostraram que esse agente está amplamente disseminado em granjas de suínos e que existe alto polimorfismo das variantes de M. hyopneumoniae circulando no estado de Minas Gerais. Diferentes genótipos de M. hyopneumoniae estão distribuídos aleatoriamente em várias regiões do estado, sem um padrão de estrutura populacional e geográfica específico. Associação de M. hyopneumoniae e agentes virais foi esporádica (3,17% com Influenza A e 1,9% com PCV2).

Mycoplasma hyopneumoniae é o patógeno primário da patologia conhecida como pneumonia enzoótica, uma doença respiratória crônica altamente contagiosa que acomente suínos, caracterizada por alta morbidade e baixa mortalidade. O agente etiológico se encontra na mucosa respiratória, aderido ao epitélio ciliado da traquéia, brônquios e bronquíolos. As infecções ocorrem em todo o mundo e causam grandes impactos econômicos para a indústria de suínos. O presente trabalho teve objetivo realizar uma revisão sobre as estratégias de controle e prejuízos econômicos causados pelo M. hyopneumoniae, para isso foi realizadas pesquisas baseadas em informações adquiridas de artigos científicos, livros, teses e dissertações sobre o M. hyopneumoniae. A transmissão do agente ocorre principalmente pelo contato direto das secreções respiratórias de um suíno portador com os suscetíveis. A doença é mais observada nos animais em crescimento e terminação. Após a infecção ocorre destruição do aparelho mucociliar, juntamente com a alteração da resposta imune, aumenta a suscetibilidade de suínos afetados a infecções secundárias. Os sinais clínicos se baseiam em tosse seca, corrimento nasal, baixo desenvolvimento de rebanho, pelo sem brilho e desuniformidade de escore entre leitões. A gravidade das lesões depende de fatores ambientais, manejo e imunidade do hospedeiro. Existem vários testes de diagnóstico que podem detectar o agente, a escolha do teste depende das circunstâncias clínicas do paciente e da propriedade, sendo os mais utilizados o teste de Reação de polimerase em cadeia (PCR) e ELISA. A vacinação é comumente utilizada, estudos observam redução de cargas bacterianas e queda na gravidade dos sinais clínicos em suínos vacinados, atualmente as vacinas disponíveis são econômicas e de fácil acesso, mas alguns estudos concluíram que nem a vacinação nem medicação preventiva podem impedir que a infecção e adesão de M. hyopneumoniae às células ciliadas do trato respiratório ocorra. são necessárias pesquisas visando melhorar a compreensão dos mecanismos de ação do microrganismo e da interação do mesmo com o hospedeiro e com outros patógenos, pois essas pesquisas podem auxiliar no desenvolvimento e aprimoramento de métodos de controle, como o desenvolvimento de novas vacinas que conferem melhor proteção ao animal.

Gilts represent a group risk for Mycoplasma hyopneumoniae vertical transmission in swine herds. Therefore, parity segregation can be an alternative to control M. hyopneumoniae infections. The study evaluated the effect of parity segregation on M. hyopneumoniae infection dynamics and occurrence and severity of lung lesions at slaughter. For that, three multiple site herds were included in the study. Herd A consisted of the farm where gilts would have their first farrowing (parity order (PO) 1). After the first farrowing PO 1 sows were transferred to herd B (PO2-6). Herd C was a conventional herd with gilt replacement (PO1-6). Piglets born in each herd were raised in separated nursery and finishing units. Sows (n = 33 (A), 37 (B), 34 (C)) in all herds were sampled prior to farrowing and piglets (n = 54 (A), 71 (B), 66 (C)) were sampled longitudinally at 21, 63, 100, 140 days of age and at slaughter for M. hyopneumoniae detection by PCR and lung lesions scoring. M. hyopneumoniae prevalence in sows did not differ among herds. Prevalence of positive piglets was higher at weaning in the PO1 herd (A) (P < 0.05). However, prevalence of positive pigs from 100 days of age to slaughter age was higher in the PO2-6 herd (B) (P < 0.05). Lung lesion occurrence and severity were higher in herd B. The authors suggested that the lack of a proper gilt acclimation might have influenced the results, leading to sows being detected positive at farrowing, regardless of the parity. RESUMO: As leitoas consistem em um grupo de risco na transmissão vertical de Mycoplasma hyopneumoniae dentro do sistema de produção de suínos. Dessa forma, a segregação de partos poderia ser utilizada como alternativa para controlar as infecções por M. hyopneumoniae. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da segregação de partos sobre a dinâmica de infecção de M. hyopneumoniae e a ocorrência e severidade das lesões pulmonares ao abate. Para isso três sistemas de produção de suínos com três sítios cada foram incluídos no estudo. A granja A consistia da unidade onde as leitoas tem o primeiro parto, ou seja, alojava somente de fêmeas de ordem de parto 1 (Granja OP1). Após o primeiro parto as fêmeas OP1 foram transferidas para a granja B (Granja OP2-6), ou seja, consistia de fêmeas de ordem de parto 2 a 6, e a granja C consistiu em uma granja convencional com reposição de leitoas (Granja OP1-6), com fêmeas de ordem de parto 1 a 6. Os leitões nascidos de cada granja foram transferidos e criados em creches e terminações segregadas. As matrizes (n = 33 (A), 37 (B), 34 (C)) de todas as granjas do estudo foram amostradas previamente ao parto e os leitões (n = 54 (A), 71 (B), 66 (C)) foram amostrados longitudinalmente aos 21, 63, 100 e 140 dias de idade e ao abate. Em todos os momentos de coleta, as amostras foram avaliadas por PCR para detecção de M. hyopneumoniae. As lesões pulmonares foram avaliadas e escores de lesão foram atribuídos ao abate. A prevalência de matrizes positivas para M. hyopneumoniae não diferiu entre as granjas (P > 0,05). A prevalência ao desmame foi maior na granja A (OP1) (P < 0,05). No entanto, dos 100 dias de idade até o abate a prevalência de leitões positivos para M. hyopneumoniae foi maior na granja B (OP2-6) (P < 0,05). A ocorrência e severidade de lesões pulmonares foram maiores na granja B. Os autores sugerem que a falta de uma aclimatação adequada das leitoas pode ter influenciado nos resultados, levando à detecção de matrizes positivas ao parto, independente da ordem de parto.

Submitted by Marcela Manduca Ferreira (marcela.manduca@unesp.br) on 2020-12-01T22:02:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Marcela.pdf: 975890 bytes, checksum: bef78c2424fab2a98adef3f69005d02b (MD5) Rejected by Laudicélia Martins Arantes (lm.arantes@unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: 1 - Segundo a CAPES (Portaria nº 206, de 4 de setembro de 2018), o agradecimento deve conter exatamente a seguinte redação: O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. 2 - Seu trabalho está com as linhas enumeradas. Favor retirar enumerações de linha 3 - Há divergência com seu nome na ficha catalográfica e no repositório. Se precisar, entre em contato: 16 992996148 - Laudicélia Agradecemos a compreensão. on 2020-12-02T11:47:06Z (GMT) Submitted by Marcela Manduca Ferreira (marcela.manduca@unesp.br) on 2020-12-02T23:32:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Marcela.pdf: 976335 bytes, checksum: 0cc59671ba49fab19f6420e0ff136cc8 (MD5) Approved for entry into archive by Laudicélia Martins Arantes (lm.arantes@unesp.br) on 2020-12-03T11:47:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferreira_mm_me_jabo_int.pdf: 893827 bytes, checksum: 88bcdfd3a7b94dac416d4915eac13cbc (MD5) Made available in DSpace on 2020-12-03T11:47:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferreira_mm_me_jabo_int.pdf: 893827 bytes, checksum: 88bcdfd3a7b94dac416d4915eac13cbc (MD5) Previous issue date: 2020-05-29 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Poucos estudos sobre a ocorrência de coinfecção entre Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) e outras espécies de micoplasmas – Mycoplasma hyorhinis (Mhr) e Mycoplasma flocculare (Mfloc) em lesões pulmonares de suínos foram registrados. A correlação entre a coinfecção por micoplasmas e o grau de lesões macroscópicas de consolidação pulmonar (LMCP) ainda não havia sido explorada no Brasil. Este trabalho teve como objetivo a detecção e quantificação de Mhyo, Mhr e Mfloc em LMCP de suínos ao abate. Foram selecionados 400 pulmões de suínos (idade média de 23-25 semanas), os quais foram divididos em cinco grupos (n=80), de acordo com o grau de lesões de consolidação pulmonar crânio-ventral, e coletados no momento do abate, em um frigorífico localizado na cidade de Guariba – SP. A detecção e quantificação dos micro-organismos foram realizadas por meio de qPCR multiplex com sonda de hidrólise. Diferenças estatísticas entre os grupos e a comparação entre os mesmos foram avaliadas, respectivamente, pelo teste de Kruskal-Wallis (p

Submitted by Maria Eugênia Silveira Ferraz (mariaeugeniaferrazz@gmail.com) on 2020-09-22T11:38:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Maria Eugênia Ferraz.pdf: 954014 bytes, checksum: d96ecd7660cbd2491d3a85466169c454 (MD5) Rejected by Adriana Helena Vitta Zoratti (adriana.zoratti@unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: 1. A ficha catalográfica um item obrigatório que contém as informações fundamentais de um documento, tais como: autor, título, local, data, assunto, número de folhas, etc. O novo sistema de geração automática de ficha catalográfica está disponível no link: 2. A ficha catalográfica e o certificado de aprovação devem ser inseridos no mesmo arquivo de sua tese, seguindo a ordem (segundo as "normas para elaboração de dissertação e tese dos programas de pós-graduação", disponível na página da Pós-graduação): - primeira página; - página de rosto; - ficha catalográfica; - certificado de aprovação. Agradecemos a compreensão on 2020-09-22T16:27:24Z (GMT) Submitted by Maria Eugênia Silveira Ferraz (mariaeugeniaferrazz@gmail.com) on 2020-09-23T17:55:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final ME.pdf: 915480 bytes, checksum: 4a90a3e740c8d6eb0b8c9c3efa4998bc (MD5) Approved for entry into archive by Laudicélia Martins Arantes (lm.arantes@unesp.br) on 2020-09-23T18:22:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferraz_mes_me_jabo.pdf: 915480 bytes, checksum: 4a90a3e740c8d6eb0b8c9c3efa4998bc (MD5) Made available in DSpace on 2020-09-23T18:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferraz_mes_me_jabo.pdf: 915480 bytes, checksum: 4a90a3e740c8d6eb0b8c9c3efa4998bc (MD5) Previous issue date: 2020-03-13 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O objetivo deste estudo foi medir o impacto na produtividade e as consequentes perdas econômicas relacionadas a lesões pulmonares causadas por Mycoplasma hyopneumoniae. Quinhentos suínos de terminação, foram selecionados e pesados no início (75 dias) e no final da fase (180 dias) para avaliar o ganho médio diário (GPD). Esses animais foram avaliados no abate e as amostras coletadas para análise laboratorial, para confirmar a presença de DNA e/ou anticorpos do Mycoplasma hyopneumoniae. Os pulmões de cada suíno foram examinados e, com base na gravidade das lesões macroscópicas, os animais foram classificados em quatro grupos: Grupo 1 - animais sem lesões macroscópicas; Grupo 2 - 0,1 - 5% de lesões; Grupo 3 - 5,1 - 15% de lesões; Grupo 4 - >15,1% de lesões. Quatrocentos e oitenta e seis pulmões foram examinados e 68,5% (n=333) apresentaram lesões pulmonares macroscópicas. Todos os animais com lesões foram positivos para Mycoplasma hyopneumoniae no ELISA e no qPCR. Modelos de regressão linear (proc Glimmix) foram realizados no SAS para estimar o efeito do escore das lesões macroscópicas pulmonares no ganho de peso diário dos suínos em terminação. Múltiplas comparações entre os grupos de escores de lesões foram realizadas usando p 15.1% of lesions. Fourhundred eighty-six lungs were examined and 68.5% (n=333) had macroscopic lung lesions. All pigs with lesions were positive to Mycoplasma hyopneumoniae in ELISA and qPCR. Linear mixed regression models (proc Glimmix) were performed on SAS to estimate the effect of macroscopic lung lesion scores on the average daily gain of finishing pigs. Multiple comparisons between lesion score groups were performed using p

Submitted by Thaís Gasparini Baraldi (thaisbaraldi@hotmail.com) on 2018-07-30T12:48:45Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Thaís Gasparini Baraldi.pdf: 2124455 bytes, checksum: 3ae1f3777993ca75a72f8e3a532564ea (MD5) Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-31T10:52:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 baraldi_tg_me_jabo_par.pdf: 1867332 bytes, checksum: b788aa00a0f8d9de0158945c4fb00d11 (MD5) Made available in DSpace on 2018-07-31T10:52:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 baraldi_tg_me_jabo_par.pdf: 1867332 bytes, checksum: b788aa00a0f8d9de0158945c4fb00d11 (MD5) Previous issue date: 2018-06-22 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Foi realizado um estudo em 21 granjas de suínos de ciclo completo para avaliar as relações entre os resultados sorológicos de patógenos envolvidos em doenças respiratórias, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae e vírus da influenza suína, e índice de tosse, escore de pneumonia e pleurite. A amostragem para testes sorológicos foi realizada em suínos de creche, crescimento, terminação e abate e exame de tosse em animais crescimento e terminação. Análises de lesões de consolidação pulmonar sugestivas de pneumonia enzoótica e pleurite foram realizadas no abate. As características dos rebanhos foram acessadas por um formulário aplicado aos produtores. Títulos de anticorpos contra o Mycoplasma hyopneumoniae e vírus da influenza suína aumentaram durante as fases de criação, com maiores prevalências em suínos abatidos (> 40%), por outro lado, a maioria dos rebanhos (14/21) não apresentaram nenhum animal soropositivo para Actinobacillus pleuropneumoniae nesta idade. Lesões de pleurite e de consolidação pulmonar foram registradas em 9,03% e 72,4% dos 908 pulmões avaliados, respectivamente. As análises histopatologicas das lesões pulmonares de consolidação revelaram broncopneumonia supurativa em quase metade dos pulmões (48,9%). Análises de regressão foram realizadas para identificar fatores de risco de índice de tosse, pleurite, lesões de consolidação pulmonar e resultados sorológicos de Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae e vírus da influenza suína. A soroprevalência de Mycoplasma hyopneumoniae associou-se ao uso do manejo all-in-all-out em barracões de creche, a soroprevalência de Actinobacillus pleuropneumoniae associou-se à pleurite, e a presença de índice de tosse em suínos em crescimento associou-se à soropositividade de influenza suína em leitões de creche. A study was carried out in 21 one-site production system in southeast Brazilian pig herds to assess the relationships between serological results of pathogens involved in respiratory diseases, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae and swine influenza virus, cough index, pneumonia score and pleuritis. Sampling for serological tests were carried out at nursering, growing, finishing and slaughtered pigs, and cough examination on growing and finishing pigs. Analyses of cranio-ventral consolidation lesions (EP-like lesions) suggestive of enzootic pneumonia and pleuritis were performed at slaughter. Herd characteristics were obtained using questionnaire asked to farmers. Antibody titers to Mycoplasma hypneumoniae and swine influenza virus increased throughout the raising phases with higher prevalence in slaughtered pigs (> 40%). On the other hand Actinobacillus pleuropneumoniae presented most of herds (14/21) with no seropositive animal. Pleuritis lesions and EP-like lesions were recorded in 9.03% and 72.4% of 908 evaluated lungs, respectively. The hystopatological of EP-lung lesions reveled suppurative bronchopneumonia in almost half of lungs (48.9%). Regression analysis were conducted to identify risk factors for cough index, pleuritis, EP-like lesions, serological results. Mycoplasma hyopneumoniae seroprevalence was associated with use of all-in-all-out management in nursery pigs, Actinobacillus pleuropneumoniae seroprevalence were associated with pleuritis and the presence of cough index in growing pigs associated with swine influenza seropositivity in nursery pigs. 2015/25318-9

RESUMODiversidade genética de Mycoplasma hyopneumoniae tem sido relatada em análise múltipla de repetições em tandem em número variável (MLVA). O objetivo deste estudo foi descrever a distribuição espacial e a heterogeneidade genética de tipos de M. hyopneumoniae no Brasil, bem como investigar a correlação entre regiões de repetição 1 (RR1) e 3 (RR3) de duas adesinas importantes (P97 e P146). Foram identificados 39 tipos de MLVA baseados no número de repetições em tandem em P97 RR1 e RR3 P146. A correlação negativa significativa (Spearman's rho = -0,26; P = 0,022) entre P97 RR1 e RR3 P146 foi observada, o que sugere um possível mecanismo compensatório que permitiria a bactéria manter a sua capacidade de adesão. Os resultados contribuem para compreender a epidemiologia das M. hyopneumoniae no quarto maior país produtor de suínos do mundo.

Foram estudados 33 surtos de pneumonia em bovinos jovens na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico (LRD) da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) entre os anos de 2000 e 2011. Foram diagnosticados 18 surtos de pneumonia (54,54%) em bovinos de raças leiteiras, Holandês ou Jersey e 13 surtos (39,39%) em gado de corte ou cruzas de gado de corte. A morbidade variou entre 0,06%-100% e a mortalidade foi de 0,06%-34,6%. A doença ocorreu igualmente em todas as estações do ano e foi mais frequente em bezerros de 1-3 meses totalizando 13 surtos. Sete surtos ocorreram em bovinos entre 4-6 meses, sete entre 7-12 meses e seis surtos ocorreram em bezerros de 1-29 dias. Pneumonia enzoótica pela infecção pelo vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) com lesões histológicas de broncopneumonia, pneumonia intersticial e presença de células sinciciais foi mais frequente em bovinos de raças de corte com dez surtos (58,8%); seis surtos dessa enfermidade ocorreram em raças de leite (35,2%). O diagnóstico foi confirmado por imuno-histoquímica em sete casos. Os sinais clínicos da maioria dos casos de pneumonia observados caracterizaram-se por dispneia, emagrecimento, apatia, tremores, bruxismo, desidratação, respiração ruidosa, tosse, corrimento nasal seroso ou mucopurulento, decúbito e morte. As lesões macroscópicas caracterizaram-se por presença de áreas de consolidação vermelho-escuras, edema e enfisema nas regiões crânio-ventrais dos lobos pulmonares cardíaco e apical ou pneumonia intersticial com distribuição difusa, edema e enfisema. Histologicamente, as lesões pulmonares eram variáveis. Broncopneumonia necrossupurativa difusa acentuada com hiperplasia de pneumócitos tipo II e edema intersticial e alveolar foi observada em 15 casos. Os resultados deste trabalho demonstram que as pneumonias são importantes causas de perdas econômicas em bovinos jovens na região de influência do LRD. Deve ser destacado que a pneumonia enzoótica devido a infecção pelo BRSV é importante tanto em bovinos de corte como de leite independente da forma de criação.

Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the Porcine Enzootic Pneumonia. However, this mycoplasma can be detected in healthy and symptomatic pigs, that difficults the conclusion for the etiology of this disease. In the present study we aimed to detect, quantify and do molecular analyses of M. hyopneumoniae strains in respiratory clinical samples recovered from healthy pigs and from those with pneumonia or other respiratory symptoms. The analytical sensitivity and specificity of PCR assays directed to Mollicutes detection and porcine mycoplasmas identification in clinical samples were evaluated. The identification of M. hyopneumoniae in the samples was performed using different molecular approaches, Multiplex PCR, Real Time PCR and Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat amplification. Molecular characterization of the strains was achieved by determining and comparing the VNTR copy number directly in the samples. The highest number of samples positive to M. hyopneumoniae was identified by the multilocus VNTR amplification assay using labeled primers, followed by capillary electrophoresis. The highest concentration of M. hyopneumoniae was detected in pneumonic lungs (2, 3 * 108 genome copies /mL). The VNTR copy number analysis demonstrated that despite the high genetic variability of the M. hyopneumoniae strains, predominant strains in the swine farms could be identified by means of the VNTR copy number analysis of P97R1 and P146R3. (English) Molecular differences among Mycoplasma hyopneumoniae strains present in pneumonic lungs of swine have been largely studied. However, no comparative studies concerning the strains present in apparently healthy pigs have been carried out. This study aimed to detect, quantify and perform molecular analysis of M. hyopneumoniae strains in pig lungs with and without pneumonic lesions. The detection of M. hyopneumoniae was performed using multiplex PCR (YAMAGUTI, 2008), real-time PCR (STRAIT et al., 2008) and multiple VNTR amplification (VRANCKX et al., 2011). Molecular characterization of the strains was achieved by analysis of the VNTR copy number in P97R1, P146R3, H2R1 and H4. M. hyopneumoniae was detected in samples from healthy and pneumonic pigs and the amount of M. hyopneumoniae positive samples detected varied with the type of assay. The greater number of positive samples was identified by the multiple VNTR amplification combined with capillary electrophoresis. Using real-time PCR, 4.9*104 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in apparently healthy lungs. A mean quantity of 3.9*106 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in pneumonic lungs. The analysis of VNTR copy number demonstrated a high genetic variability of the M. hyopneumoniae strains present in apparently healthy and pneumonic lungs. Strains having 3 VNTR copy number in P97R1, were detected only in pneumonic lungs and strains having 40 and 43 VNTR copy number in P146R3 were detected only in apparently healthy lungs. Despite the genetic variability of M. hyopneumoniae, predominant strains in the swine farms could be identified. As diferenças moleculares entre as estirpes de Mycoplasma hyopneumoniae presentes em pulmões de suínos com pneumonia tem sido estudadas. Porém, estudos comparativos relativos as estirpes presentes nos suínos aparentemente saudáveis não foram levados a cabo. O objetivo do estudo foi a detecção, quantificação e analise molecular de M. hyopneumoniae nos pulmões suínos com e sem lesões pneumônicas. Para a detecção de M. hyopneumoniae usaramse o PCR Multiplo (YAMAGUTI, 2008), o PCR a Tempo Real (STRAIT et al., 2008) e a amplificação de múltiplo VNTR (VRANCKX et al., 2011). A caracterização molecular das estirpes foi realizada mediante a análise do número de copias de VNTR em P97R1, P146R3, H2R1 e H4. O M. hyopneumoniae foi detectado em amostras de suínos saudáveis e pneumônicos e a quantidade de M. hyopneumoniae nas amostras positivas variou com o tipo de ensaio. O maior número de amostras positivas foi identificado pela amplificação de múltiplas VNTR combinado com a eletroforese de capilares. Usando o PCR a Tempo Real, 4.9*104 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foram detectadas em pulmões aparentemente saudáveis. Uma quantidade média de 3.9*106 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foi detectada em pulmões pneumônicos. A análise do número de copias de VNTR demonstrou uma elevada variabilidade.

To determine the morphological differences in the epithelium of the airways of recovered and susceptible pigs after Mycoplasma hyopneumoniae challenge, twenty-four 4-week-old M. hyopneumoniae-free pigs were intratracheally inoculated with 107ccu/ml of a pure low-passaged culture of the P5722-3 strain of M. hyopneumoniae challenge material. Eight pigs (group I) were challenged at the beginning of the experiment and rechallenged 3 months later. Group II pigs were also challenged at the beginning of the experiment and necropsied 3 months later. Group III pigs were challenged at the same time as the rechallenge of group I pigs. Eight nonchallenged pigs served as controls (group IV). Three days after the second challenge of group I and the first challenge of group III, and every 3 and 4 days thereafter, two pigs from each group were euthanatized by electrocution and necropsied. Samples of bronchi and lung tissue were examined using light and electron microscopy (SEM and TEM). Macroscopic lesions were observed in the lungs of all group III pigs (average = 4.74%) and were characterized by purple-red areas of discoloration and increased firmness affecting the cranioventral aspect of the lungs. Macroscopic lesions of pneumonia in groups I and II were minimal (less than 1%). There were no gross lesions of pneumonia in control (group IV) pigs. Microscopic lesions were characterized by hyperplasia of the peribronchial lymphoid tissue and mild neutrophilic infiltrates in alveoli. Electron microscopy showed patchy areas with loss of cilia and presence of leukocytes and mycoplasmas in bronchi of susceptible pigs (group III). The bronchial epithelium of rechallenged (group I), recovered (group II), and control (group IV) pigs was ultrastructurally similar indicating recovery of the former two groups. Although mycoplasmas were seen among cilia, a second challenge on pigs of group I did not produce another episode of the disease nor did it enhance morphological changes, suggesting that those pigs could become carriers of M. hyopneumoniae.Para determinar as diferenças morfológicas no epitélio das vias aéreas de suínos suscetíveis e recuperados da infecção por Mycoplasma hyopneumoniae, 24 leitões com 4 semanas de idade, livres de infecção por M. hyopneumoniae, foram inoculados intratraquealmente com material contendo 107ccu/ml de cultura pura da cepa P5722-3 de M. hyopneumoniae. Oito leitões (grupo I) foram inoculados no início do experimento e reinoculados 3 meses mais tarde, após apresentarem a doença e terem se recuperado. Os oito leitões do grupo II foram também inoculados no início do experimento e necropsiados 3 meses depois. Os leitões do grupo III foram inoculados ao mesmo tempo da reinoculação dos leitões do grupo I. Oito leitões não inoculados serviram como controles (grupo IV). Três dias após a reinoculação dos leitões do grupo I e a inoculação do grupo III e, a partir disso, a cada 2 dias, dois leitões de cada grupo foram sacrificados e necropsiados. Segmentos de brônquios e pulmão foram examinados em microscopia ótica e microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Lesões macroscópicas foram observadas nos pulmões de todos os leitões do grupo III (média: 4.74% da superfície) e eram caracterizadas por áreas firmes e avermelhadas nas porções cranioventrais. Lesões macroscópicas semelhantes foram mínimas em pulmões de leitões dos grupos I e II (menos de 1%) e ausentes no grupo IV. As lesões microscópicas consistiam de hiperplasia do tecido linfóide peribronquial e infiltrado neutrofílico leve nos alvéolos. Na microscopia eletrônica havia lesões focais no epitélio ciliado, caracterizadas por perda de cilios e descamação de células, e presença de leucócitos e micoplasmas nos brônquios de leitões suscetíveis (grupo III). O epitélio bronquial de leitões reinoculados (grupo I), recuperados (grupo II) e controles (grupo IV) era ultraestruturalmente similar, indicando recuperação nos primeiros dois grupos. Embora micoplasmas tenham sido observados entre cilios, uma segunda inoculação em leitões do grupo I não causou outro episódio da doença nem aumentou as alterações morfológicas nos brônquios, sugerindo que esses leitões podem se tornar portadores de micoplasmas.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_nathalia_assis_brasil_resumo.pdf: 8786 bytes, checksum: 29067eed0bac7715d60b7e64baf7f05f (MD5) Previous issue date: 2013-12-07 This study aimed to survey the major diseases that affect calves under one year of age in area of influence of the Regional Diagnostic Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Pelotas, from 2000 to 2011. The results of this study are presented in the form of two scientific papers. The first one refers to the data of a general survey of the main causes of death in this animal category, establishing the epidemiological conditions in which they occur. The second paper describes the epidemiology, clinical signs and pathology of respiratory diseases occuring in the same animal category. Immunohistochemical of cases of enzootic pneumonia suspected to be caused by bovine respiratory syncytial virus were also performed. Este trabalho teve como objetivo realizar um levantamento das principais enfermidades que acometem bezerros até um ano de idade na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas no período de 2000 a 2011. O trabalho está apresentado na forma de dois artigos científicos. O primeiro deles refere-se os dados de um levantamento geral das principais causas de morte nesta categoria animal, estabelecendo-se as condições epidemiológicas em que as mesmas ocorrem. O segundo trabalho apresenta a epidemiologia, sinais clínicos e patologia das pneumonias que ocorrem nesta mesma categoria animal. Foi realizado também um estudo imuno-histoquímico dos casos de pneumonia enzoótica suspeitos de serem causados pelo vírus respiratório sincicial bovino.

Mycoplasma hyopneumoniae is a species of bacteria known to cause the disease Porcine Enzootic Pneumonia, a highly contagious and chronic disease affecting pigs (Whittlestone, 1979). As with other mollicutes, M. hyopneumoniae is gram positive, small in size (400 - 1200 nm), has a small genome (893 - 920 kilo-base pairs (kb)) and lacks a cell wall (Tajima et al., 1982). It is considered to be difficult to grow in laboratories due to its complex nutritional requirements and the high chances of contamination associated with mycoplasma culture. To successfully grow the bacterium, an environment of 5-10% carbon dioxide is required, and the medium should demonstrate an acid colour shift. Mycoplasma hyopneumoniae é uma espécie de bactérias conhecidas como provocando a doença suína Pneumonia Enzoï, altamente contagiosa e doença crônica que afeta suínos (Whittlestone, 1979). Como com outros mollicutes, M. hyopneumoniae é gram positivo, pequeno no tamanho (400 - 1200 nm), tem um genoma pequeno (893 - 920 quilo-pares de bases (kb)) e carece de uma parede da célula (Tajima et al., 1982). Ele é considerado difícil crescer em laboratório, devido à sua complexa necessidades nutricionais e a alta chance de contaminação associada com mycoplasma cultura. Para crescer com sucesso a bactéria, um ambiente de 5-10% de dióxido de carbono é necessária, e o meio ácido deve demonstrar uma mudança de cor.

Fifty-four samples were collected from growing and finishing pigs for the molecular diagnosis of enzootic porcine pneumonia. Nineteen lung fragments were obtained from pigs that showed signs of respiratory disease and 35 nasal swabs were obtained from clinically healthy pigs. For the detection of the bacterial genome in the samples, the nested PCR technique was used to amplify a fragment of 706bp. This fragment was subsequently cloned and sequenced. The sequence of obtained nucleotides was compared with six other sequences of Mycoplasma hyopneumoniae and 11 sequences of other bacteria available in the Genbank. To measure the sensitivity of the nested PCR, serial dilutions (10-1 to 10-15) of cloned fragments were conducted based on the concentration of 300ng. Ten lung fragments and eight nasal swabs showed positive for M. hyopneumoniae and the limit of detection was estimated to be 0.3fg DNA cloned. The sequence of nucleotides obtained showed 99.1% homology with the other sequences of M. hyopneumoniae, demonstrating that the nested PCR used in this study may provide an important diagnostic tool for the detection of this agent. Foram coletadas 54 amostras de animais em fase de crescimento e terminação para o diagnóstico molecular da pneumonia enzoótica suína. Dezenove fragmentos de pulmão foram obtidos de suínos que apresentavam sinais de doença respiratória e 35 suabes nasais foram obtidas de suínos clinicamente saudáveis. Para a detecção do genoma bacteriano nas amostras, foi utilizada a técnica de nested PCR que originou um fragmento de 706pb, o qual foi, posteriormente, clonado e sequenciado. A sequência de nucleotídeos obtida foi comparada com outras seis sequências de Mycoplasma hyopneumoniae e 11 sequências de outras bactérias disponíveis no Genbank. Para medir a sensibilidade da nested PCR, foram realizadas diluições seriadas (10-1 a 10-15) do fragmento clonado, partindo da concentração de 300ng. Dez fragmentos de pulmões e oito suabes nasais apresentaram resultado positivo para M. hyopneumoniae e o limite de detecção foi estimado em 0,3fg de DNA clonado. A sequência de nucleotídeos obtida foi de 99.1% de homologia com as outras sequências de M. hyopneumoniae, demonstrando que a nested PCR utilizada neste estudo pode ser uma importante ferramenta de diagnóstico para a detecção desse agente.

Mycoplasma hyopneumoniae é a bactéria causadora da pneumonia micoplásmica suína, que afeta o rebanho suíno em nível mundial. Durante o processo de infecção, o sistema imune de organismos afetados produz espécies reativas de oxigênio (ERO), conhecidas por causarem uma variedade de lesões celulares, como uma das estratégias para neutralização do patógeno. Embora a presença de enzimas antioxidantes clássicas seja esperada em M. hyopneumoniae, genes importantes relacionados à proteção contra ERO como superóxido-dismutase, catalases e glutationa-peroxidase não foram identificados por homologia na anotação de seqüências genômicas. Entre os poucos genes de M. hyopneumoniae codificando proteínas possivelmente envolvidas na supressão da resposta do hospedeiro através da produção de ERO, foi identificado um codificando uma peroxirredoxina. Análises de seqüência e filogenéticas mostram que a peroxirredoxina de M. hyopneumoniae (MhPrx) está relacionada com a subfamília das peroxirredoxinas 2-Cys atípica, embora ela tenha apenas uma cisteína em sua seqüência. A seqüência de DNA codificadora (CDS) da MhPrx foi clonada e expressa em Escherichia coli para a produção de uma MhPrx recombinante (rMhPrx), a qual foi purificada e usada para a imunização de camundongos para produzir um anti-soro policlonal anti-MhPx. Este anti-soro foi utilizado para investigar extratos protéicos de M. hyopneumoniae e demonstrou a expressão de MhPrx nas três cepas testas (J, 7422 e 7448). A atividade da rMhPrx foi determinada com uso de um sistema de oxidação catalisado por metais, que mostrou que esta enzima pode proteger moléculas de DNA do dano causado por ERO e deve ter uma função essencial durante a infecção. Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the porcine enzootic pneumonia, which affects swineherds worldwide causing heavy economical losses. In the infection process, the host generates reactive oxygen species (ROS) as one of the strategies used to neutralize the pathogen. Although the presence of classical antioxidant enzymes would be expected in M. hyopneumoniae, important genes directly related to protection against ROS, like superoxide-dismutase, catalases and glutathione-peroxidase were not identified by sequence homology in the genome sequence annotation. Among the few identified M. hyopneumoniae genes coding for proteins possibly involved with suppression of the host ROS-mediated response, one coding for a peroxiredoxin was recognized. Sequence and phylogenetic analysis indicate that M. hyopneumoniae peroxiredoxin (MhPrx) is closely related to the atypical 2-Cys peroxiredoxin subfamily, although it has only one cysteine in its sequence. The MhPrx coding DNA sequence was cloned and expressed in Escherichia coli to produce a recombinant MhPrx (rMhPrx), which was purified and used to immunize mice and produce an anti-MhPrx polyclonal antiserum. This antiserum was used to probe M. hyopneumoniae extracts and demonstrated that MhPrx is expressed in all three tested strains (J, 7422 and 7448). A metal catalyzed oxidation system was used to assay the activity of rMhPrx, showing that it can protect DNA from ROSmediated damage and may play an essential role during infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Com o objetivo de avaliar a utilização da técnica da imunoperoxidase como método auxiliar para a detecção de Mycoplasma hyopneumoniae em pulmão de suínos naturalmente infectados, foram colhidos 80 fragmentos de pulmão, sendo 40 de animais provenientes de granjas consideradas negativas e 40 de granjas com diagnóstico positivo para pneumonia enzoótica. Os resultados obtidos com a utilização de soro policlonal específico (IgG de coelho anti- M. hyopneumoniae) demonstraram uma correlação positiva de 77% entre os diagnósticos microscópicos e imunohistoquímicos, enquanto a correlação entre os diagnósticos macroscópicos e imunohistoquímicos foi inferior, equivalendo a 49%. Nas granjas negativas observou-se a presença de discreta imunorreação em 22,5% dos casos, o que poderia indicar a existência de reação cruzada com outros microrganismos. Já nas granjas com diagnóstico positivo para pneumonia enzoótica, a técnica da Peroxidase-anti- Peroxidase (PAP) revelou diferentes graus de intensidade de imunomarcação, variando de discreto até espesso depósito amarronzado no epitélio ou na luz das vias aéreas, ou ainda no interior de macrófagos, com uma relação direta entre a intensidade das lesões morfológicas e da imunomarcação. Verificou-se ainda que a técnica imunohistoquímica possui sensibilidade de 95% e especificidade de 77,5%, podendo a mesma ser recomendada como ferramenta auxiliar, rápida e de baixo custo, para o diagnóstico da pneumonia enzoótica suína em laboratórios de rotina em histopatologia. The aim of this work is to evaluate the use of the imunoperoxidase technique as a supporting method for the detection of the Mycoplasma hyopneumoniae in the lungs of naturally infected swine. For this purpose, 80 lung fragments were collected - 40 of animals from pig farms considered to be "negative" and 40 of animals from pig farms with positive diagnosis of enzootic pneumonia. The results obtained with the use of specific policlonal serum (rabbit anti M. hyopneumoniae IgG) show a positive correlation at the rate of 77% between the microscopical and imunohistochemical diagnoses, whereas correlation between macroscopical and immunohistochemical diagnoses occured at the lower rate of 49%. In the "negative" farms, discrete immunereaction was observed in 22.5% of cases, which could point to cross reaction with other microorganisms. In the other hand, in the farms with positive diagnosis for enzootic pneumonia, the peroxidase-anti-peroxidase technique (PAP) showed different grades of intensity of immunomarking. It was also observed that the immunohistochemical technique has 95% sensitivity and 77.5% specificity. This would enable this technique to be a recommendable fast and cost-effective supporting tool for the diagnosis of enzootic pneumonia in routine laboratories Histopathology.

To determine the morphological differences in the epithelium of the airways of recovered and susceptible pigs after Mycoplasma hyopneumoniae challenge, twenty-four 4-week-old M. hyopneumoniae-free pigs were intratracheally inoculated with 107ccu/ml of a pure low-passaged culture of the P5722-3 strain of M. hyopneumoniae challenge material. Eight pigs (group I) were challenged at the beginning of the experiment and rechallenged 3 months later. Group II pigs were also challenged at the beginning of the experiment and necropsied 3 months later. Group III pigs were challenged at the same time as the rechallenge of group I pigs. Eight nonchallenged pigs served as controls (group IV). Three days after the second challenge of group I and the first challenge of group III, and every 3 and 4 days thereafter, two pigs from each group were euthanatized by electrocution and necropsied. Samples of bronchi and lung tissue were examined using light and electron microscopy (SEM and TEM). Macroscopic lesions were observed in the lungs of all group III pigs (average = 4.74%) and were characterized by purple-red areas of discoloration and increased firmness affecting the cranioventral aspect of the lungs. Macroscopic lesions of pneumonia in groups I and II were minimal (less than 1%). There were no gross lesions of pneumonia in control (group IV) pigs. Microscopic lesions were characterized by hyperplasia of the peribronchial lymphoid tissue and mild neutrophilic infiltrates in alveoli. Electron microscopy showed patchy areas with loss of cilia and presence of leukocytes and mycoplasmas in bronchi of susceptible pigs (group III). The bronchial epithelium of rechallenged (group I), recovered (group II), and control (group IV) pigs was ultrastructurally similar indicating recovery of the former two groups. Although mycoplasmas were seen among cilia, a second challenge on pigs of group I did not produce another episode of the disease nor did it enhance morphological changes, suggesting that those pigs could become carriers of M. hyopneumoniae. Para determinar as diferenças morfológicas no epitélio das vias aéreas de suínos suscetíveis e recuperados da infecção por Mycoplasma hyopneumoniae, 24 leitões com 4 semanas de idade, livres de infecção por M. hyopneumoniae, foram inoculados intratraquealmente com material contendo 107ccu/ml de cultura pura da cepa P5722-3 de M. hyopneumoniae. Oito leitões (grupo I) foram inoculados no início do experimento e reinoculados 3 meses mais tarde, após apresentarem a doença e terem se recuperado. Os oito leitões do grupo II foram também inoculados no início do experimento e necropsiados 3 meses depois. Os leitões do grupo III foram inoculados ao mesmo tempo da reinoculação dos leitões do grupo I. Oito leitões não inoculados serviram como controles (grupo IV). Três dias após a reinoculação dos leitões do grupo I e a inoculação do grupo III e, a partir disso, a cada 2 dias, dois leitões de cada grupo foram sacrificados e necropsiados. Segmentos de brônquios e pulmão foram examinados em microscopia ótica e microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Lesões macroscópicas foram observadas nos pulmões de todos os leitões do grupo III (média: 4.74% da superfície) e eram caracterizadas por áreas firmes e avermelhadas nas porções cranioventrais. Lesões macroscópicas semelhantes foram mínimas em pulmões de leitões dos grupos I e II (menos de 1%) e ausentes no grupo IV. As lesões microscópicas consistiam de hiperplasia do tecido linfóide peribronquial e infiltrado neutrofílico leve nos alvéolos. Na microscopia eletrônica havia lesões focais no epitélio ciliado, caracterizadas por perda de cilios e descamação de células, e presença de leucócitos e micoplasmas nos brônquios de leitões suscetíveis (grupo III). O epitélio bronquial de leitões reinoculados (grupo I), recuperados (grupo II) e controles (grupo IV) era ultraestruturalmente similar, indicando recuperação nos primeiros dois grupos. Embora micoplasmas tenham sido observados entre cilios, uma segunda inoculação em leitões do grupo I não causou outro episódio da doença nem aumentou as alterações morfológicas nos brônquios, sugerindo que esses leitões podem se tornar portadores de micoplasmas.